guia de trabajos prÁcticos aÑo 2014
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GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS AÑO 2016
BIOLOGÍA MOLECULAR (BIOQUÍMICA)
La guía de trabajos prácticos se encuentra dividida en dos módulos:
MÓDULO 1: Introducción al laboratorio de Biología molecular – Expresión de la proteína
ferredoxina-NADP(H) reductasas de Leptospira interrogans
TP Nº 1: INTRODUCCION AL LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR-
PREPARACIÓN Y ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
TP N° 2: MINIPREPARACIONES DE ADN PLASMÍDICO POR EL MÉTODO DE LISIS
ALCALINA
TP N°3: TRANSFORMACIÓN DE LA BACTERIA Escherichia coli CON CLORURO DE
CALCIO
TP Nº 4: EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN Escherichia coli.
TP Nº 5: ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DESNATURALIZANTES DE
POLIACRILAMIDA
MÓDULO 2: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a partir de una muestra de ADN
genómico obtenido de sangre humana.
TP Nº 6: OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE SANGRE ENTERA
TP Nº 7: DETECCIÓN DEL POLIMORFISMO INSERCIÓN/DELECIÓN DEL GEN DE LA
ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA (ECA)
TP Nº 8: ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS – DISCUSIÓN DE RESULTADOS
TP Nº 9: RESOLUCIÓN DE PROBLEMAS - ENTREGA DE LOS INFORMES – ANÁLISIS Y
DISCUSIÓN
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MÓDULO 1
TP Nº 1: SEMANA DEL 28 DE MARZO
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR- PREPARACIÓN Y
ESTERILIZACIÓN DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
Uno de los objetivos de esta sesión es presentar a los alumnos de Bioquímica un laboratorio de
Biología Molecular, poniendo énfasis en los cuidados y precauciones que requiere el utilizar materiales
potencialmente peligrosos y de un costo elevado.
1) Introducción al laboratorio de Biología Molecular. Aparatos del laboratorio: descripción,
utilización, cuidados y mantenimiento. Micropipetas: utilización y cuidados.
2) Se prepararán y esterilizarán medios de cultivo que serán empleados para el crecimiento de la
bacteria Escherichia coli en los trabajos prácticos subsiguientes. Para realizar minipreparaciones de
ADN plasmídico (miniprep, TP N° 2), transformación bacteriana (TP N° 3) y expresión de proteínas
recombinantes (TP N° 4) se debe cultivar a la bacteria en un medio rico adecuado para su crecimiento.
Este medio será suplementado con un antibiótico que permitirá restringir el crecimiento sólo a aquellas
bacterias que contengan el gen de resistencia al antibiótico en cuestión y así, por ejemplo, seleccionar
las bacterias transformadas (TP N° 3) con el ADN plasmídico.
El medio de cultivo que se usa es el caldo Luria Bertani (LB) cuya composición es:
Peptona de caseína 1 %
Extracto de levadura 0,5 %
Cloruro de sodio 0,5 %
Agar-agar 2 %, en el caso del LB-agar requerido para la transformación (sólo a la cantidad que se
usará para preparar las placas).
Pesar los distintos componentes siguiendo las instrucciones del docente y a continuación se
esterilizarán los medios de cultivo en un autoclave.
3) Esterilización del material, precauciones de contaminación química y microbiológica. Precauciones
del operador. Durante el transcurso de la esterilización deberán controlar la temperatura de manera que
el autoclave se mantenga a 1,1 atmósferas de presión durante 15 minutos.
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Expresión de la proteína ferredoxina-NADP(H) reductasa de Leptospira interrogans
Introducción
La espiroqueta Leptospira interrogans es una bacteria parásito de animales y humanos que
produce la enfermedad conocida como leptospirosis. La leptospirosis es una patología muy extendida
en todo el planeta que provoca episodios similares a la gripe acompañados de lesiones en el hígado y
en los riñones, como hemorragias e ictericia. La leptospirosis también posee un gran impacto
económico en la industria agropecuaria ya que la enfermedad afecta al ganado induciendo aborto,
infertilidad, producción reducida de leche y hasta muerte. La transmisión de las leptospiras se produce
a través del contacto directo con animales infectados o por exposición a las aguas contaminadas con la
orina de los mismos.
Expresión de proteínas en Escherichia coli
Muchas proteínas de baja-abundancia pueden ser expresadas en altos niveles en Escherichia coli
(E. coli) a través del uso de vectores de expresión. Aunque se han construido muchos vectores de
expresión diferentes, todos ellos toman ventaja de los mecanismos moleculares que controlan la
transcripción y la traducción en E. coli.
Vectores de expresión con un promotor fuerte regulable
Los vectores de expresión en E. coli más comúnmente usados son construidos mediante la
ligación de un vector plasmídico básico, el cual contiene un origen de replicación (ORI) y un gen de
resistencia a antibióbico que permite su selección, a una secuencia de ADN que funciona como un
promotor fuerte regulable. Un promotor es una secuencia de ADN donde la ARN polimerasa inicia la
transcripción. En un promotor fuerte regulable, la transcripción se inicia muchas veces por minuto bajo
condiciones específicas.
Un ejemplo de este tipo de vectores de expresión contiene un fragmento clonado del cromosoma
de E. coli que incluye el promotor lac y la transcripción a partir del mismo sólo ocurre cuando se
adiciona lactosa, o un análogo de la misma como el isopropil-tiogalactósido (IPTG), al medio de
cultivo. Generalmente, se utiliza IPTG debido a que éste no puede ser metabolizado y por lo tanto, su
concentración no cambia a medida que las células crecen. Luego de la adición de IPTG, el gen de
interés que se encuentra bajo el control del promotor lac se transcribe en ARNm, el cual luego se
traduce generando muchas copias de la proteína que codifica.
Proteínas de fusión
Cuando uno intenta expresar genes en huéspedes heterólogos es frecuente encontrarse con el
hecho de que la proteína buscada se degrade, con lo que se obtienen bajos niveles de la misma. Para
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solventar este problema, uno de los “trucos” consiste en lograr proteínas híbridas, de fusión, en las que
nuestra proteína heteróloga (o la parte funcional que nos interesa) está unida covalentemente con una
proteína estable en el huésped, lo que la protege del ataque de proteasas del mismo. Para conseguir
estas proteínas de fusión, hay que hacer una construcción génica en la que unimos, en la fase de lectura
adecuada, un gen del huésped con el gen que queremos expresar.
Un ejemplo de vectores de expresión utilizados para tal fin es la serie pET-32 (a, b y c) que fue
desarrollada para clonar y expresar ADN bajo el control del promotor reconocido específicamente por
la T7 ARN polimerasa. El sistema pET usa el promotor del bacteriófago T7 para dirigir la expresión
del gen de interés. Como la ARN polimerasa de E. coli no reconoce el promotor T7, no hay
prácticamente transcripción del gen de interés en ausencia de una fuente de la T7 ARN polimerasa. De
esta forma se evita la transcripción basal que ocurre en sistemas basados en promotores de E. coli (lac,
tac) y que dificulta la expresión de proteínas que resultan tóxicas para la célula huésped. Para la
expresión del gen en estudio, la célula huésped debe poseer el gen que codifica para la T7 ARN
polimerasa. Se utiliza generalmente la cepa de E. coli BL21(DE3)pLysS que posee: (1) el gen de la T7
ARN polimerasa (lisógeno λDE3) que está bajo el control del promotor lacUV5 inducible con IPTG;
(2) el gen que codifica para la T7 lisozima (plásmido pLys) el cual es un inhibidor natural de la T7
ARN polimerasa y reduce así la habilidad de transcribir el gen de interés en células no inducidas. La
serie pET-32 posee una versión mejorada del promotor T7 que es el promotor T7lac que posee además
una secuencia a la cual se une el represor Lac, reduciendo efectivamente la transcripción basal de la T7
ARN polimerasa en células no inducidas, proveyendo así un segundo sistema de control de la
expresión de dicho gen. Los plásmidos como el pET-32 que tienen este promotor T7lac también
poseen una copia del gen lacI para asegurar que haya suficiente cantidad de represor. Además esta
cepa tiene la ventaja de ser deficiente en las proteasas Lon y OmpT.
Cuando un cultivo de células BL21(DE3)pLys está creciendo en ausencia de IPTG, no hay
expresión del gen de interés ya que el represor lac se encuentra unido al promotor del gen que codifica
para la T7 ARN polimerasa. Existe una expresión basal de la T7 ARN polimerasa pero la presencia en
la célula huésped de la T7 lisozima hace que la misma sea inactiva. Existe además un segundo
mecanismo de control ya que el represor Lac se encuentra también unido al promotor T7lac que
controla la expresión del gen de interés. Cuando a este cultivo se le agrega IPTG, esta molécula se une
al represor Lac y éste deja de reprimir la expresión de la T7 ARN polimerasa con lo cual se empieza a
expresar la proteína de fusión (figura 1).
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El vector pET-BM es un derivado del vector pET-32b en el que se ha modificado el sitio de
múltiple clonado. Estos vectores poseen: (1) el promotor T7/lac que es un promotor fuerte inducible
por IPTG ;(2) una secuencia codificante para la proteína tiorredoxina de E. coli (trxA); (3) un sitio de
múltiple clonado; (4) el gen bla que confiere resistencia a ampicilina, el cual permite la selección del
plásmido; (5) un origen de replicación en E. coli (ori); (6) el gen lacI que codifica para el represor Lac;
(7) los sitios de reconocimiento para la proteasa sitio-específica trombina y enteroquinasa entre los
dominios de la trxA y la proteína recombinante; (8) una cola de poli-histidina en el N y C terminal y
(9) el terminador transcripcional T7. En la Figura 2 se muestra la estructura del plásmido pET-BM con
su correspondiente sitio de múltiple clonado. En el clonado del gen de la ferredoxina-NADP(H)
reductasa de L. interrogans (LepFNR) se introdujo la secuencia codificante en el sitio PstI del vector
pET-BM, generando el plásmido pET-BM-LepFNR capaz de expresar la proteína de fusión TrxA-
LepFNR.
La expresión en E. coli de la proteína heteróloga fusionada a 6 residuos de histidina permite
simplificar el protocolo de purificación ya que la proteína puede ser purificada bajo condiciones no-
desnaturalizantes mediante cromatografía de afinidad utilizando una matriz que contenga Ni
Figura 1. Elementos de control del sistema pET.
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inmovilizado. A su vez, el sitio de reconocimiento para proteasa permite que la TrxA pueda ser
removida de la proteína de interés luego de su purificación.
Objetivos
En el presente módulo práctico se prepararán extractos totales de células de E. coli de la cepa
BL21(DE3)pLys transformadas con el plásmido pET-BM, que expresa la proteína TrxA (PM = 11,7
kDa), y con el plásmido pET-BM-LepFNR que expresa la proteína ferredoxina-NADP(H) reductasa de
L. interrogans como fusión a TrxA (TrxA-LepFNR, PM = 60 kDa), sin inducir e inducidas con IPTG
0.5 mM. Para ello se procederá a la purificación de ambos plásmidos (Minipreparación de ADN
plasmídico) a partir de cepas bacterianas adecuadas para mantener los plásmidos (recA-) como ser
JM109, TOP10, etc. Con estos plásmidos purificados se transformará la cepa BL21(DE3)pLys,
adecuada para la expresión de las proteínas. Posteriormente se obtendrán extractos proteicos totales de
las cepas transformadas y se realizará la separación de las proteínas en un SDS-PAGE al 12 %, en el
que se analizará el patrón de bandas obtenido en cada caso.
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A
B
Figura 2. Representación esquemática del vector pET-BM (A) con la región de clonado y expresión
de la hebra codificante (B).
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TP N° 2: SEMANA DEL 4 DE ABRIL
MINIPREPARACIONES DE ADN PLASMÍDICO POR EL MÉTODO DE LISIS ALCALINA
Introducción
Varios métodos se han desarrollado para purificar plásmidos a partir de bacterias. Estos métodos
involucran invariablemente tres pasos:
1) Crecimiento del cultivo bacteriano: generado a partir de la inoculación de una única colonia aislada
a partir de una placa con medio de cultivo sólido.
2) Recuperación y lisis de las bacterias: la recuperación bacteriana es llevada a cabo por centrifugación
y la lisis por algún método (tratamiento con detergentes iónicos o no iónicos, solventes orgánicos,
álcalis o calor) cuya elección dependerá de tres factores:
El tamaño del plásmido
La cepa bacteriana
La técnica de purificación que se utilizará a continuación
3) Purificación del ADN plasmídico: se basa en dos características propias del ADN plasmídico (a
diferencia de otros ácidos nucleicos como el ADN genómico y/o los ARNs):
Su tamaño relativamente pequeño
Su estructura covalentemente cerrada
I) Minipreparación de ADN plasmídico por lisis alcalina con SDS
La lisis alcalina en combinación con el detergente SDS ha sido utilizada por más de 20 años para
la purificación de dichas moléculas. Existen tres protocolos adaptados a esta técnica dependiendo del
volumen de cultivo inicial.
i. Minipreparación: 1-2 ml
ii. Midipreparación: 10 ml
iii. Maxipreparación: 500 ml
Cada grupo realizará dos minipreparaciones: una a partir de un cultivo de JM109 pET-BM y la otra a
partir de un cultivo de JM109 pET-BM-LepFNR.
PROTOCOLO
Día previo: inocular una colonia aislada en tubos de 3 ml de caldo LB con Ampicilina e incubar
toda la noche a 37ºC con agitación.
Centrifugar las células 2 min a 5000 rpm y descartar el sobrenadante (Este paso será realizado por
los auxiliares).
Agregar 100 μl de lisógeno I y resuspender completamente. Incubar 5 min a T.A.
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Agregar 200 μl de lisógeno II (preparar fresco a partir de hidróxido de sodio 1N y SDS 10 %),
mezclar por inversión suave e incubar exactamente 5 min en hielo.
Agregar 150 μl de lisógeno III, mezclar por inversión suave e incubar 5 min en hielo.
Centrifugar 10 min a 12000 rpm. Tomar el sobrenadante y pasarlo a tubo de microcentrífuga nuevo
(CUIDADO de no arrastrar nada del pellet blanco).
Agregar 400 μl de cloroformo y agitar con la tapa bien cerrada (CON CUIDADO)
Centrifugar 5 min a 12000 rpm y pasar la fase superior INCOLORA (CUIDADO de no tomar la
interfase proteica) a tubo de microcentrífuga limpio.
Repetir la extracción con cloroformo. Centrifugar y pasar fase superior a tubo limpio.
Agregar 2,5 vol. de etanol absoluto helado e incubar 15 min en hielo (o freezer).
Centrifugar 20 min a 12000 rpm, en frío. Eliminar el sobrenadante (CUIDADO el pellet puede ser
muy traslúcido).
Lavar con etanol 70 %. Centrifugar 5 min a 12000 rpm, en frío. Repetir el lavado con etanol 70 %.
Descartar el sobrenadante lo mejor posible y secar el pellet en la estufa de 37ºC.
Resuspender el pellet en 25 μl de agua miliQ-0,1 mg/ ml ARNasa. Incubar 20-30 min a 37ºC para
que se digiera el ARN. Guardar a –20°C.
LISÓGENOS.
Lisógeno I
50 mM glucosa
10 mM EDTA
25 MM Tris-HCl pH 8,0
LisógenoII
0,2 N NaOH
1 % (p/v) SDS
Lisógeno III
3 M acetato de K pH 5,8
II) Observación y análisis del ADN plasmídico en gel de agarosa
Se presenta un protocolo general de preparación de geles de agarosa. La concentración de
agarosa en los geles dependerá de los tamaños de fragmentos que se deseen resolver. Para la
visualización del ADN se utilizará el colorante fluorescente bromuro de etidio: éste contiene un
grupo planar que se intercala entre las bases del ADN y cuando se irradia con luz ultravioleta emite
en la región roja-naranja del espectro visible, siendo la fluorescencia del colorante unido al ADN
mayor que la del colorante libre.
Armado de geles de agarosa
Pesar la cantidad que corresponda de agarosa (se utilizara agarosa al 1 %) y disolver en
tampón TAE (40 mM Tris-acetato pH 7.5, 1mM EDTA) calentando en microondas 1 min en
posición “media baja”, hasta observar que la agarosa se disolvió completamente.
Dejarla enfriar hasta que se pueda tocar el recipiente con la mano y luego agregarle el
bromuro de etidio a concentración final de 0,3 g/ml. Volcar la solución en el soporte de acrílico
armado como se muestra en la figura 3. Evitar la formación de burbujas. Esperar hasta que
endurezca completamente antes de usar.
¡El Bromuro de Etidio es un potente mutágeno, manejar todas las soluciones que lo
contengan, con guantes!
Retirar cuidadosamente el peine
Colocar el gel dentro de la cuba de electroforesis y cubrirlo con TAE 1X.
Agregar a las muestras buffer de siembra (5 % glicerol; 0,025 % azul de bromofenol; 0,025 %
xylene cyanol).
Cargar la muestra con una micropipeta y descargarla lentamente en uno de los pocillos del
gel, apoyando el tip en uno de los bordes del mismo. Sembrar las muestras incluyendo un marcador
de peso molecular: 5 μl de cada miniprep junto con un marcador de peso molecular (λ/HindIII) de
cantidad conocida.
Conectar la fuente teniendo cuidado de que el polo positivo esté en el lado opuesto al sitio de
siembra. Correr en tampón TAE a 75 mA por aproximadamente 2 hs.
Figura 3: Ilustración extraída de Sambrook J, Fritsch EF y Maniatis T (1989) Molecular Cloning. A
laboratory Manual (2ª Ed., Cold Spring Harbor Lab.)
Para visualizar la migración electroforética del ADN, apagar la fuente y colocar el gel sobre un
transiluminador ultravioleta. En la figura 4 se muestra como se observa el ADN en geles de agarosa
teñidos con bromuro de etidio.
¡Observar manteniendo los ojos protegidos de la radiación UV en todo momento!
Con una banda del marcador de peso molecular se estimará la concentración de ADN plasmídico
obtenido:
10 μg de λ/HindIII:
PM μg
23130 4,77
9416 1,94
6557 1,35
4361 0,90
2322 0,48
2027 0,42
564 0,12
125 0,03
Figura 4: Electroforesis en geles de
agarosa. En la calle 1 se sembró el
marcador de peso molecular
/HindIII, en la calle 2 el plásmido
pflx, en las calle 3 y 4 el mismo
plásmido pero digerido con BamHI o
SalI, respectivamente.
1 2 3 4
23,13 kpb 9416 pb 6557 pb 4361 pb
2322 pb 2027 pb
564 pb
TP Nº 3: SEMANA DEL 11 DE ABRIL
TRANSFORMACIÓN DE LA BACTERIA Escherichia coli CON CLORURO DE CALCIO
Se denomina transformación a la captación de ADN desnudo libre del medio por una célula
(bacteria, levadura, célula vegetal, etc) y transfección cuando la célula es de origen animal. En
bacterias existen tres mecanismos principales para incorporar o intercambiar material genético:
conjugación, transducción y TRANSFORMACIÓN. Este último fenómeno fue descubierto por
Fred Griffith en 1928 aunque recién 16 años más tarde, Avery, Macleod y McCarty descubrieron
que la molécula responsable era el ADN. El fenómeno de transformación requiere que la bacteria
sea (o pueda ser) naturalmente competente para tomar el ADN del medio, sin embargo a través de
una serie de manipulaciones físicas se la puede convertir artificialmente en competentes. Este es el
caso de bacterias como Escherichia coli y Salmonella, las cuales al no ser naturalmente
transformables las podemos hacer competentes por dos métodos principales (bacterias en fase de
crecimiento exponencial):
Electroporación: se realiza un shock eléctrico a las células en cultivo de manera que la célula se
despolarice y permita la entrada del ADN.
Método químico: en este método se realiza un shock térmico de 0 a 42°C en presencia de un
catión divalente (Ca2+). De esta manera la membrana plasmática se desestabiliza y el ADN puede
ingresar a la célula con la ayuda del apantallamiento de las cargas negativas del ADN y del LPS
(lipopolisacárido) por parte del catión divalente.
1. Preparación de células competentes
Inocular el día previo 1 colonia de E. coli BL21(DE3)pLys, aislada a partir de una placa de Petri
con medio LB-agar-cloramfenicol, en 2 ml de caldo LB suplementado con cloramfenicol 20 µg/ml.
Crecer hasta D.O.= 1 a 37C y congelar con glicerol (Cf = 20%) a -80C (Lo efectúa personal del
Área)
Hacer un inóculo de esa suspensión en una proporción 1/10, en frascos conteniendo 10 ml de
caldo LB suplementado con cloramfenicol 20 µg/ml. Se trabaja con dos frascos por comisión.
Crecer a 37C hasta D.O.= 0,3 (≈ 1 h.)
Se necesita 1 ml de cultivo para cada transformación y cada grupo realizará tres.
Fraccionar en alícuotas de 1,5 ml en tubos de microcentrífuga estériles y centrifugar (2 min a
5000 rpm). Sacar muy bien el sobrenadante.
Resuspender las células en 0,5 ml de CaCl2 0,1 M previamente enfriado y mantener en hielo.
Centrifugar 2 min a 5000 rpm y descartar el sobrenadante.
2. Transformación
Resuspender las células en 100 µl de CaCl2 0,1 M y agregar el ADN:
Cada grupo realizará tres transformaciones: dos con cantidades diferentes de ADN plasmídico (10
μl de una dilución 1/40 y 5 μl de una dilución 1/40) y una sin ADN (control negativo). Dos grupos
usarán el plásmido pET-BM y dos el plásmido pET-BM-LepFNR.
Incubar 30 min en hielo.
Mientras dura la incubación preparar un baño a 42C y las placas de Petri con el medio sólido.
Todos los grupos prepararán 3 placas con LB-agar suplementado con 0,1 mg/ml ampicilina y 20
µg/ml cloramfenicol. Para preparar esto, fundir el LB-agar, dejar enfriar hasta 45C, agregar los
antibióticos y cargar 15 ml por placa, inmediatamente. Estas placas pueden guardarse a 4C durante
1 semana.
Incubar las células 60-90 seg a 42C.
Poner las células nuevamente en hielo e inmediatamente agregar 0,9 ml de LB. Incubar 45 min a
37C.
Tomar 100 µl del medio y sembrar sobre el LB-agar. Distribuir utilizando espátula de Drygalski
flameada en alcohol.
Colocar las placas de Petri en estufa a 37C durante una noche. Las placas serán analizadas
durante la sesión siguiente, haciendo el recuento de las colonias bacterianas para calcular la
eficiencia de éste método de transformación.
Después de por lo menos 12 hs. de crecimiento se visualiza en las placas de Petri la aparición de
colonias bacterianas.
La eficiencia de transformación se calcula de la siguiente forma:
Ef. Transf.= UFC/ μg ADN
UFC= Unidades formadoras de colonias
TP Nº 4: SEMANA DEL 18 DE ABRIL
EXPRESIÓN DE LAS PROTEÍNAS RECOMBINANTES EN Escherichia coli.
Inocular el día previo 1 colonia de E. coli BL21(DE3)pLys transformadas con el plásmido pET-
BM ó con el plásmido pET-BM-LepFNR, aislada a partir de una placa de Petri, en 2 ml de caldo
LB suplementado con ampicilina (100 μg/ml) y cloramfenicol (20 µg/ml). Crecer durante la noche a
37°C con agitación (lo efectúa personal del Área). Alternativamente se usará un stock de cultivo
bacteriano de DO=1 guardado con glicerol a -20°C.
Inocular …… μl de los cultivos en frascos de 10 ml de LB-ampicilina-cloramfenicol.
Incubar …… h a 37°C con agitación (hasta DO aproximada de 0,4). De cada frasco, tomar dos
muestras de 0,5 y 1 ml de células en condiciones de esterilidad y conservar en hielo (muestra t = 0
h) y agregar IPTG a los frascos de cultivo que serán inducidos (concentración final 0,5 mM).
Incubar 1,5 hs a 37°C y tomar otras dos muestras de 0,5 y 1 ml de células de cada cultivo
(muestra t = 1,5 hs).
Centrifugar las muestras de 0,5 ml de cada uno de los tiempos (t = 0 y t = 1,5) en
microcentrífuga 5 min a 5000 rpm y descartar el sobrenadante. Guardar a -20°C.
Medir densidad óptica (DO) a 600 nm de los otros dos tubos remanentes (1 ml) (t = 0 y t = 1,5)
para calcular el volumen de buffer de siembra 1X que se utilizará para resuspender las células en el
siguiente trabajo práctico.
TP Nº 5: SEMANA DEL 25 DE ABRIL
ELECTROFORESIS DE PROTEÍNAS EN GELES DESNATURALIZANTES DE
POLIACRILAMIDA
INTRODUCCIÓN – ASPECTOS TEÓRICOS.
Separación de proteínas utilizando geles de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE)
En las proteínas, distintas moléculas de igual tamaño (PM) tienen formas distintas dadas por
la conformación más estable para cada secuencia aminoacídica particular. Por otro lado, la carga (y
por consiguiente, el cociente carga/masa) varía mucho de una proteína a otra. Para estandarizar la
forma y las condiciones de todas las proteínas se utiliza un detergente cargado negativamente, el
dodecilsulfato de sodio (SDS). Este detergente desnaturaliza las proteínas y las recubre de manera
proporcional a su tamaño, otorgándoles un gran número de cargas negativas que hacen que las
moléculas migren hacia el polo positivo de forma inversamente proporcional al logaritmo de su
peso molecular (Figura 3). Por esta razón, a través de una corrida electroforética es posible estimar
el peso molecular de una proteína dada utilizando marcadores de peso molecular conocido.
Figura 3. Representación esquemática del
fundamento de la electroforesis en un
SDS-PAGE
Preparación del gel de poliacrilamida-SDS.
En la figura 4 se muestran los pasos a seguir en la preparación del gel de poliacrilamida-SDS.
Es común que la electroforesis se realice con 2 tipos de geles, un gel concentrador (de poros
grandes) y un gel separador (de poros pequeños). La separación ocurre en el gel separador, donde la
migración está determinada por la carga y el tamaño molecular de las partículas. Encima de este gel
se sitúa el gel concentrador, generalmente de una menor altura (1/3 del gel separador), en el que la
muestra se concentra en una zona muy estrecha, lo que determina la separación en bandas finas en
el gel separador y alto poder de resolución
Cantidades requeridas para la preparación de 1 gel
Gel de separación 15 %
(5 ml)
Gel de concentración 5 %
(2,5 ml)
H2O destilada 1,15 ml 1,7 ml
Acrilamida/Bis-acrilamida (30:0,8) 2,5 ml 0,415 ml
Tris-HCl 1,5 M pH 8,8 1,25 ml -
Tris-HCl 1 M pH 6,8 - 0,315 ml
SDS 10 % 50 μl 25 μl
APS* 10 % 50 μl 25 μl
TEMED** 2 μl 2,5 μl
*APS: persulfato de amonio
**TEMED: N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamina
Procedimiento para la preparación y siembra de las muestras:
Descongelar las células y resuspenderlas en el volumen de buffer de siembra 1X calculado de
acuerdo a la DO de la siguiente manera, para un pellet proveniente de 1 mL de cultivo:
μl buffer de siembra 1X=(100 x DO)
Hervir las muestras durante 5 min.
Sembrar 15 μl de cada muestra en el gel de poliacrilamida-SDS y realizar la corrida
electroforética a 30 mA. Agregar también un marcador de peso molecular. Detener la corrida
cuando empiece a salir el colorante que migra al frente.
Luego de la corrida electroforética sumergir el gel en solución fijadora y posteriormente
incubarlo en solución de teñido durante 30 min. Desteñir el gel por ebullición en agua durante 10-
15 minutos o con solución decolorante hasta observar el patrón de bandas correspondiente.
REACTIVOS Y SOLUCIONES.
Buffer de siembra 1X
10 % (v/v) glicerol
50 mM Tris-HCl pH 6,8
2 % (p/v) SDS
0,1 % (p/v) azul de bromofenol
1 % (v/v) β-mercaptoetanol
1 mM EDTA
Buffer de corrida 10X
Para 1 litro:
30 g Tris base
144 g glicina
10 g SDS
Solución fijadora
10 % ácido acético
Solución de teñido
0,05 % (v/v) Coomassie Brilliant Blue R-250
50 % metanol
10 % ácido acético
Solución decolorante
40 % metanol
10 % ácido acético
MÓDULO 2
TP N° 6: SEMANA DEL 2 DE MAYO
OBTENCIÓN DE ADN GENÓMICO A PARTIR DE SANGRE ENTERA
Introducción
Las técnicas para extraer muestras de ADN para reacciones de PCR (Reacción en cadena de la
polimerasa), deben asegurar buena calidad (integridad y pureza) del producto final, permitiendo
recuperar la mayor cantidad de ADN libre de proteínas e inhibidores enzimáticos. Existen distintos
métodos para extraer ADN, dependiendo de su origen (sangre, biopsias, cultivos celulares,
necropsias, etc.) y de la clase de reacción de PCR a realizar.
Para sangre entera, se debe realizar la eliminación por lisis de células no nucleadas, lisis de las
membranas celulares de las células nucleadas, eliminación de las proteínas nucleares y recuperación
del ADN. Como control de calidad de la extracción puede utilizarse electroforesis en gel de agarosa
(0.7-1 % p/v) con bromuro de etidio y/o lecturas espectrofotométricas (260 y 280 nm).
MUESTRA: Sangre entera obtenida con anticoagulante EDTA (1 mg/ml).
IMPORTANTE
En todos los casos se han aprobado los análisis requeridos para que las muestras de sangre sean
aptas para transfusión. Sin embargo, y dado que se trata de muestras de sangre humana, deben
utilizarse todas las precauciones y condiciones de seguridad indicadas para el manejo de material
biológico humano.
Transferir 450 l de sangre a un tubo de microcentrífuga estéril de 1,5 ml.
Agregar 900 l de solución de lisis (TE). Enjuagar varias veces el tip. Invertir suavemente 5-
6 veces para mezclar. No agitar.
Incubar 10 min a T.A. Invertir 2-3 veces durante la incubación para lisar los glóbulos rojos
(GR). Centrifugar 20 seg a 13000 rpm a T.A.
Remover y descartar tanto sobrenadante como sea posible, sin tocar el pellet. Opcional: si
sólo se ven GR, adicionar 300 l de solución de lisis y repetir los pasos 3 y 4.
Resuspender totalmente los GB en el pequeño volumen residual.
Agregar 400 l de solución de lisis nuclear al tubo conteniendo las células resuspendidas.
Pipetear 5-6 veces la solución para lisar los GB. Incubar 1 h a 37ºC. Durante la incubación, invertir
el tubo 2-3 veces para favorecer la disolución de los grumos. Si éstos son todavía visibles luego de
la incubación, agregar 100 l adicionales de solución de lisis nuclear y volver a incubar.
Agregar 200 l de solución de precipitación de proteínas al lisado nuclear y agitar 10-20
segundos.
Centrifugar a 13000 rpm 3 min a T.A. Debería verse un precipitado marrón.
Transferir el SN a un tubo limpio conteniendo 300 l de isopropanol.
Mezclar suavemente la solución por inversión (30-40 veces), hasta que el ADN aparezca
como una masa visible.
Centrifugar a 13000 rpm 2 min a T.A. Debería verse un pequeño pellet blanco de ADN.
Descartar el SN y agregar 300 l de etanol 70 % a T.A. Invertir el tubo suavemente varias
veces para lavar el pellet de ADN. Centrifugar 3 min a 13000 rpm a T.A.
Aspirar cuidadosamente el etanol y secar en estufa a 37ºC (aprox. 20-30 min).
Agregar 50 l de H2O MQ estéril y rehidratar incubando toda la noche a T.A. Luego
congelar a -20º C.
En el siguiente práctico se evaluará la integridad del ADN obtenido por electroforesis en geles
de agarosa al 0.8 % seguido de tinción con bromuro de etidio.
Referencia: Kirby, Lorne T. (1992). DNA Fingerprinting. Cap. 5: 51-74
SOLUCIONES:
- Solución de Lisis (TE): 10 mM TRIS-HCl - 1 mM EDTA, pH = 8.0
- Solución de lisis nuclear (SLN): buffer TE + 1 % SDS + 0,1 mg/ml de proteinasa K (solución
stock: 10 mg/ml)
- Solución de precipitación de proteínas (SPP): Solución sobresaturada de NaCl 6M.
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T P N°7: SEMANA DEL 9 DE MAYO
AMPLIFICACIÓN DEL GEN DE LA ENZIMA CONVERTIDORA DE ANGIOTENSINA
HUMANA
INTRODUCCIÓN
Reacción en cadena de la polimerasa
La Reacción en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en inglés
(Polymerase Chain Reaction), es una técnica de biología molecular descripta en 1985 por Kary Mullis,
cuyo objetivo es obtener un gran número de copias de un fragmento particular de ADN, partiendo de
cantidades muy pequeñas, en teoría, una única molécula de ADN molde.
Ésta técnica se ha convertido en una herramienta muy útil, si no imprescindible, para el análisis de
filiación o de criminalística forense, ya que con sólo una pequeñísima muestra se pueden realizar
diferentes estudios comparativos que nos permiten conocer el dueño de un “rastro” genético en
particular. También se usa para el desarrollo de nuevas estrategias de diagnóstico médico, como la
detección de virus o de mutaciones que provocan enfermedades genéticas, a partir de una muestra de
ADN tan pequeña como un cabello o una gota de sangre.
La PCR se basa en la separación de ambas hebras de ADN por aumento de temperatura, la
posterior unión de cebadores (primers) y la extensión de estos fragmentos usando de molde el ADN de
la muestra. Inicialmente la técnica era lenta, ya que la mayor parte de las polimerasas comunes se
desnaturalizan al realizar los cambios de temperatura, siendo necesario agregar polimerasa en cada
ciclo. El hallazgo de ADN polimerasas termoestables, extraídas de microorganismos termófilos
(adaptados a vivir a altas temperaturas), permitió la automatización de la técnica y el desarrollo de
termocicladores.
Otra aplicación de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa es la denominada RT-PCR,
que permite la amplificación de ARN. Mediante el uso de una enzima de origen viral denominada
transcriptasa reversa (RT) puede usarse como molde una molécula de ARNm, transcribirla a una
secuencia de ADN, y luego ser amplificada como cualquier otra secuencia por la reacción en cadena
Organismos termófilos utilizados:
Thermus aquaticus (polimerasa Taq)
Pyrococcus furiosus (Pfu)
Thermococcus litoralis (Vent)
Thermus termophilus (Tth).
El bioquímico
estadounidense Kary Mullis
fue galardonado con el
Premio Nobel de Química en
1993. Mullis desarrolló la
reacción en cadena de la
polimerasa.
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de la polimerasa (PCR), con lo que se obtiene una gran cantidad de ADN a partir de unas pocas
moléculas de ARNm. Esta técnica es muy empleada para el estudio de expresión génica, así como para
la producción de proteínas en diferentes organismos.
Detección del polimorfismo Inserción/Deleción del gen de la Enzima convertidora de
Angiotensina (ECA)
El sistema renina-angiotensina es sumamente importante en la regulación hemodinámica, así
como en la de líquido y electrolitos. Todas aquellas condiciones que disminuyen el volumen
sanguíneo, la disminución de la presión de perfusión renal o la concentración plasmática de sodio
activan el sistema, mientras que aquéllas que los aumentan, lo suprimen. La renina se forma
principalmente en las células yuxtaglomerulares del riñón y cuando es liberada al torrente sanguíneo
convierte el angiotensinógeno en angiotensina I, que no tiene ningún tipo de actividad fisiológica. En
el endotelio sanguíneo dentro de algunos órganos la angiotensina I es convertida posteriormente en su
forma activa, angiotensina II, gracias a la enzima convertidora de angiotensina (ECA). La
angiotensina II es capaz de actuar sobre diferentes blancos siendo el aumento de la presión arterial y el
volumen extracelular los resultantes principales de su accionar.
La enzima convertidora de angiotensina (ECA) es una serinproteasa, cuyo gen está localizado en
el cromosoma 17. Se han identificado numerosas variantes moleculares para este gen, pero la más
estudiada es la inserción (I) o delección (D) de una secuencia Alu de 287 pb en el intron 16. Hay
trabajos que encontraron que la portación del alelo D podría asociarse a un aumento de los niveles de
ECA considerándose un factor de riesgo para afecciones cardiovasculares, como el infarto de
miocardio, la hipertensión y la enfermedad cerebrovascular.
.
Cebadores a utilizar: (Rigat et al, 1992)
ANG-F: 5' CTGGAGACCACTCCCATCC1TTCT 3'
ANG-R: 5' GATGTGGCCATCACATTCGTCAGAT 3'
Productos: Genotipo Del = 190bp. Genotipo Ins = 490bp
Condiciones de reacción
Se utilizarán ADN genómicos de glóbulos blancos de sangre aislados durante el TP. N° 6.
Luego de desnaturalizar el ADN incubando a 94°C durante 5 min, se desarrollarán 30 ciclos de
amplificación según el siguiente protocolo:
45 seg 94°C
45 seg 58°C
45 seg 72°C
Finalizando la reacción con 5 min de extensión final a 72 °C.
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Condiciones de reacción para las PCR:
- Volumen final: 25 l (llevar con agua estéril calidad miliQ)
- cebadores: 10 picomoles de cada uno.
- dNTPs: 400 M
- MgCl2: 1.5 mM
- ADN: 2 l de una dilución 1/10 de ADN genómico control y muestra incógnita (provisto por el
laboratorio)
- Buffer de reacción 1X: 10 mM Tris-HCl pH 8.8; 50 mM KCl; 0.8 % (v/v) Nonidet P-40.
-ADN polimerasa Taq: 1 U
TP Nº 8: SEMANA DEL 16 DE MAYO
ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS – DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Se ensayarán las electroforesis en diferentes geles de agarosa (Ver TP Nº 2)
I) gel de agarosa 0,8 % que resuelve fragmentos grandes de ADN (usar peine con al menos 10
calles) para visualizar el ADN genómico obtenido por todos los grupos.
II) gel de agarosa al 2 % (que resuelve fragmentos de ADN de 3 a 0,1 Kb) para observar los
productos de la PCR del TP Nº 7 (usar el peine de más de 20 calles).
Sembrar las muestras incluyendo un marcador de peso molecular: 10 μl de c/u de los productos de
PCR o 5 μl del ADN genómico.
Correr el gel a 65 mA hasta que el colorante supere 3/4 de la longitud del gel.
TP Nº 9: SEMANA DEL 23 DE MAYO
ENTREGA DE LOS INFORMES – ANÁLISIS Y DISCUSIÓN – RESOLUCIÓN DE
PROBLEMAS