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GUIA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
MODULO I: MICROBIOLOGÍA GENERAL
LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS
ALIMENTOS
AUTORES
Prof. Dra Marta Mollerach
Bioq. Farm. Verónica Pioli
Lic. Cecilia Sorhouet
Bioq. Pamela Valva
Bioq. Carlos García
Bioq. Barbara Ghiglione
Lic. Daniela Cejas
Bioq. Cintia Jozefkowicz
Bioq. Daniela Adragna
Bioq. Silvina Fernandez
MICROBIOLOGÍA DE LOS ALIMENTOS
MODULO I: MICROBIOLOGÍA GENERAL
LICENCIATURA EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA DE LOS
ALIMENTOS
TRABAJO PRÁCTICO 1
OPERACIONES BÁSICAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
(PARTE 1)
Objetivos
Adquirir nociones sobre el manejo general del laboratorio de microbiología, técnica
aséptica y los criterios de bioseguridad elementales.
Realizar la observación macro y microscópica de cultivos de bacterias y aprender a
describir colonias.
Comprender la utilidad de las diferentes tinciones que pueden utilizarse en el estudio
microscópico de los microorganismos
Aprender a realizar tinciones y aislamientos por agotamiento en superficie.
Introducción
Como primera aproximación al estudio de los microorganismos se observarán y
registraran las características culturales de algunos de ellos, entendiéndose por las mismas,
los parámetros macroscópicos relacionados con el crecimiento que los distintos
microorganismos presentan en un determinado medio de cultivo. En el caso de los medios
sólidos se observará el color, tamaño y la forma de las colonias que han desarrollado.
Microscópicamente una muestra de microorganismos puede examinarse
directamente por contraste de fases o por campo oscuro. Este examen en fresco es esencial
para observar los microorganismos vivos permitiendo conocer características tales como
forma, tamaño y agrupamiento evitando los artefactos que pueden ocasionar la fijación y la
tinción. Además en este caso, al encontrarse los microorganismos viables, se los puede
observar en movimiento. Al utilizar microscopía de campo claro es deseable que las
células estén teñidas dado que en este caso las células se verían prácticamente
transparentes. Para realizar una tinción se prepara un extendido en un portaobjetos, se fija y
finalmente se colorea.
De acuerdo a los colorantes utilizados, se clasifica a las tinciones en:
Simples: Utilizan un solo colorante que tiñe a todas las células.
Diferenciales: Utilizan más de un colorante y permiten obtener información
adicional. Por ejemplo, la tinción Gram brinda información sobre la composición de la
pared.
Para trabajar adecuadamente en el laboratorio de microbiología es importante
considerar que allí como en otros ambientes hay presentes microorganismos suspendidos
en el aire y depositados en distintas superficies. Por este motivo el operador deberá evitar
que estos microorganismos contaminen los materiales con los que está trabajando. A ésta
práctica mediante la cual se logra mantener a los microorganismos no deseados fuera de
las muestras de trabajo se la denomina técnica aséptica. Cuando realice las siembras en
caldo y en medios sólidos deberá aplicar esta técnica.
DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO
PRIMER DÍA
1- Tomar conciencia de la cuestión BIOSEGURIDAD
Tener en cuenta las pautas de trabajo y normas de bioseguridad explicadas por
los docentes antes del desarrollo del trabajo práctico (no comer ni beber ni fumar en el
laboratorio, usar guardapolvo, tener el pelo recogido, no dejar cosas sobre la mesada de
trabajo, desinfectar las mesadas antes y después de trabajar, lavarse las manos –ver
anexo-).
2- Observación macroscópica de bacterias y levaduras
Se dispondrá de aislamientos en TSA de los siguientes microorganismos:
Escherichia coli
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Bacillus subtilis
Sacchromyces cerevisiae (levadura)
A partir de los distintos cultivos disponibles en placas de Petri realizar la observación
macroscópica de los mismos, registrando las características de las diferentes colonias y el
medio de cultivo que se ha utilizado.
Como guía para describir las colonias podrá utilizar los siguientes términos
Forma: puntiforme, circular, irregular
Tamaño: grande (aprox 5mm), mediana (2-3 mm), pequeña (1-2 mm)
Superficie: lisa, rugosa
Aspecto: mucosa, seca, opaca, brillante, etc
Color: blanco, amarillo, cremoso, rosa, verde-azulado, transparente, etc
3- Siembra de medios de cultivo sólidos
Elija alguno de los cultivos que ha descripto en la parte anterior y siguiendo las
indicaciones de su ayudante realice un aislamiento por agotamiento de superficie en una
placa de Petri conteniendo agar Tripteína Soja (TSA). Rotule previamente el material que
utilizará.
4- Siembra en medio de cultivo líquido: (por mesada)
Elija alguno de los cultivos que ha descripto en el punto 2 y siguiendo las
indicaciones de su ayudante siembre un caldo nutritivo por mesada. Rotule previamente el
material que utilizará.
Discuta con su ayudante en qué situaciones conviene realizar uno u otro tipo de
cultivo.
5- Observación microscópica:
En el laboratorio estarán distribuidos extendidos de los microorganismos del punto
2 teñidos con la tinción de Gram.
Observe al microscopio cada uno de los extendidos y describa su forma y
característica tintorial según la tinción de Gram (Gram positivo o Gram negativo).
También observará coloraciones de hongos levaduriformes. Compare el tamaño de estos
organismos con el de las bacterias
SEGUNDO DIA
1- Observación macroscópica de cultivos que Usted sembró el día anterior
En el caso de los cultivos en caldo se describirá si la turbidez está
homogéneamente distribuida en todo el tubo, o sólo en el fondo, o en la superficie del
mismo.
En el caso de los cultivos en medio sólido preste especial atención a la observación
macroscópica y discuta la pureza del cultivo
2- Preparación de extendidos y observación microscópica de los mismos
Para la preparación de los extendidos y las coloraciones siga las instrucciones de su
docente (ver detalles en el ANEXO). Una vez secas realice la observación microscópica de
los mismos. Siga las instrucciones de su docente y preste especial atención al cuidado de
los microscopios.
Tomar registro de la forma, afinidad por el colorante, y agrupamiento de los
microorganismos observados. Para las bacterias: Forma: cocos , bacilos, cocobacilos, espirilos
Agrupamiento (informar a partir de medio liquido): aisladas, diplos, tetradas,
cadenas, racimos, en empalizada.
Afinidad por el colorante (Gram positiva o Gram negativa)
También observará coloraciones de hongos levaduriformes. Compare el tamaño de
estos organismos con el de las bacterias
ANEXO
Preparación de un extendido de bacterias o levaduras
1. Colocar una pequeña gota de agua en un portaobjetos limpio
2. Con el ansa de siembra previamente esterilizada (transferir una pequeña cantidad de
cultivo levantado de medio sólido a la gota de agua. Remover la mezcla hasta formar
una suspensión homogénea y extenderla para facilitar su secado
Nota: si el material de partida es un cultivo en medio líquido basta con colocar y
extender una gota de cultivo sobre el portaobjetos
3. Esperar hasta que la fina película de líquido se evapore (no eliminar el líquido
calentando el portaobjetos a la llama)
4. Fijación de las bacterias al vidrio: pasar tres veces el portaobjetos por la llama durante
unos segundos dejándolo enfriar entre los pases
Tinción simple 5. Cubrir el extendido con colorante (violeta de genciana o safranina o azul de metileno)
6. Dejar actuar durante 1-2 minutos
7. Lavar con agua
8. Eliminar la máxima cantidad de agua golpendolos por el canto
9. Esperar que se seque
10. Observar la preparación al microscopio (luego de ubicarlo con menor aumento pasar a
objetivo de inmersión)
Tinción de Gram
5. Cubrir el extendido con cristal violeta y dejar actuar 20 segundos. Es un colorante
básico que en contacto con las células cargadas negativamente reacciona con ellas
coloreándolas)
6. Lavar con agua
7. Cubrir con Lugol (solución mordiente: fija la tinción y aumenta la afinidad entre el
colorante y las células) y dejar actuar 30 segundos
8. Lavar con agua
9. Decolorar con alcohol acetona
10. Lavar con agua
11. Cubrir con la safranina y dejar actuar 20 segundos (colorante de contraste: es un
colorante básico de distinto color al primer colorante)
Lavado de manos
Esta técnica es probablemente una de las cosas más importantes que vaya a aprender en
el transcurso de la materia. Nos hemos transformado en una “especie” tan apurada, que
muchas veces olvidamos o descuidamos las cosas simples. La mano es la forma humana
de una escoba para los cultivos. Las manos “muestrean” muchas cosas del ambiente
todos los días. Picaportes, canillas, lápices y lapiceras, dinero y las manos de otra gente
son sólo algunos de los “cultivos” que tocamos cada día.
La piel del ser humano (y la de otras especies también) contiene su propia flora residente.
Esta flora normal es protectora y previene o limita la colonización de organismos
potencialmente patógenos. Por lo tanto, la flora residente de nuestra mano es de gran
importancia y debe ser “celebrada” como una entidad que nos protege diariamente de los
patógenos. Sin embargo, el problema no es la flora residente sino la flora transitoria que
“contamina” nuestra piel diariamente. Afortunadamente, muchos de los microorganismos
que recogemos no producen en nosotros sus posibles efectos patogénicos. Esto
probablemente se deba a que no son suficientes en número para producir enfermedad o a
que nuestro sistema inmune es eficiente en sus funciones. No obstante, los dos sistemas
descriptos son a menudo evadidos por la flora transitoria y pueden llevar a enfermedad.
Microorganismos tales como el virus Influenza o varias cepas de Shigella, Salmonella,
E.coli y S.aureus dependen del humano como vector de transmisión. Y se cree que el
componente del humano como vector que permite la diseminación directa de esta
enfermedad es la mano. No es la idea volverlos paranoicos contra los microorganismos
ambientales, pero sí ponerlos en conocimiento de los diferentes tipos de organismos y
dónde pueden encontrarse. Con esta información “sembrada” en la cabeza, podemos
volvernos un poquito más precavidos cuando nos vamos del baño, la cocina, el laboratorio,
etc...sin lavarnos las manos!
La forma más efectiva y eficiente de lavarse las manos puede ser como sigue:
1. Usar agua tibia y caliente para enjuagarse las manos.
2. Usar un buen jabón (Antibacteriano en baño, cocina o laboratorio)
3. Mojar las manos y luego aplicar el jabón.
4. Fregar la parte superior y la palma de las manos hasta la muñeca por al menos 15
segundos, asegurándose de fregar la punta de la escoba, es decir los dedos, y no
olvidarse de fregar bajo las uñas (la fricción es también un componente importante
para remover la flora transitoria, por lo tanto no se debe ser demasiado suave!)
5. Enjuagar el jabón con el agua tibia o caliente por 5-10 segundos.
6. Si usa toallas de papel, primero hay que secarse con éstas las manos y luego usarla
para cerrar la canilla, evitando tocarla con las manos limpias.
7. Recomendaciones adicionales: si es posible usar un cepillo de uñas u otro cepillo
suave, es recomendable utilizarlos en las técnicas de lavado de manos.
8. ATENCIÓN: el uso de guantes en el ámbito de trabajo NO reemplaza al lavado de
manos!
BIOSEGURIDAD
El objetivo de la Bioseguridad es dictar normas, desarrollar procedimientos o
promover el uso de instrumentos que permitan evitar accidentes.
Se debe considerar el riesgo real que enfrenta el operador en la labor con distintos
microorganismos o con material biológico potencialmente infeccioso para determinar el
nivel de bioseguridad con el que debe trabajar. Según el nivel de bioseguridad se fijan
los procedimientos y los dispositivos de protección necesarios correspondientes.
Grupos de riesgo de los microorganismos. Clasificación de la OMS Grupo de riesgo 1: Riesgo individual y comunitario escaso o nulo. Grupo de
riesgo constituido por microorganismos que tienen pocas probabilidades de
provocar enfermedades en humanos o en animales.
Grupo de riesgo 2: Riesgo individual moderado, riesgo comunitario bajo.
Grupo de riesgo constituido por agentes patógenos que pueden provocar
enfermedades en humanos o en animales, pero que tienen pocas probabilidades de
entrañar un riesgo grave para el personal del laboratorio, la comunidad, los
animales o el ambiente. La exposición en el laboratorio puede provocar una
infección, pero aplicando medidas eficaces de tratamiento y profilaxis, el riesgo de
propagación es limitado.
Grupo de riesgo 3: Riesgo individual elevado, riesgo comunitario moderado.
Grupo de riesgo constituido por agentes patógenos que pueden provocar
enfermedades graves en humanos o en animales, con bajo riesgo de propagarse en
la comunidad. Se aplica al diagnóstico, investigación y producción en los cuales se
trabaja con agentes que pueden causar una enfermedad grave o potencialmente
letal, principalmente como resultado de la exposición a aerosoles. Puede
disponerse o no de medidas eficaces de tratamiento y de profilaxis.
Grupo de riesgo 4: Riesgo individual y comunitario elevado. Grupo de riesgo
constituido por agentes patógenos que pueden provocar enfermedades graves en
las personas o en los animales, con alto riesgo de propagarse en la comunidad. No
8 suele disponerse de medidas eficaces de tratamiento y profilaxis.
Niveles de bioseguridad Nivel de bioseguridad 1
El trabajo se realiza generalmente sobre mesadas abiertas y se usan técnicas
microbiológicas
adecuadas.
No se requiere equipamiento de contención ni diseño especial de infraestructura.
El personal de laboratorio debe tener capacitación continua y supervisión de un
profesional
habilitado.
El personal debe usar indumentaria de protección adecuada.
Nivel de bioseguridad 2
El personal de laboratorio debe tener entrenamiento específico para manipular agentes
patógenos y estar supervisado por un profesional habilitado.
El acceso al laboratorio debe estar restringido al personal autorizado.
Se deben tomar precauciones extremas con elementos corto punzantes
Las operaciones generadoras de aerosoles potencialmente infecciosos deben ser
realizadas con
equipamiento y/o procedimientos de contención física (ej. flujos laminares).
El personal debe usar indumentaria de protección adecuada.
Nivel de bioseguridad 3 (Laboratorios de contención)
La capacitación debe ser específica.
Todos los procesos que involucran manipulación de este nivel de material infeccioso
deben ser realizados en gabinetes de seguridad biológica.
El personal debe usar indumentaria de protección adecuada y disponer de vestuario
“doble” con ducha.
El laboratorio debe tener diseño e instalaciones adecuadas para la contención.
Es necesario el tratamiento de los efluentes líquidos.
Se debe usar filtración absoluta HEPA del aire extraído y aplicar presión negativa en el
laboratorio.
Nivel de bioseguridad 4
El laboratorio debe estar aislado del resto de las instalaciones y el acceso al mismo debe
ser estrictamente controlado (ingreso y egreso documentados).
Dentro de las áreas todas las actividades deben estar confinadas a gabinetes de
seguridad biológica Tipo III o gabinetes de seguridad biológica Tipo II con traje
presurizado para el operador.
Se debe realizar el tratamiento “in situ” de los efluentes.
Se debe usar filtración absoluta doble HEPA del aire extraído, y aplicar presión negativa
en el laboratorio.
Gabinetes de seguridad biológica Los gabinetes de seguridad biológica son dispositivos destinados a la manipulación
segura de material biológico.
Gabinetes de seguridad biológica
Tipo I Es un gabinete de presión negativa en el cual el aire ingresa por una abertura
frontal. El aire ingresado sale al laboratorio o al exterior después de haber pasado,
en su totalidad, a través de un filtro HEPA. Protege al operador pero no al producto.
Tipo II
Este tipo de gabinete tiene un diseño que protege:
a) al operador. Posee presión negativa e ingresa aire por su parte anterior a
velocidad adecuada.
b) al producto, mediante un flujo laminar hacia abajo de aire filtrado con HEPA.
c) al ambiente, ya que el aire se elimina después de pasar a través de un filtro HEPA.
Este tipo de gabinetes se subdivide en varios subtipos.
Tipo III
Dan el mayor nivel de protección al operador, al producto y al ambiente. Son
herméticamente cerrados. Para la manipulación se usan guantes sellados a la pared
frontal de la cabina. Funcionan también con presión negativa El aire ingresante
pasa a través de filtro HEPA y el egresante pasa por dos filtros HEPA colocados
en serie o a través de un filtro HEPA y posterior tratamiento con calor.
PRECAUCIONES GENERALES EN EL LABORATORIO. NORMAS BÁSICAS
PARA EMERGENCIAS, ACCIDENTES O CONTAMINACIONES
El laboratorio es un lugar de trabajo y un área de acceso restringido. Las mesas
de trabajo, suelos y paredes deberán ser de materiales de fácil limpieza y
desinfección.
El personal deberá conocer la localización y el manejo de los dispositivos e
instalaciones de prevención de riesgos, de evacuación y las normas de actuación
en caso de incidentes o accidentes.
Deberá haber instrucciones básicas informadas, comprendidas y fácilmente
accesibles para los casos de accidentes con productos biológicos o químicos
(lavado de ojos, limpieza de derrames, eliminación de residuos, primeros auxilios,
teléfonos del medico de medicina laboral, urgencias, evacuación, etc.).
En el laboratorio se debe respetar la regla de los cuatro “NO”: No fumar. No
comer. No beber. No maquillarse.
Todo el personal usará obligatoriamente guardapolvos (abrochado) de mangas
largas y zapatos cerrados, evitando el uso de accesorios colgantes. Cuando sea
necesario trabajar con guantes, deberá lavarse las manos antes de colocarse los
guantes y al quitárselos. Lo hará con jabón y tantas veces como sea necesario.
Con los guantes puestos sólo se deben tocar los elementos necesarios para la
tarea que se esté realizando. Se evitará tocar los elementos de uso común con la
mano enguantada. Si esto debiera hacerse, se quitarán previamente los guantes,
efectuando el lavado y antisepsia de manos conveniente.
Al comenzar y al abandonar la tarea se lavarán las manos con agua y jabón.
Todo el material biológico debe considerarse como potencialmente
contaminante y por lo tanto, tomar todas las precauciones y cumplir todas las
instrucciones documentadas para su manejo, conservación, uso, almacenamiento o
archivo y eliminación.
Higiene ambiental: Se usarán siempre guantes impermeables gruesos de tipo
industrial. Pisos, baños y superficies: se deben lavar con hipoclorito de sodio al
0,1% dejándolo actuar durante 20 minutos. Los elementos para efectuar la
limpieza se desinfectarán con solución de hipoclorito de sodio al 0,1 % y serán
usados exclusivamente para el laboratorio. Los baldes se vaciarán y limpiarán
después de su uso. Los residuos de la limpieza (toallas descartables y materiales
absorbentes) se eliminarán como residuos patogénicos evitando arrojar sin
precauciones elementos cortantes o punzantes. Mesas de trabajo: se limpiarán al
terminar la tarea, con hipoclorito de sodio al 0,5 % durante 30 minutos. En caso de
derrames de líquidos patogénicos se deben absorber con algodón embebido en
hipoclorito de sodio al l %, dejándolo actuar 30 minutos para descontaminar.
Posteriormente se limpiará la superficie como se ha indicado.
Jamás se pipeteará con la boca. Se usarán siempre los dispositivos aspiradores o
dispensadores convenientes en cada caso.
Accidentes con corto-punzantes: se favorecerá el sangrado de la herida y se
efectuará un prolijo lavado con solución jabonosa de iodopovidona al 5 % durante
no menos de 10 minutos. Salpicaduras en mucosa: se procederá al arrastre
mecánico, por lavado con abundante agua corriente, durante no menos del 20
minutos. Salpicaduras en piel: se lavará con iodopovidona al 5 % durante el
mismo lapso.
Personal con heridas cortantes, lesiones exudativas o dermatitis activa. No
manipulará equipos o materiales con los que pueda contaminarse.
Se evitará todo procedimiento que pueda producir aerosoles (soplado del resto
del contenido en pipetas, centrifugado sin tapones, etc.).
Además en el desarrollo del TP recuerde
Mantener dedos, lápices o biromes lejos de la boca.
Utilizar el mínimo de elementos para registrar los experimentos y mantenerlos en un
extremo de la mesada.
Ante cualquier duda consulte con el docente.
Referencias bibliográficas
Micucci HA. Bioseguridad como epidemiología del accidente y las condiciones de
trabajo como causas del mismo. En Temas de Zoonosis II. Editores Cacchione R,
Durlach R y Larghi O. Edición Asociación Argentina de Zoonosis. Buenos Aires.
2004, p. 423-428.
de Torres RA. Niveles abordables de bioseguridad. Bioseguridad en el laboratorio.
Acta Bioquim Clin Latinoam., Suplemento 4. 1988. p. 1-4.
TRABAJO PRÁCTICO 2
OPERACIONES BÁSICAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA
(PARTE 2)
Objetivos: Aprender a describir colonias de hongos miceliares y levaduriformes.
Adquirir entrenamiento en la observación microscópica de microorganismos.
DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO
PRIMER DÍA
1- Observación macroscópica / microscópica de hongos miceliares y levaduriformes
a) Usted recibirá distintas placas de Petri con cultivos de hongos miceliares en medio
Czapek y en agar Sabouraud:
Aspergillus sp.
Penicillum sp
Rhizopus sp..
Fusarium sp.
Realizar la observación macroscópica de los cultivos, registrando las características
de las diferentes colonias (tamaño, consistencia, aspecto, color, textura, bordes, etc.) y
registrando en cada caso el medio de cultivo. Intente identificar la localización del micelio
reproductor y del micelio vegetativo.
Nota: El medio Czapek es un medio químicamente definido que tiene la siguiente
composición: nitrato de sodio 0,2%, fosfato bipotásico 0,1%, cloruro de potasio 0,05%,
sulfato de magnesio heptahidratado 0,001%, sacarosa 3%, pH 4 - 4,5, esterilizado a 0,5
atm durante 30 minutos.
Recibirá nuevamente cultivos de bacterias que ya utilizado en el TP1, compare las
características generales de las colonias de los hongos miceliares y las de bacterias y
hongos levaduriformes
b) Para la observación microscópica de hongos miceliares se realizará un preparado entre
portaobjeto y cubreobjeto con un fragmento de micelio colocado en un líquido de montaje,
en este caso azul de lactofenol.
En el preparado se observará el micelio vegetativo (tipo de hifas) y el micelio
reproductor describiendo los cuerpos de fructificación.
Nota: Composición del azul de lactofenol
Fenol cristalizado 20g, ácido láctico 20g, glicerina 40g, agua destilada 20 ml, azul de
algodón 0,1g
Para prepararlo se disuelven los componentes y se calienta suavemente. El azul de algodón
se agrega al final.
Otro modo de ver las estructura de los hongos miceliares es aplicando la técnica de
Microcultivo que se detalla en el anexo 1
SEGUNDO DÌA
1- Observación macroscópica / microscópica de hongos miceliares y levaduriformes
Continuación
ANEXO 1
TÉCNICA PARA REALIZAR MICROCULTIVO DE HONGOS
Materiales:
Placa de petri de vidrio
Papel de filtro
Soporte para porta (varilla de vidrio)
Portaobjetos
Cubreobjetos
Pinza
Pinche
Agar Sabouraud /Agar Papa glucosado/Agar HyL
Pasos a seguir
0. Esterilizar todo el material a utilizar (portaobjetos, cubreobjetos, V de vidrio, agua
destilada y medio de cultivo)
1. Colocar el material a utilizar bajo mechero
2. Siguiendo la técnica aséptica cortar una porción del medio de cultivo que se utilizará y
depositarlo sobre el portaobjeto
3. Con anza recta tocar la superficie del hongo que se quiere identificar
4. Realizar el inóculo en el borde del medio de cultivo
5. Con pinza estéril tomar un cubreobjetos y depositarlo sobre el sitio donde se inoculó el
hongo.
6. Colocar agua purificada estéril sobre el papel de filtro que se encuentra en la base de la
placa.
7. Incubar la placa sin invertir a 20-25 ºC por 3 a 5 días
8. Una vez que se desarrolló el microorganismo con pinza estéril y sumo cuidado retirar el
cubreobjeto y colocarlo sobre un portaobjetos sobre el cual se depositó una gota de
colorante.
9. Observar al microscopio (40 X) las estructuras del microorganismo.
10. Localizar estructuras características de los hongos
Algunas preguntas que debería poder contestar luego de finalizar el TP1 y el TP2:
1. ¿Qué cuidados debe Ud tener para evitar la contaminación de sus muestras y de sus
cultivos?
2. ¿Por qué ha flameado la boca del tubo antes de introducir el ansa para realizar el
extendido?
3. ¿Por qué se invierten las cajas de Petri durante la incubación?
4. ¿Cuáles son las ventajas y las desventajas respecto de una tinción simple y un examen
en fresco?
5. ¿Con los resultados de una tinción simple se puede saber si la muestra teñida es un
cultivo puro? ¿Y con los de una tinción diferencial? Cuáles son las ventajas de una
tinción simple frente a una tinción diferencial
6. Correlacione el comportamiento frente a la tinción de Gram con otras propiedades de
la célula bacteriana
7. ¿Existe alguna relación entre el tipo de morfología y la tinción de Gram?
8. ¿Por qué la tinción de Gram debe realizarse sobre muestras tomadas de cultivos
jóvenes?
9. ¿Cómo se forma una colonia?
10. ¿Qué puede usted afirmar con respecto a la pureza de los cultivos cuyas características
culturales ha descripto?
11. ¿Cómo se forma una colonia y por qué es llamada UFC?
12. ¿Qué diferencia existe entre los hongos miceliares y levaduriformes?
TRABAJO PRACTICO 3
ESTERILIZACIÓN Y DESINFECCIÓN
Objetivos
Adquirir entrenamiento en la preparación de medios de cultivo y acondicionamiento de
material para su posterior esterilización.
Aprender a esterilizar algunos de los materiales más comúnmente utilizados en el
laboratorio de Microbiología.
Analizar las variables de un ciclo de esterilización por calor húmedo y seco. Discutir la
necesidad e importancia de incluir controles del proceso.
Conocer el ciclo del material de laboratorio con una aproximación al tratamiento de los
residuos que se generan en el laboratorio.
PRIMER DIA
PREPARACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y ACONDICIONAMIENTO PARA
SU POSTERIOR ESTERILIZACIÓN.
ACONDICIONAMIENTO DE MATERIAL DE VIDRIO PARA SU POSTERIOR
ESTERILIZACIÓN.
ESTERILIZACIÓN POR CALOR SECO Y CALOR HÚMEDO
a) Mostrativa: Ciclo de esterilización por calor seco sobre material de vidrio
adecuadamente acondicionado.
b) Preparar el material de vidrio requerido: Tubos de ensayo con su correspondiente
tapón y pipetas de distintos volúmenes. Acondicionar el material.
c) Según las indicaciones del docente preparar medios de cultivo, agarizados y no
agarizados, y acondicionarlos para su esterilización.
d) Ciclo de esterilización por calor húmedo: los medios de cultivo preparados y
acondicionados se esterilizarán en autoclave incluyendo un control biológico (tiras de
esporos de Geobacillus stearothermophilus) y un control fisicoquímico de
esterilización.
Ciclo de esterilización por calor seco: el material de vidrio acondicionado se
esterilizará en estufa incluyendo un control biológico (tiras de esporos de Bacillus
subtilis var niger) y un control fisicoquímico de esterilización.
e) Discutir el fundamento y las variables de los métodos, normas de utilización de cada
uno de los equipos y tipo de material que se puede esterilizar por cada uno de los
métodos.
PROCESAMIENTO DE LOS CONTROLES BIOLOGICOS AL FINAL DE CADA
CICLO
DE ESTERILIZACION.
Incubar a 56ºC la ampolla o tira de G. stearothermophilus y a 37ºC la tira de esporos de
B.subtilis.
Además procesar:
*1 control de viabilidad de los esporos: de la misma manera que en el paso anterior,
se incuba una tira de esporos / ampolla que NO fue sometida al proceso de
esterilización en un medio de cultivo y a una temperatura adecuados
*1 control de esterilidad del medio utilizado: incubar el medio para comprobar su
esterilidad.
Discutir la importancia de incluir estos dos últimos controles.
Observar a las 24 hs y a los 7 días.
SEGUNDO DIA
1. ESTERILIZACION
a) Observación de los resultados de los controles de esterilización (los negativos
deben volver a incubarse hasta la semana siguiente).
b) Mostrativa: proceso de filtración esterilizante. Discutir el fundamento, las
aplicaciones y variables del método. Limitaciones.
2. ENTRENAMIENTO EN TÉCNICA ASÉPTICA
Aplicar la técnica aséptica y las nociones de bioseguridad en el laboratorio de
Microbiología.
a) Plaqueo de medios de cultivo sólidos
Fundir los medios de cultivo y proceder a verter en placas de Petri plásticas
estériles.
a) Fraccionamiento de medios de cultivo líquidos
Con pipeta estéril tomar determinado volumen de caldo Tripteína Soja y colocarlo
en tubos de vidrio estériles
Algunas preguntas que debería poder contestar luego de finalizar el TP3
1) ¿Qué agentes esterilizantes fueron empleados en el TP? ¿Qué variables fueron
controladas durante el proceso de esterilización?
2) ¿Qué tipo de controles del ciclo de esterilización se utilizaron? Explique el
fundamento de cada uno.
3) ¿Cómo esterilizaría una solución de Vitamina C?
4) ¿Cómo esteriliza una solución de cloruro de sodio 0.9%?
5) El hipoclorito de sodio es un agente muy utilizado en la desinfección de mesadas
de trabajo y otras superficies. Cuáles son las condiciones de uso, nivel de
desinfección que brinda, y principales limitaciones.
TRABAJO PRÁCTICO 4
USO DE MEDIOS DE CULTIVO EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGIA
Objetivos
Conocer cómo se cultivan los microorganismos en el laboratorio: la importancia de las
condiciones de incubación, y los medios de cultivo como fuente de nutrientes.
Conocer la diferente utilidad de medios de cultivo líquidos y sólidos.
Comprender los fundamentos del uso de medios selectivos y diferenciales y las
ventajas de utilización de cada uno de ellos.
DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO PRIMER DÍA:
Se dispondrá de un aislamiento por agotamiento en superficie de una muestra
microbiana y de un cultivo en medio líquido.
Los alumnos deberán conocer las características y aplicaciones de los siguientes medios de
cultivo (VER ANEXO): Caldo tripteína-soja, Agar tripteína-soja, Agar EMB según Levine
(agar de Levine con eosina y azul de metileno), Agar de Baird Parker, Agar Violeta-rojo-
bilis, Agar manitol-salado según Chapman.
1) Realizar la tinción de Gram a las muestras: preparación del extendido, tinción y
observación.
2) A partir de la información obtenida de la observación microscópica de la muestra
determinar qué medios de cultivo utilizará (agar tripteina-soja, agar EMB según
Levine, agar de Baird Parker, agar Violeta-rojo-bilis, agar manitol-salado según
Chapman). Fundamente su elección
3) Se seleccionará un microorganismo y por mesada se realizará un aislamiento por
agotamiento de superficie en Agar Tripteína-soja. Cada mesada incubará su
aislamiento a distintas temperaturas:
4-8 ºC (heladera)
20 – 25 ºC (temperatura ambiente)
30-35 ºC
50-60 ºC
SEGUNDO DÍA:
1) Observar los aislamientos realizados.
2) Observar el crecimiento de los microorganismos según las condiciones de
incubación.
3) Realizar la tinción de Gram de las diferentes colonias observadas
4) Describir los resultados obtenidos de los distintos aislamientos en medio sólido.
Discutir la utilidad y la aplicación de los medios utilizados
Algunas preguntas que debería poder contestar luego de finalizar el TP4
1) En este trabajo práctico se han utilizado distintos medios de cultivo, indique si se
trata de medios complejos o de medios químicamente definidos.
2) Cuáles son los medios selectivos que ahora conoce y en qué situaciones pueden
utilizarse?
3) ¿Puede un mismo medio de cultivo funcionar como selectivo y diferencial?
4) Si al realizar un aislamiento en medio selectivo Ud. observa un solo tipo de
colonias ¿Podría deducir de ello que el cultivo contiene un solo tipo de bacterias?
¿Por qué?
5) Si realiza un extendido y tinción de Gram a partir de una muestra líquida, y observa
un solo tipo de bacterias ¿Puede asegurar que es el único tipo de bacteria presente
en la muestra? ¿Por qué?
6) ¿Cuál es la utilidad de conservar microorganismos? ¿Qué metodologías de
conservación conoce?
TRABAJO PRACTICO 5
APLICACIONES DE DIFERENTES MEDIOS DE CULTIVO EN EL
LABORATORIO
TECNICA DE ENRIQUECIMIENTO
Objetivos
Abordar el análisis preliminar de una muestra polimicrobiana.
Describir la metodología de búsqueda específica de microorganismos de una
determinada especie.
Conocer la metodología y aplicación de las técnicas de enriquecimiento.
Comprender la utilidad de medios selectivos y diferenciales. Interpretar los resultados
obtenidos a partir de ellos.
DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO PRIMER DÍA:
Procesamiento de una muestra líquida: Cada equipo recibirá una muestra líquida y a
partir de la misma realizará tinción de Gram, enriquecimiento y aislamiento en medios
selectivos y diferenciales.
1) Realizar la tinción de Gram a la muestra líquida recibida.
2) Aislamientos en medios selectivos: a partir de la muestra hacer aislamientos por
agotamiento en superficie en distintos medios: agar tripteina-soja, agar EMB según
Levine, agar de Baird Parker, agar Salado Manitol seg. Chapman, agar VRBG y
medios cromogénicos.
3) Enriquecimiento: Tomar una alícuota de 1 ml de la muestra entregada y realizar un
enriquecimiento en Caldo lactosado / Caldo hiper salado: incubar 24 hs a 37º C.
SEGUNDO DÍA:
1) Observar los aislamientos realizados el día anterior.
2) A partir del enriquecimiento con 24 hs de incubación realizar aislamientos en: agar
tripteina soja, agar EMB según Levine, agar de Baird Parker, agar Salado Manitol seg.
Chapman y agar VRBG, medios cromogénicos.
3) Realizar la tinción de Gram de las diferentes colonias observadas en los medios sólidos
y del crecimiento en los caldos de enriquecimiento.
Algunas preguntas que debería poder contestar luego de finalizar el TP5
1) ¿En que situaciones se requiere aplicar la técnica de enriquecimiento?
2) Ud. necesita investigar la presencia de Salmonella spp en una muestra obtenida a partir
de un alimento, y al realizar un extendido y coloración de Gram, sólo se han observado
bacilos Gram negativos. Sugiera cómo procedería.
3) Se desea investigar la presencia de S. aureus en una muestra líquida a partir de la cuál
se ha realizado un extendido y coloración de Gram y sólo se han observado bacilos
Gram negativos. Sugiera cómo procedería para buscar S. aureus.
TRABAJO PRÁCTICO 6
MÉTODOS DE CONTEO DE MICROORGANISMOS
Objetivos
1) Conocer distintos métodos para estimar el número de microorganismos totales y viables.
2) Estimar el número de microorganismos viables presentes en una muestra de agua por el
método del número más probable.
3) Discutir las ventajas y desventajas de cada uno de los métodos y en que casos se aplica
cada uno de ellos.
DESARROLLO DEL TRABAJO PRÁCTICO
PRIMER DÍA:
Usted recibirá una suspensión conteniendo levaduras
PARTE I: ESTIMACIÓN DEL NÚMERO DE MICROORGANISMOS TOTALES
A.I- Conteo directo en cámara de recuento- MOSTRATIVO
- Realizar una dilución al décimo de la muestra. Cargar la cámara de recuento de
acuerdo a la indicación del docente (si el número de microorganismos es muy elevado y
es dificultoso el conteo realizar una nueva dilución 1:10, o sea 1:100 final) y cargar
nuevamente la cámara
- Posteriormente realizar el conteo de microorganismos de acuerdo a la cámara con la
cual trabaje.
Nº de microrg/ml= nº total contado x nº total de cuadrados x 1000 x D
Vol. de la cámara x nº de cuadrados contados
Vol. de la cámara: 0.1 mm3
1000: Factor de corrección (expresado en mm3/cm
3)
B.I.-Estimación de la masa microbiana por turbidimetría.
Se determina la densidad óptica (D.O.) de la muestra frente a un blanco del medio
en que se realizó la suspensión en un fotocolorímetro Crudo-Caamaño (filtro 53) o
espectrofotómetro visible (530 nm)
PARTE II: METODOLOGÍA PARA REALIZAR RECUENTO DE
MICROORGANISMOS VIABLES
A.II. Recuento por dilución en superficie.
Ud recibe una muestra de la cual debe conocer la carga microbiana, para ello
realiza un recuento de microorganismos viables. Se hacen diluciones de la muestra en el
diluyente de trabajo (solución salina, Agua peptonada buffereada 0.1 %, Buffer, etc.), a fin
de obtener un número probable de 30 a 300 colonias por placa luego de 24 a 48 hs. de
incubación.
Para ello se procederá de la siguiente forma:
1) Preparación de las placas para trabajar
Si el medio se encuentra en botellas, fundirlo y verter en las placas de petri estériles
(aproximadamente 10 ml. por placa). Una vez solidificado colocar las placas invertidas en
la estufa de secado, cuando estén secas (no se observen gotitas de agua en la superficie del
agar), se cierran, se retiran de la estufa y se mantienen en forma invertida hasta su
utilización.
2) Preparación de las diluciones de la muestra.
- Tomar tubos estériles y rotularlos 10-1
, 10-2
, 10-3
......
- Con una pipeta de 5 ml. estéril cargar cada uno de estos tubos con 4.5 ml. del diluyente
estéril. Utilizar una misma pipeta para cargar todos los tubos y trabajar en condiciones
asépticas.
- Tomar una pipeta estéril de 1 ml. Cargar 0.5 ml de la muestra y volcarlo en el tubo
rotulado como 10-1
. Antes de tapar el tubo cargue y descargue sucesivamente la pipeta con
la dilución que ha realizado. Descarte esta pipeta en un frasco con lavandina. NO
OLVIDE HOMOGENEIZAR EL CULTIVO O LA DILUCIÓN ANTES DE
TOMAR LA ALÍCUOTA. - Tome otra pipeta de 1 ml, cargue 0.5 ml del tubo 10
-1 y vuélquelos en el siguiente tubo
rotulado como 10-2
.Cargue y descargue la pipeta con dicha dilución antes de tapar el tubo.
- Repita el procedimiento hasta la última dilución.
- Descarte cada pipeta en un frasco con lavandina que posteriormente se va a
descontaminar.
10-1
10-2
10-3
10-4
Y ASI MAS......
3) Rotule las placas con las diluciones a sembrar, 2 placas por cada dilución (ensayo por
duplicado).
- Tome una pipeta estéril, cargue 0.1 ml de la mayor dilución a ser sembrada y vuélquelos
en el centro de las placas correspondientes a esa dilución (0.1 ml en cada una). Luego
repita la operación con esa misma pipeta para la dilución inmediata inferior y luego con la
otra (por ejemplo: primero siembre ambas placas de 10-6
, luego 10-5
y por último 10-4
.)
- Tomar una espátula triangular de vidrio (espátula de Drigalsky) estéril, y comenzando
por la mayor dilución (10-6
), extienda por toda la placa la gota que ha volcado hasta sentir
que el líquido se ha absorbido completamente, es decir cuando la espátula no puede
deslizarse fácilmente.
- Repetir la operación con el resto de las placas (10-5
y luego 10-4
.). Colocar la espátula en
un recipiente para descontaminar.
4) Colocar las placas en estufa de incubación a 37º C durante 24 horas en forma invertida.
5) Conservar las diluciones para utilizarlas en la otra técnica.
B.II. Recuento por dilución en profundidad
Las diluciones de trabajo se preparan según punto 2 de A.II
1) Se rotulan 6 placas de Petri estériles con tres diluciones. Se funden las botellas
conteniendo agar Tripteína Soja estéril y se los termostatiza a 45°C. Trate de trabajar
en forma rápida para evitar que el agar comience a solidificarse
2) Se toma una pipeta estéril de 1 ml y se carga 1 ml de la mayor dilución en la placa
correspondiente a dicha dilución. Se repite la misma operación para el duplicado
3) Con esa misma pipeta se repite la operación con la dilución inmediatamente inferior y
por último con la menor dilución (cada uno se realiza por duplicado).
Tubo con
muestra
0.5
ml
0.5 ml 0.5 ml 0.5
ml
Y SEGUIR.....
10-1
10-2
10-3
10-4
4) Inmediatamente se vuelca medio fundido y termostatizado en cada una de las placas de
Petri y se homogeiniza haciendo girar la placa. Evitar el agregado de mucho medio
de cultivo porque será más difícil el conteo de las colonias.
5) Se deja solidificar el agar en las placas, una vez seco se colocan las mismas en forma
invertida en la estufa de incubación a 37ºC durante 24 hs.
TRABAJO PRÁCTICO 7
IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS
Objetivos
- Adquirir conocimientos básicos de los métodos empleados para la identificación
bacteriana.
- Aprender a identificar microorganismos pertenecientes a la familia
Enterobacteriaceae.
- Aprender a identificar microorganismos pertenecientes al género Staphylococcus.
PRIMER DIA
IDENTIFICACIÓN
Cada equipo recibirá un cultivo puro recuperado de una muestra X y una cepa
control de colección de nuestro laboratorio (ambas en aislamiento). Discutir con el docente
la utilidad de la cepa control.
Coloración de Gram
Realizar una coloración de Gram para observar características morfológicas y
controlar la pureza de los cultivos.
Aislamientos
Según el resultado de la observación microscópica se realizará un aislamiento por
agotamiento de superficie en agar selectivo y diferencial: EMB Levine ó Agar Salado
Manitol Seg. Chapman
Pruebas bioquímicas:
Cada grupo recibe:
- Un kit comercial para identificar enterobacterias.
- Un tubo con plasma de conejo para realizar la prueba de la coagulasa.
- Una Placa con agar DNAsa.
- Un porta y H2O2 para realizar la prueba de la catalasa.
Para toda la comisión:
Se realizará una batería mostrativa de pruebas bioquímicas, dónde se va a sembrar E. coli
SEGUNDO DIA
Lectura e interpretación de los resultados de las pruebas bioquímicas
CITRATO
Este medio indica la capacidad de las bacterias de metabolizar el citrato. Contiene
citrato como única fuente de carbono y fosfato de amonio como única fuente de fosfato y
azul de bromotimol como indicador de pH. Unicamente las bacterias capaces de utilizar
citrato (esta capacidad depende de la presencia de una citrato permeasa que facilita el
transporte de citrato hacia el interior de la bacteria) podrán multiplicarse en este medio y
al hacerlo utilizarán los fosfatos presentes liberando iones amonio. Esta liberación de
cationes, junto con la eliminación de CO2 asociada a la oxidación del citrato genera una
fuerte alcalinización del medio que será visible gracias al viraje del indicador (azul de
bromotimol) al azul. El CO2 liberado se combina con el Na (el citrato es provisto como
citrato de Na) y agua, para formar carbonato de sodio que es un producto alcalino. Las
bacterias citrato negativas no son capaces de crecer en esto medio.
LIA
Este ensayo permite diferenciar los microorganismos que producen
descarboxilación o desaminación de la lisina. Se puede detectar además la producción de
H2S. Es muy utilizado en las técnicas de búsqueda de Salmonella, principalmente para
descartar otras bacterias que dan colonias de aspecto similar.
Durante las primeras etapas de la incubación el fondo virará el indicador de pH del medio
al ácido (amarillo) por la fermentación de glucosa. Luego, si el aminoácido es
descarboxilado se formarán aminas que provocan un retorno al color original del medio o
hacia un viraje al básico (color violeta).
En la desaminación se produce un ácido carboxílico y NH3 y se visualiza en la superficie la
aparición de un color rojo intenso. La producción de H2S a partir de tiosulfato se visualiza
por la precipitación de sulfuro ferroso de color negro.
UREA
La reacción es positiva cuando hay viraje del indicador al rojo por la formación de
NH3 (alcalinización) por acción de la ureasa producida por el microorganismo.
TSI (agar Hierro-Triple azúcar)
Las estrías de TSI contienen 1 % de lactosa y de sacarosa y 0.1% de glucosa. El
medio contiene rojo de fenol como indicador de pH para detectar la acidez como resultado
de la fermentación. También contiene sulfato amónico férrico y tiosulfato de sodio, a partir
de estos compuestos algunas enterobacterias pueden producir SH2, que se evidenciará por
el ennegrecimiento del agar (sulfuro de hierro). Este medio deberá inocularse haciendo
estrías en zig-zag sobre la superficie del agar y luego punzando el agar con la aguja de
inoculación.
Producción de sulfhídrico
Una reacción positiva implica el ennegrecimiento del medio de cultivo, por formación de
sulfuro de hierro.
Fermentación de azúcares (glucosa, lactosa y sacarosa) :
Fermentación de glucosa : alcalino-ácido (estría roja y fondo amarillo) El rojo de fenol
vira al amarillo en el interior del tubo debido a los productos de fermentación de la
glucosa, pero la superficie de la estría permanece roja porque la concentración de
glucosa es limitada)
Fermentación de glucosa y (lactosa y/o sacarosa): ácido-ácido (estría y fondo amarillo)
Existe excesiva formación de ácido en todo el medio como resultado de la
fermentación de lactosa y/o sacarosa además de la glucosa lo que determina un viraje
completo del indicador.
No fermenta ninguno de los tres azúcares alcalino-alcalino. Tanto la estría como el
fondo del tubo permanecen de color rojo. No hay fermentación de los azúcares, por lo
tanto no hay viraje del indicador.
Producción de gas: Se registra burbujas y/o desplazamiento del agar
SIM
Sulfhídrico
Una reacción positiva implica el ennegrecimiento del medio de cultivo por formación de
un precipitado de SH2
Motilidad
La motilidad es positiva cuando la turbidez producida por el desarrollo de los
microorganismos se desplaza de la línea de siembra.
Revelado de las pruebas bioquímicas que requieren de reactivos específicos:
VOGES PROSKAUER
El test de Voges Proskauer identifica las bacterias que producen 2,3-butanodiol
como producto de la fermentación de la glucosa.
El caldo RM-VP ya desarrollado (luego de 48 hs de incubación) se divide en dos
fracciones, reservando una de ellas para el revelado con Rojo de Metilo.
Una fracción es revelada por el agregado de 3 gotas de hidróxido de potasio al
40%, igual cantidad de creatina y finalmente con suavidad y por las paredes, tres gotas de
alfa-naftol al 5% en etanol absoluto.
La reacción detecta la presencia de acetoina (acetilmetilcarbinol) que es un
precursor del 2,3-butanodiol. La prueba es positiva cuando se desarrolla color rojo como
resultado de la reacción entre la acetoína y los reactivos reveladores. La aparición de color
rojo puede tardar hasta 15 minutos.
ROJO DE METILO
La fracción no utilizada del RM-VP es revelada por el agregado de tres gotas de la
solución de rojo de metilo (indicador de pH), siendo positiva cuando se observa color rojo,
debido a la acidez de la fermentación ácida mixta. Las bacterias que no producen este tipo
de productos de fermentación dan un color amarillo con el indicador de pH. Escherichia
coli, por ejemplo cataboliza la glucosa por fermentación produciendo una mezcla de ácidos
(succinico, láctico, acético, fórmico) lo que determina una disminución del pH hasta un
valor de 4.0 (reacción rojo de metilo +)
INDOL
Las bacterias que producen la enzima triptofanasa pueden hidrolizar el triptofano a
indol, ácido pirúvico y amonio. La bacteria utiliza el pirúvico y el amonio como nutrientes
y el indol que no es utilizado se acumula en el medio. Esta prueba es revelada en el medio
SIM, al cual se le agregan tres gotas del reactivo de Kovacs. Una reacción positiva se
evidencia por la aparición de un anillo de color rojo en la superficie debido a la formación
de un complejo entre el p-dimetil amino benzaldehido y el indol proveniente de la
descomposición del triptofano por la enzima triptofanasa.
CATALASA
La catalasa es una enzima que protege a las células frente al peróxido de hidrógeno
producido en el metabolismo del oxígeno. Cataliza la formación de agua y oxígeno a partir
del peróxido de hidrógeno.
Es útil para distinguir Streptococcus (negativa) de Staphylococcus (positiva) y Clostridium
(negativa) de Bacillus (positiva).
La actividad catalasa se detecta añadiendo unas gotas de peróxido de hidrógeno sobre las
colonias en placa que no sea de agar sangre (daría falsos positivos). La producción de
burbujas indica la presencia del enzima.
COAGULASA
La enzima coagulasa actúa directamente sobre el fibrinógeno, provocando la
formación de coágulos que se producen al mezclar una suspensión bacteriana con plasma.
Permite diferencia a los Staphylococcus aureus que dan una reacción positiva, del resto de
los Staphylococcus.
Se añade una suspensión densa de bacterias a un tubo pequeña con plasma y se incuba a
37C. Se observa la coagulación a las 4 y 24 h sin sacarlos de la estufa.
DNasa
Permite diferenciar al Staphylococcus aureus del resto del género. Se basa en la
presencia de la enzima termoestable DNasa, que es capaz de clivar los enlaces internos de
fosfodiester de la molécula de ADN.
Para realizar esta prueba, necesitamos hacer una estría gruesa una placa conteniendo
DNA. Se revela después de incubar con HCL 0,1 N que precipita el DNA no hidrolizado.
ANEXO 1
Preparación de los reactivos:
Voges Proskauer:
1) Alfa-naftol 5%:
Disolver 2,5 g de alfa-naftol en 50 ml de etanol absoluto, primero en un pequeño volumen
y luego llevar a volumen en matraz.
2) KOH 40%:
Disolver 20 g de hidróxido de potasio en 50 ml de agua destilada. Llevar a volumen en
matraz.
Nitrato:
1) Alfa-naftilamina 0.5%
500 mg de alfa-naftilamina
Ac Acético 30 % csp 100 ml
Disolver en un volumen pequeño, calentar suavemente y luego llevar a volumen en matraz.
2) Ac. Sulfanílico 0.8%
800 mg de Ac .sulfanílico
Acido acético 5N (30 %) csp.100 ml
Resultados Kit comercial
Algunas preguntas que debería poder contestar luego de finalizar el TP7
1. Ud recibe una estría de un cultivo que ha sido caracterizado como perteneciente a la
familia de las enterobacterias para su identificación a nivel de especie. Enumere los
pasos a seguir para realizar con éxito la identificación solicitada.
2. ¿Puede Uds a partir de un aislamiento en medio selectivo, realizar pruebas
bioquímicas? Justifique.
3. Qué es una especie bacteriana.
4. Qué entiende por cepa patrón.
5. Cuáles son los criterios que se utilizan para la identificación de los microorganismos.