SZENZOROS-IMMUN INTERAKCIÓK VIZSGÁLATA

VASZKULÁRIS, RESPIRATORIKUS ÉS METABOLIKUS

MECHANIZMUSOKBAN

Doktori (Ph.D.) értekezés

DR. HAJNA ZSÓFIA RÉKA

Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Neurofarmakológiai Program

A Doktori Iskola vezetője és programvezető: Prof. Dr. Pintér Erika

Témavezetők: Prof. Dr. Pintér Erika, Prof. Dr. Biró Zsolt

Pécsi Tudományegyetem Általános Orvostudományi Kar

Farmakológiai és Farmakoterápiai Intézet

2017

2

TARTALOMJEGYZÉK

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE 5

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS 8

1. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések és a neurogén gyulladás 8

2. A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) receptor 10

3. A kapszaicin-érzékeny rostokból felszabaduló neuropeptidek: a CGRP és a

tachykinin rendszer 15

3.1. A kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) 15

3.2. A tachykinin rendszer és annak legújabb tagja, a hemokinin-1 16

4. A hidrogén-szulfid és a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések kapcsolata 19

5. A diabétesz mellitusz krónikus szövődményei és a peptiderg primer afferensek

kapcsolata, valamint a komplikációk megfelelő modellezésének problémái 22

6. A szenzoros-immun interakciók jelentősége különböző szervrendszerek

megbetegedéseiben 24

CÉLKITŰZÉSEK 25

KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 26

KÍSÉRLETI ÁLLATOK 26

KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS PARADIGMÁK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK 26

1. A mikrocirkuláció vizsgálata során alkalmazott protokollok és módszerek 26

1.1. A kapszaicin-érzékeny érzőidegek funkcionális inaktiválása RTX-

deszenzibilizációval 26

1.2. A H2S hatásaiban részt vevő molekuláris mediátorok vizsgálata genetikai

és farmakológiai módszerekkel 27

1.3. A bőr véráramlásának vizsgálata egérfülön 28

1.4. A bőr vazodilatációjának kiváltása egérfülön 30

2. Az akut és krónikus légúti gyulladásmodellek alapelve és a vizsgálatok során

alkalmazott módszerek 31

2.1. Endotoxinnal kiváltott akut légúti gyulladásmodell 31

2.2. Dohányfüst expozícióval kiváltott krónikus légúti gyulladásmodell 32

2.3. A légúti válaszkészség funkcionális vizsgálata 33

2.4. Bronchoalveoláris mosás 34

2.5. A tüdők fénymikroszkópos szövettani vizsgálata 34

3

2.6. Mieloperoxidáz (MPO) aktivitás meghatározása tüdőhomogenizátumból

spektrofotométerrel 35

2.7. A tüdőbeli MPO aktivitás meghatározása IVIS Lumina biolumineszcens

képalkotó technika segítségével 35

2.8. A tüdők citokin koncentrációinak mérése Luminex technika segítségével 35

3. A diabétesz hosszú távú modellezése során használt protokollok és módszerek 36

3.1. A különböző súlyossági fokú diabéteszes állapotok beállítására szolgáló kezelési

sémák 36

3.2. A diabéteszes állatok vércukor szintjének és testsúlyának, valamint folyadék- és

táplálékfogyasztásának monitorozása 37

3.3. Szemvizsgálat és oftalmoszkópia 38

3.4. A retina fénymikroszkópos szövettani és immunhisztokémiai vizsgálata 38

3.5. Vizelet vizsgálat 39

3.6. A vesék fénymikroszkópos szövettani vizsgálata 39

3.7. A szemek és a vesék elektronmikroszkópos vizsgálata 40

3.8. A mechanoszenzitivitás és a hidegérzékenység vizsgálata 40

3.9. A plazma inzulin koncentrációk meghatározása 41

STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉS 42

ETIKAI VONATKOZÁSOK 42

FELHASZNÁLT KÉMIAI ANYAGOK 43

EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK 44

1. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK, VALAMINT

AZ AZOKBÓL FELSZABADULÓ SZENZOROS NEUROPEPTIDEK

SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA H2S-INDUKÁLTA VAZODILATÁCIÓBAN 44

1.1. EREDMÉNYEK 44

1.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 54

2. A TRPA1 RECEPTOR SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA AKUT ÉS

KRÓNIKUS LÉGÚTI GYULLADÁSMODELLEKBEN 61

2.1. EREDMÉNYEK 61

2.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 67

3. A HK-1 SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ENDOTOXINNAL KIVÁLTOTT

AKUT LÉGÚTI GYULLADÁSMODELLBEN 73

3.1. EREDMÉNYEK 73

3.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 77

4

4. PATKÁNY DIABÉTESZ MELLITUSZ MODELL KIFEJLESZTÉSE

A KRÓNIKUS SZÖVŐDMÉNYEK KOMPLEX VIZSGÁLATÁRA 82

4.1. EREDMÉNYEK 82

4.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS 92

ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA 96

IRODALMI HIVATKOZÁSOK 98

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK 117

EGYÉB EREDETI KÖZLEMÉNYEK 118

IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK 120

KONGRESSZUSI SZÓBELI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE 123

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS 126

5

RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE

4-ONE: 4-oxo-2-nonenal

AITC: allilizotiocianát

AUC: area under the curve = görbe alatti terület

BALF: bronchoalveolar lavage fluid = bronchoalveoláris mosófolyadék

BSA: bovine serum albumin = marha szérum albumin

CLR: calcitonin receptor-like receptor = kalcitonin receptor-szerű receptor

CGRP: kalcitonin gén-rokon peptid

CHO: Chinese Hamster Ovary = kínai hörcsög ovárium

CO: szén-monoxid

COPD: krónikus obstruktív tüdőbetegség

CSE: cigarette smoke extract = cigarettafüst kivonat

DN: diabéteszes neuropátia

DNP: diabéteszes nefropátia

DR: diabéteszes retinopátia

DRG: dorsal root ganglion = hátsó gyöki ganglion

EDTA: etilén-diamin-tetraecetsav

EKA/EKB/EKC/EKD: endokinin A/B/C/D

FITC: fluoreszcein-izotiocianát

GCL: ganglion cell layer = ganglionsejt réteg

H2S: hidrogén-szulfid

hHK-1: humán hemokinin-1

HK-1: hemokinin-1

HNE: 4-hidroxinonenal

HNO: nitroxil

i.p.: intraperitoneális

i.n.: intranazális

IBO: indirekt binokuláris oftalmoszkópia

IL-1β: interleukin-1β

IL-6: interelukin-6

ILM: inner limiting membrane = belső határmembrán

INL: inner nuclear layer = belső magvas réteg

6

IPL: inner plexiform layer = belső rostos réteg

KC/CXCL1: keratinocita kemoattraktáns/kemokin (C-X-C motívum) ligand 1

LBP: LPS binding protein = LPS kötő fehérje

LPS: lipopoliszacharid

MAPK: mitogén aktivált protein kináz

MCP-1: monocita kemoattraktáns protein-1

MIP-1α: makrofág inflammatorikus protein-1 alfa

NaCl: nátrium-klorid

NaHS: nátrium-hidrogénszulfid

NaOH: nátrium-hidroxid

NaSO3: nátrium-szulfát

NK1: neurokinin 1 receptor

NK2: neurokinin 2 receptor

NK3: neurokinin 3 receptor

NKA: neurokinin A

NKB: neurokinin B

NO: nitrogén-monoxid

OLM: outer limiting membrane = külső határmembrán

ONH: optic nerve head = látóidegfő, papilla

ONL: outer nuclear layer = külső magvas réteg

OPL: outer plexiform layer = külső rostos réteg

OS: outer segment = külső szegmens

PACAP: pituitary adenylate cyclase activating polypeptide = hipofízis adenilát cikláz aktiváló

polipeptid

PAS: perjódsav-Schiff

PB: foszfát puffer

PBS: foszfátpufferrel kiegészített fiziológiás sóoldat

PE: pigment epitélium

PEF: peak expiratory flow = kilégzés alatt elérhető maximális áramlási sebesség

PFA: paraformaldehid

PL: photoreceptor layer = fotoreceptor réteg

PNA: peanut agglutinin

RAMP1: receptor activity modifying protein 1 = receptor aktivitást módosító fehérje 1

RNS: reactive nitrogen species =reaktív nitrogén gyökök

7

ROI: region of interest = érdeklődésre számottartó terület

ROS: reactive oxygen species = reaktív oxigén gyökök

RTX: reziniferatoxin

s.c.: szubkután

SEM: standard error of mean = az átlag standard hibája

SP: substance P = P-anyag

STZ: streptozotocin

Tac1: tachykinin 1 gén = preprotachykinin A gén (PPT-A)

Tac3: tachykinin 3 gén = preprotachykinin B gén (PPT-B)

Tac4: tachykinin 4 gén = preprotachykinin C gén (PPT-C)

TH: tirozin-hidroxiláz

TLR4: Toll-like receptor 4

TNFα: tumor nekrózis faktor-alfa

TRG: trigeminus ganglion

TRPA1: Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1

TRPC1/TRPC6: Tranziens Receptor Potenciál Canonical 1/6

TRPV1: Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid 1

TRS: Total Retinal Score = össz retina pontszám

TV: tidal volume = légzési térfogat

VEGF: vaszkuláris endoteliális növekedési faktor

8

ÁLTALÁNOS BEVEZETÉS

1. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések és a neurogén gyulladás

A kapszaicin-érzékeny érzőidegek csoportját a hátsó gyöki és trigeminus ganglionok olyan

mielinhüvely nélküli (C-típusú), valamint vékony mielinhüvelyes (Aδ-típusú) rostokkal

rendelkező neuronjai alkotják, amelyek expresszálják a Tranziens Receptor Potenciál Vanilloid

1 (TRPV1) receptort. Ezek a polimodális nociceptorok a primer szenzoros afferensek kb. 50%-

át teszik ki (Holzer, 1991), és az idegrendszerben egyedülálló módon ún. „hármas funkciót”

képesek betölteni (Szolcsányi, 1996; 1. ábra). Elsődleges, klasszikus afferens funkciójuk a

nociceptív ingerek továbbítása a központi idegrendszer felé, melynek során az érzőideg-

végződések stimulációja és a következményes neuronális aktivitás eredményeképpen létrejön

a fájdalomérzet. A kapszaicin-szenzitív szenzoros neuronok ugyanakkor számos neuropeptidet

képesek termelni, és a peptiderg érzőideg-végződések aktivációja kétféle efferens hatást

eredményez: lokálisan ún. neurogén gyulladás alakul ki, szisztémásan viszont

gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító hatások figyelhetők meg.

A lokális efferens hatásként kialakuló neurogén gyulladás során az innervált terület

arterioláinak dilatációja, a plazmafehérjék kiáramlása és különböző gyulladásos sejtek

(leukociták, makrofágok és hízósejtek) aktivációja figyelhető meg (Szolcsányi, 1988). E

jelenségek létrejöttében az idegvégződésekből felszabaduló proinflammatorikus szenzoros

neuropeptidek játszanak kulcsszerepet, így elsősorban a kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP)

ill. a tachykininek képviselői, pl. a P-anyag (SP) és a neurokinin A (NKA) (Maggi és Meli,

1988; Holzer, 1988). Általánosan elfogadott, hogy míg a P-anyag és az NKA főként a

plazmaproteinek extravazációjáért felelős (Cao és mtsai., 2000), addig a neurogén vazodilatáció

közvetítésében elsősorban a CGRP játszik kulcsszerepet (Brain és mtsai, 1985). Fontos

ugyanakkor megemlíteni, hogy irodalmi adatok alapján az értágulat kialakulásának

közvetítésében valószínűsíthetően nem csak a CGRP, hanem a P-anyag és annak receptora, a

neurokinin 1 (NK1) tachykinin receptor is részt vesznek (Grant és mtsai, 2005).

A lokális neurogén gyulladás előidézése mellett a kapszaicin-érzékeny primer afferensek

szisztémás efferens funkcióval is rendelkeznek. Az érzőideg-végződésekből a fent említett

gyulladáskeltő vegyületeken kívül antiinflammatorikus neuropeptidek is felszabadulnak,

melyek a vérkeringéssel a test távolabbi pontjaira eljutva szisztémás gyulladáscsökkentő és

fájdalomcsillapító hatással rendelkeznek (Szolcsányi és mtsai., 1998a,b). Ilyen

9

antiinflammatorikus neuropeptidek például a szomatosztatin és a hipofízis adenilát cikláz

aktiváló polipeptid (PACAP), valamint különböző opioid peptidek (Pintér és mtsai., 2006;

Németh és mtsai., 2006; Helyes és mtsai, 2009).

1. ábra: A kapszaicin–szenzitív szenzoros neuronok hármas funkciója.

(Pintér és mtsai., Pharmacol Ther, 112: 440-56, 2006 alapján)

A kapszaicin hatásait közvetítő molekula, azaz a kapszaicin receptor létezését Szolcsányi János

már 1975-ben felvetette (Szolcsányi és Jancsó-Gábor, 1975), a molekula klónozására azonban

csak évtizedekkel később nyílt lehetőség, és először Vanilloid Receptor 1 (VR1)-nek nevezték

el (Caterina és mtsai., 1997). A később a Tranziens Receptor Potenciál (TRP) receptor

nagycsaládba sorolt, és azóta TRPV1-nek nevezett kationcsatornát polimodális szenzorként

tartjuk számon, hiszen aktivációja sokféle fizikai és kémiai inger hatására létrejöhet (Gunthorpe

és mtsai., 2002). A TRPV1 receptor nocicepcióban betöltött élettani jelentőségét mutatja, hogy

mind a fájdalmas intenzitású hőinger (>43°C), mind a szöveti pH savas tartományba történő

eltolódását kiváltó proton-koncentráció (pH<6) képes megnyitni az ioncsatornát (Tominaga és

mtsai., 1998). A receptort aktiváló kémiai vegyületek között meg kell említenünk a növényi

eredetű vanilloidokat, így a kapszaicin mellett a reziniferatoxint (RTX), a piperint és a gingerolt

(Pingle és mtsai., 2007), ugyanakkor ismert tény az is, hogy a receptornak több, a szervezetben

képződő endogén ligandja is van (pl. az endokannabinoidok közé sorolt anandamid ill.

különböző arachidonsav metabolitok) (Yoo és mtsai., 2014).

10

Mindezek mellett számos olyan vegyület is létezik, amelyek saját receptoraikon hatva

érzékenyíteni képesek a TRPV1 receptort (pl. a gyulladásos folyamatok során nagy

mennyiségben felszabaduló bradykinin, prosztaglandinok és proteázok), azaz az ioncsatorna

foszforilációja révén annak ingerelhetőségét megnövelik (Moriyama és mtsai., 2005; Szallasi

és mtsai., 2007). Fontos tudni, hogy a TRPV1-et aktiváló és érzékenyítő stimulusok egyidejű

jelenléte szinergista módon felerősítheti az egyes ingerek által kiváltott hatásokat (Surowy és

mtsai., 2010). A nem szelektív ioncsatornaként működő TRPV1 aktivációjának

eredményeképpen először Na+- és Ca2+-ionok áramlanak a sejtbe, melyet K+-kiáramlás követ.

A Na+-ionok beáramlása membrándepolarizációhoz, következésképpen akciós potenciál

kialakulásához vezet, melynek eredményeként kialakul a fájdalomérzet (l. klasszikus afferens

funkció). A Ca2+-influx pedig a perifériás idegvégződésből történő szenzoros neuropeptid

felszabaduláshoz vezet, melyek proinflammatorikus ill. antiinflammatorikus hatásaikat

lokálisan vagy a keringésbe jutva fejtik ki (l. lokális és szisztémás efferens funkció).

A neurogén gyulladás számos betegség kialakulásában játszik fontos szerepet, így például az

asztma, a reumatoid artritisz, a kontakt dermatitisz, az ekcéma és a migrén, valamint a

gyulladásos bél- és szembetegségek patomechanizmusaiban is (Pintér és mtsai., 2014).

2. A Tranziens Receptor Potenciál Ankyrin 1 (TRPA1) receptor

A kapszaicin-szenzitív szenzoros neuronok a TRP receptor család több tagját is expresszálják,

így többek között - az előzőekben már említett TRPV1 mellett - a Tranziens Receptor Potenciál

Ankyrin 1-et (TRPA1; Story és mtsai, 2003; Jordt és mtsai, 2004). A TRPA1 ioncsatornához

kapcsolt receptor a TRPA receptor alcsalád egyetlen képviselője, melyet a régebbi

nomenklatúra szerint az ANKTM1 (Ankyrin-Like With Transmembrane Domains Protein 1)

névvel illettek (Jaquemar és mtsai., 1999; Corey, 2003).

A TRPA1 szerkezetét tekintve egy nagyméretű transzmembrán protein - a humán fehérje 1119

aminosav hosszúságú és 127.4 kDa -, amelynek mind a C-, mind az N-terminusa a sejtmembrán

citoplazma felőli oldalán helyezkedik el (García-Anoveros és Nagata, 2007). A receptor

alegységeit egyenként 6 db, β-redő típusú transzmembrán domén alkotja. Az 5. és 6. doméneket

összekötő intracelluláris, hidrofób hurok képezi a csatornarégiót (Cvetkov és mtsai., 2011;

Chen és Hackos, 2015; 2. ábra). A receptor alegységei tetramerré alakulva alkotják a csatorna

komplexet. A TRPA1 jellegzetessége az ioncsatorna N-terminális régiójában található 16-17

db ankyrin ismétlődés, amelyről a receptor a nevét is kapta (Gaudet és mtsai., 2008; Cordero-

Morales és mtsai., 2011).

11

2. ábra: A TRPA1 receptor szerkezete.

(forrás: Chen és Hackos, Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 388: 451–463, 2015)

A TRPA1 jelentős mértékben koexpresszálódik a TRPV1 receptorral (Julius, 2013). Míg a

TRPA1-et expresszáló peptiderg primer afferensek 97%-án kifejeződik a TRPV1 receptor is,

addig a TRPV1-et expresszáló szenzoros neuronok membránjának legalább 30%-án, de egyes

adatok szerint akár kétharmadán is megtalálható a TRPA1 receptor (Story és mtsai, 2003;

Kobayashi és mtsai., 2005; Bodkin és Brain, 2010). A TRPA1 ezen kívül kolokalizálódik még

a CGRP-vel, a P-anyaggal és a bradykininnel is (Obata és mtsai., 2005; Chen és mtsai., 2012).

Ismert továbbá az is, hogy a TRPA1 heteromer receptorkomplexet képezhet a TRPV1-el,

melynek során a két receptormolekula funkcionálisan is interakcióba lép egymással. Ennek a

folyamatnak elsősorban a nocicepcióban, de a légúti gyulladás kialakulásában is fontos szerepet

tulajdonítanak (Staruschenko és mtsai., 2010; Lee és mtsai., 2015). Az utóbbi években

ugyanakkor nem csak a TRPV1-t, de a TRPA1 receptort is leírták nem neurális sejteken, így

például fibroblasztokon, urotél sejteken, keratinocitákon, makrofágokon és az agyi artériák

endotélsejtjein is (Jaquemar és mtsai., 1999; Streng és mtsai., 2008; Atoyan és mtsai., 2009;

Earley és mtsai., 2009; Fernandes és mtsai, 2012; Kun és mtsai., 2017).

A TRPA1 receptort különböző kémiai és fizikai ingerek képesek aktiválni. Az exogén és

endogén agonisták között legnagyobb számban elektrofil természetű vegyületeket kell

megemlítenünk (3. ábra). Előbbiek közé tartozik több növényi eredetű vegyület, így pl. a

mustárolaj csípős anyaga, az allilizotiocianát (AITC) (Jordt és mtsai., 2004; Macpherson és

mtsai, 2007), a fokhagymában megtalálható allicin (Bautista és mtsai., 2005; Macpherson és

mtsai., 2005) és a fahéj jellegzetes illatát adó fahéjaldehid (Macpherson és mtsai., 2006).

12

Ezeken kívül különböző eredetű mérgező gázok is képesek stimulálni a TRPA1-et, így pl. a

dohányfüstben, a kipufogó gázokban és a könnygázban megtalálható krotonaldehid és akrolein,

valamint a poliuretánok és peszticidek ipari gyártása során haszált izocianát tartalmú

vegyületek (Bautista és mtsai., 2006; Bessac és mtsai., 2009). A növényi eredetű vegyületek és

környezeti irritánsok mellett számos olyan, az emlős szervezetben endogén úton képződő

vegyületeket is ismerünk, amelyek aktiválják a TRPA1 receptort. Ezek közül főként az oxidatív

stressz során képződő reaktív oxigén szabadgyököket (ROS), illetve a különböző

lipidperoxidációs termékeket, pl. a 4-hidroxinonenalt (HNE) és a 4-oxo-2-nonenalt (4-ONE)

kell megemlítenünk (Trevisani és mtsai, 2007; Taylor-Clark és mtsai., 2008; Graepel és mtsai.,

2011).

A mustárolaj fahéj fokhagyma cigarettafüst kipufogógáz

allilizotiocianát fahéjaldehid allicin krotonaldehid akrolein

B oxidatív stressz: szabadgyökök és lipidperoxidációs termékek

hidrogén-peroxid 4-oxo-2-nonenal (4-ONE) 4-hidroxinonenal (4-HNE)

3. ábra: A TRPA1 receptor exogén (A) és endogén (B) aktivátorai.

(SuperPain Database, Charité Orvostudományi Egyetem, Berlin alapján)

A TRPA1 receptort fizikai ingerek is aktiválhatják, így pl. különböző mechanikai stimulusok

(Vilceanu és Stucky, 2010; Brierley és mtsai., 2011), valamint a fájdalmas hideg (<17°C). Ez

utóbbi feltételezés azonban erősen megosztja az irodalmat, ugyanis míg több publikáció is a

13

TRPA1 hidegérzékelésben betöltött fontos szerepe mellett érvel (Story és mtsai., 2003; Kwan

és mtsai., 2006; Karashima és mtsai., 2009), ismertek ezzel ellentétes adatok is (Jordt és mtsai.,

2004; Bautista és mtsai., 2006; Knowlton és mtsai., 2010). Az eltérő eredmények egy lehetséges

magyarázata, hogy a TRPA1 receptor elsősorban a patológiás körülmények között létrejövő

hideg allodíniában játszik szerepet, a fiziológiás hidegérzékelésben kevésbé (del Camino és

mtsai., 2010; Gentry és mtsai., 2010).

Működését tekintve a TRPA1 receptor ligand-függő nem-szelektív kationcsatorna, melynek

aktivációja során az AITC és a hozzá hasonló elektrofil vegyületek az ioncsatorna

intracellulárisan elhelyezkedő N-terminális részén található reaktív cisztein oldalláncokhoz

kötődnek (Pozsgai és mtsai., 2017). Ennek a reverzibilis kovalens módosulásnak

eredményeképpen jön létre a receptormolekula konformációváltozása és a csatorna nyílása

(Hinman és mtsai., 2006; Macpherson és mtsai., 2007), melyet a sejtmembrán depolarizációja

és az intracelluláris Ca2+-szint megemelkedése követ (Chen és Hackos, 2015). A TRPA1

receptor aktivációja nyomán szenzoros neuropeptidek, pl. P-anyag és CGRP szabadulnak fel

(Trevisani és mtsai, 2007), melynek eredményeképpen a TRPV1 aktivációjához hasonlóan

plazmafehérje extravazációval és vazodilatációval járó neurogén gyulladás jön létre (l.

korábban).

Ismert továbbá, hogy a nem szelektív módon működő TRPA1 receptort az intracelluláris Ca2+-

szint megnövekedése is képes közvetlenül aktiválni (Jordt és mtsai., 2004). Ez a folyamat

ugyanakkor az ioncsatorna más, indirekt módon történő aktiválásának is részét képezheti,

például bizonyos, a receptort érzékenyítő molekulák esetében. A TRPA1 ilyen modulátora

többek között a bradykinin, amely a saját membránreceptorához kötődve aktiválja a foszfolipáz

C (PLC) útvonalat (Bandell és mtsai., 2004). A szignalizáció során keletkező inozitol-

triszfoszfát (IP3) a Ca2+-ionok intracelluláris raktárakból történő felszabadulását idézi elő, míg

a diacil-glicerol (DAG) a kolokalizálódó TRPV1 receptor szenzitizációján keresztül az

extracelluláris Ca2+ beáramlását okozza, az így megemelkedett intracelluláris Ca2+-szint pedig

a TRPA1 megnyílásához vezet (Bautista és mtsai., 2006).

A TRPA1 receptor érrendszerben betöltött élettani szerepével kapcsolatban több adat is

rendelkezésre áll. Mezenteriális artéria preparátumokon már korábban kimutatták, hogy a

TRPA1 agonista allicin koncentráció-függő módon képes vazorelaxációt előidézni (Bautista és

mtsai., 2005), illetve hogy a fahéjaldehid által kiváltott vazodilatáció TRPA1-mediált folyamat

(Pozsgai és mtsai., 2010). Ezen kívül ismert, hogy az akrolein intranazális belélegzése a

meningeális erek dilatációjához vezet patkányban (Kunkler és mtsai, 2011), valamint hogy a

meningeális erek TRPA1 általi aktivációja a Ca2+-függő K+-csatornák megnyílását okozza

14

(Earley és mtsai, 2009). A növényi eredetű vegyületek és a környezeti irritánsok mellett

ugyanakkor a TRPA1 endogén aktivátoraként számontartott 4-ONE is képes vazodilatációt

előidézni, melynek közvetítésében a receptor mellett a szenzoros idegvégződésből felszabaduló

CGRP is részt vesz (Graepel és mtsai., 2011). Sőt, újabb adatok szerint a TRPA1 kulcsszerepet

játszik a hideg-indukálta vaszkuláris válaszreakció kialakulásában is (Aubdool és mtsai., 2014).

Mindezek ellenére a TRPA1 aktiváció vazodilatátor hatásának részletes mechanizmusai még

pontosan nem ismertek (Earley, 2012).

A tüdő gazdagon innervált a kapszaicin-szenzitív szenzoros rostokkal (Barnes, 1990; Watanabe

és mtsai., 2005), amelyek végződésein a TRPA1 receptor kolokalizálódik a TRPV1 receptorral

(Nassenstein és mtsai., 2008). A TRPA1 receptor légzőrendszerben betöltött funkcióját tekintve

hamar kiderült, hogy egyfajta kémiai szenzorként viselkedve fontos szerepet játszik a légúti

irritánsok érzékelésében és az ezek jelenlétére adott élettani válaszreakciók kialakulásában

(Bessac és Jordt, 2008). A TRPA1 receptor aktivátorainak jelentős részét olyan exogén eredetű

toxikus ágensek képezik, mint pl. az akrolein, a krotonaldehid, a nikotin és az izocianátok

(André és mtsai., 2008; Talavera és mtsai., 2009; Bessac és mtsai., 2009). Ezek a

cigarettafüstben, könnygázban és más mérgező gázokban megtalálható vegyületek a

fájdalomreakción kívül olyan protektív légúti reflexeket váltanak ki, mint pl. a köhögés és

tüsszentés, melyek segítségével a szervezet megszabadulni igyekszik a toxikus hatásoktól

(Geppetti és mtsai., 2010), így tehát a TRPA1 rövid ideig tartó stimulálása elsősorban védő

hatásúnak tekinthető (Chen és mtsai., 2012). Ugyanakkor a légzőrendszer krónikus gyulladásos

folyamatai során (pl. asthma bronchiale, COPD) endogén módon termelődnek olyan

lipidperoxidációs termékek (pl. HNE, Trevisani és mtsai., 2007), reaktív oxigén gyökök

(Andersson és mtsai., 2008), és más proinflammatorikus ágensek (pl. bradykinin,

izoprosztánok, peroxinitritek; Bessac és Jordt, 2008), amelyek szintén képesek stimulálni a

TRPA1 receptort. Az ioncsatorna ily módon létrejövő permanens aktivációja azonban – az

exogén irritánsok hatásaival ellentétben - különböző neurotranszmitterek és citokinek

felszabadulását idézi elő, amelyek aztán a neurogén gyulladást, mint egyfajta ördögi kört,

folyamatosan fenntartják (Chen és mtsai., 2012). Ezen kívül újabb adatok arra is utalnak, hogy

a TRPA1 receptor fontos szerepet játszik a bakteriális endotoxinok által kiváltott

fájdalomreakció és vaszkuláris válasz közvetítésében is (Meseguer és mtsai., 2014). Mindezek

alapján jogosan merül fel annak lehetősége, hogy a TRPA1 receptor fontos szerepet játszhat a

légzőrendszer akut és krónikus gyulladásos folyamataiban.

15

3. A kapszaicin-érzékeny rostokból felszabaduló neuropeptidek: a CGRP és a tachykinin

rendszer

3.1. A kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP)

A kalcitonin gén-rokon peptid (CGRP) egy 37 aminosavból álló peptid, amely egy családba

sorolható a kalcitoninnal, az adrenomedullinnal, az amylinnal és az intermedinnel (Poyner és

mtsai., 2002). Két izoformája létezik: a perifériás és a központi idegrendszerben előforduló α-

CGRP, valamint az enterális idegrendszerben megtalálható β-CGRP. A CGRP expresszióját

ezen kívül nem neuronális sejtekben, így például B-limfocitákban, makrofágokban és

endotélsejtekben is leírták (Russell és mtsai., 2014). A CGRP receptorát két peptid molekula

heterodimer komplexe alkotja: az egyik a 7 transzmembrán doménnel rendelkező kalcitonin

receptor-szerű receptor (CLR), a másik pedig az ún. receptor aktivitást módosító fehérje 1

(RAMP1) (Barwell és mtsai., 2012). A heptahelikális G-proteinhez kötött receptorok családjába

tartozó CLR hatásai az adenilát-cikláz enzim aktivációján keresztül valósulnak meg. A CGRP

ezen kívül képes aktiválni az adrenomedullin AM2 receptorát (CLR-RAMP3) is, bár az ehhez

a komplexhez mutatott affinitása jóval kisebb az adrenomedullinénál (Hay és mtsai., 2003).

A hátsógyöki ganglionsejtek ill. trigeminális neuronok perifériás végződéseiből stimuláció

hatására felszabaduló CGRP elsősorban a mikrocirkuláció szabályozásában vesz részt. A

perivaszkulárisan elhelyezkedő idegvégződésekból kiáramló peptid lokalizációjának

köszönhetően anélkül képes fokozni a regionális véráramlást, hogy nagyobb mennyiségben a

szisztémás keringésbe kerülne (Russell és mtsai., 2014). A CGRP extrémen potens

vazodilatátor molekula, mely hatásának fő anatómiai célpontjai a bőr és a trigeminovaszkuláris

rendszer érhálózata (Brain and Cox, 2006). A CGRP által kiváltott vazodilatáció mechanizmusa

lehet endotél-függő ill. attól független folyamat. Utóbbi esetben a Gs-protein által mediált

szignalizáció eredményeképpen megnyílnak az érfali simaizomsejten található ATP-függő K+-

csatornák (Nelson és mtsai., 1990); az endotélsejtben ugyanakkor aktiválódik a nitrogén-

monoxid szintáz, a termelődő nitrogén-monoxid (NO) pedig a simaizomsejtbe diffundálva

cGMP emelkedést, és ezáltal vazorelaxációt okoz (Gray és mtsai., 1992). A CGRP erőteljes

értágító hatásán kívül ismert az is, hogy képes fokozni az érpermeabilitást, bár ezt a funkcióját

nem közvetlenül, hanem a vele együtt felszabaduló P-anyag hatásának potencírozásával képes

kifejteni (Cao és mtsai., 2000). A CGRP molekula ezen kívül komplex immunmodulátor

hatásokkal is rendelkezik (Barnes, 2001).

16

3.2. A tachykinin rendszer és annak legújabb tagja, a hemokinin-1

A tachykininek családjába olyan, az ideg- és immunrendszerben széles körben expresszálódó

10-12 aminosav hosszúságú peptidek tartoznak, amelyek közös szerkezeti jellemzője a C-

terminális régióban megtalálható FXGLM-NH2 szekvencia (ahol az X-el jelölt aminosav

hidrofób tulajdonságú) (Steinhoff és mtsai., 2014). A tachykininek közül elsőként a P-anyagot

fedezték fel (von Euler és Gaddum, 1931), továbbá ide tartoznak még a neurokinin A (NKA)

és a neurokinin B (NKB), valamint a hemokininek és az endokininek (l. később). Az emlős

tachykinineket kódoló gének közül a preprotachykinin-A (PPT-A, Tac1) kódolja a P-anyagot

és az NKA-t, a preprotachykinin-B (PPT-B, Tac3) pedig az NKB-t (Nawa és mtsai., 1983;

Kotani és mtsai., 1986).

Ezek a neuropeptidek klasszikusan három különböző, ún. tachykinin receptorhoz kötődnek,

amelyekről ismert, hogy mindannyian membrán-kötött G-proteinhez kapcsolt receptorok. Ezek

a neurokinin 1 (NK1), a neurokinin 2 (NK2) és a neurokinin 3 (NK3) receptorok, melyeken a P-

anyag, az NKA és az NKB is teljes agonistaként viselkednek. Ismert ugyanakkor, hogy az itt

felsorolt három tachykinin mindegyike eltérő affinitással kötődik az egyes receptorokhoz

(Maggi, 1995). A tachykinin gének által kódolt peptideket ill. azok kötődési preferenciáit a 4.

ábra mutatja.

A P-anyagot jellemzően a hátsó gyöki és a trigeminus ganglionok primer afferens szenzoros

neuronjai expresszálják, ezen kívül jelen van a központi idegrendszerben és az enterális

neuronokban is (Lundberg, 1996; Shimizu és mtsai., 2008). Nem-neuronális expresszióját

illetően fontos megjegyezni, hogy a P-anyag megtalálható különböző immunsejtekben, pl.

makrofágokban és limfocitákban (Ho és mtsai., 1997; Lai és mtsai., 1998), de ezen kívül

endotélsejtekben, fibroblasztokban és keratinocitákban is leírták (Milner és mtsai., 2004; Liu

és mtsai., 2006). A P-anyag legnagyobb affinitással az NK1 receptorhoz kapcsolódik, és ennek

aktivációján keresztül számos biológiai hatást képes kifejteni. Legismertebb centrális hatása a

fájdalomérzet közvetítésében játszott moduláló szerepe (Zubrzycka és Janecka, 2000), melynek

során a gerincvelő hátsó szarvában felszabadulva fokozza a nocicepció közvetítésében

kulcsszerepet játszó glutamát hatását („wind-up jelenség”, centrális szenzitizáció; De Felipe és

mtsai., 1998; Latremoliere és Woolf, 2009). A P-anyag perifériás hatásai közül legfontosabb a

neurogén gyulladás során kialakuló érpermeabilitás fokozódás és plazmafehérje kiáramlás

közvetítése, valamint a fehérvérsejtek infiltrációjának és a hízósejtek degranulációjának

stimulálása (Grant, 2002), mely a posztkapilláris venulák endotélsejtjein, ill. különböző

gyulladásos sejteken expresszálódó NK1 receptorok aktivációján keresztül valósul meg (Regoli

és mtsai., 1994; Cao és mtsai., 1999). A P-anyag ezen kívül szerepet játszik még a vazodilatáció

17

kialakulásában (Grant és mtsai., 2005) és a trombocita funkciókban (Graham és mtsai., 2004),

továbbá részt vesz az enterális idegrendszer működésében (Shimizu és mtsai., 2008), illetve a

hányinger és hányás folyamatának létrejöttében is (Pintér és mtsai., 2014).

A Tac1 gén másik terméke az NKA, amely a P-anyaghoz hasonlóan elsősorban a kapszaicin-

érzékeny szenzoros neuronokban termelődik, és amely főként a simaizomsejteken

expresszálódó NK2 receptorhoz kötődik. Az NKA a P-anyaghoz hasonlóan fokozza a

plazmaprotein extravazációt, továbbá fontos szerepet játszik a respiratorikus és a

gasztrointesztinális rendszerben létrejövő simaizomkontrakció közvetítésében, valamint a

gyulladásos sejtek stimulációjában (Maggi, 1995; de Swert és Joos, 2006).

A Tac3 gén által termelt NKB, és annak fő receptora, az NK3 receptor elsősorban a központi

idegrendszerben expresszálódnak, ahol az NKB neurális aktivációs hatásokért felelős

(Lundberg, 1996), ugyanakkor ismert az NK3 receptor perifériás expressziója is (Page és mtsai.,

2000; Sanger és mtsai., 2006).

4. ábra: A tachykinin gének által kódolt peptidek, illetve azok kötődési preferenciái a

különböző tachykinin receptorokhoz. (Steinhoff és mtsai., Physiol Rev, 94: 265-301, 2014 alapján)

18

A tachykinin család legfrissebben felfedezett tagja a 2000-ben klónozott preprotachykinin C

(Tac4) gén, melynek expresszióját először B-limfocitákban írták le (Zhang és mtsai 2000). A

régebb óta ismert, konzervált struktúrájú tachykininekkel ellentétben a Tac4 a különböző

fajokban több, egymással rokon peptidet kódol, így például egérben és patkányban a

hemokinin-1-et (HK-1), emberben pedig a humán HK-1-et (hHK-1) és az endokininek

négytagú csoportját (EKA, EKB, EKC, EKD) (Page, 2004). A 11 aminosav hosszúságú HK-1

szerkezetileg nagyon hasonló a P-anyaghoz, melynek eredményeképpen erős immunológiai

keresztreakcióba lép különböző P-anyag ellenes antitestekkel (Graham és mtsai., 2004). Ez

utóbbi tény sajnos felveti azt a kérdést, hogy a különböző P-anyag ellenes antitestekkel végzett

kísérletek során vajon melyik peptid jelenlétét sikerült kimutatni, és egyúttal szükségessé teszi

a P-anyaggal kapcsolatos korábbi következtetések felülvizsgálatát is (Page, 2005).

A klasszikus tachykininekkel ellentétben a HK-1 elsősorban nem neurális szövetekben

expresszálódik. Bár a Tac4 gén kifejeződik néhány agyi régióban, mégis elsősorban a perifériás

szövetekben rendelkezik szignifikánsan magasabb expressziós szinttel a Tac1 génnel

összehasonlítva (Duffy és mtsai., 2003). Így megtalálható pl. gyulladásos és immunsejtekben,

T- és B-limfocitákban, makrofágokban és dendritikus sejtekben egyaránt (Zhang és mtsai.,

2000; Metwali és mtsai., 2004).

A HK-1 mindhárom NK receptoron teljes agonistaként viselkedik, de a P-anyaghoz hasonlóan

legnagyobb affinitással az NK1 receptorhoz kapcsolódik (Bellucci és mtsai, 2002; Kurtz és

mtsai, 2002). A HK-1 által kiváltott NK1 receptor aktiváció a gyulladásos és immunsejtek

differenciációját idézi elő, így fontos szerepet játszik a B- és T-sejtek fejlődésében egyaránt

(Berger és mtsai, 2010; Grassin-Delyle és mtsai, 2011; Cunin és mtsai, 2011). Mindezek alapján

feltételezhető, hogy a HK-1 elsősorban gyulladásos folyamatokban vesz részt, illetve hogy az

immunszabályozásban is fontos szerepe lehet.

Annak ellenére, hogy a P-anyag és a HK-1 közötti szerkezeti és immunológiai hasonlóság miatt

sokáig azt feltételezték, hogy a két peptid hasonló élettani funkciókat tölt be, a HK-1 által

közvetített hatások sok esetben eltérőek a P-anyag klasszikus hatásaitól (Borbély és Helyes,

2016). Ennek magyarázatául szolgálhat egyrészt az, hogy a HK-1 feltehetően egy, a P-

anyagétól eltérő kötőhellyel rendelkezik az NK1 receptoron, másrészt pedig az, hogy a HK-1

által kiváltott receptor aktivációs mechanizmusok és/vagy az általa aktivált szignalizációs

útvonalak is különböznek a P-anyagétól. Ezen kívül több adat is létezik arra vonatkozóan, hogy

a HK-1 hatásainak egy részéért valószínűleg nem az NK1 receptor felelős. Endo és munkatársai

a HK-1 termális hiperalgézia kialakulásában játszott szerepének vizsgálata során már

felvetették, hogy az valószínűleg az NK1 receptor aktivációjától függetlenül valósul meg (Endo

19

és mtsai, 2006). Ezt a feltételezést a munkacsoportunk átal végzett krónikus artritisz kísérletek

is megerősítették, ugyanis a perifériás gyulladás kialakulása során a HK-1 által kiváltott hatások

mechanizmusa függetlennek bizonyult az NK1 receptortól (Borbély és mtsai, 2013). Ismert tény

az is, hogy a klasszikus tachykininekétől eltérő C-terminális szerkezettel rendelkező EKC és

EKD igen alacsony affinitással kötődnek az eddig ismert NK receptorokhoz (Page és mtsai.,

2003). Mindezek alapján feltételezhető, hogy a HK-1 valószínűleg rendelkezik egy jelenleg

még nem azonosított, vélhetően saját receptorral.

A Tac4 gén által kódolt peptidek és a légzőrendszer kapcsolata az utóbbi években vetődött fel,

amikor a gén expresszióját humán bronchusban is leírták (Grassin-Delyle és mtsai, 2010),

illetve klinikai adatok is megjelentek arra vonatkozóan, hogy asthma bronchiale-ban szenvedő

betegekben összefüggés lehet a gyulladás mértéke és a Tac4 gén polimorfizmusa között (a Tac1

génnel azonban nem találtak ilyen összefüggést) (Klassert és mtsai, 2010).

Munkacsoportunk korábbi eredményei alapján ismert, hogy a Tac1 gén által kódolt

proinflammatorikus tachykininek fontos szerepet játszanak az akut légúti gyulladás

kialakulásában, ugyanakkor a P-anyag és az NKA ezen hatása feltehetően nem az NK1 receptor

aktivációján keresztül megy végbe (Helyes és mtsai, 2010). Ez a megfigyelés összhangban áll

azokkal az irodalmi adatokkal, melyek szerint a P-anyag által kiváltott hízósejt aktiváció az NK

receptoroktól függetlenül valósul meg (Lau és mtsai., 2001).

A Tac4 gén által kódolt tachykininek felfedezése, valamint ezeknek a peptideknek a légutakban

történő expressziója, továbbá az a tény, hogy a P-anyag és a HK-1 közötti strukturális és

immunológiai hasonlóság nagymértékben megnehezíti az egyes peptidek saját funkciójának

elkülönítését, joggal veti fel annak lehetőségét, hogy a tachykininek által a légutakban kifejtett

gyulladáskeltő hatások kórélettani mechanizmusában a hemokininek és endokininek csoportja

alkothatja a hiányzó láncszemet.

4. A hidrogén-szulfid és a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések kapcsolata

A hidrogén-szulfid (H2S) az emlős szervezetben megtalálható harmadik ismert gázmediátor a

nitrogén-monoxid (NO) és a szén-monoxid (CO) mellett (Wang R, 2012). Az utóbbi években

egyre több adat jelent meg a H2S biológiai szerepeit illetően (Kimura, 2014), így kiderült, hogy

szabályozó funkcióval rendelkezik többek között a kardiovaszkuláris rendszerben, valamint

gyulladásos folyamatokban is (Whiteman és Moore, 2009; Bhatia, 2010; Szabó és

Papapetropoulos, 2011; Kimura, 2011; Liu és mtsai, 2012; 5. ábra).

Az endogén úton termelődő H2S szintéziséért túlnyomórészt két enzim, a cisztationin- β-szintáz

(CBS) és a cisztationin-γ-liáz (CSE) felelős, az általuk katalizált reakciók során a H2S

20

elsősorban L-ciszteinből képződik (Stipanuk és Ueki, 2011). Az enzimek expressziós

mintázatát tekintve a CBS főként a központi idegrendszerben van jelen, a CSE viszont elsősor-

5. ábra: A H2S biológiai hatásai és az azokban részt vevő molekuláris mechanizmusok.

(Whiteman és mtsai., Clinical Science, 121: 459-88, 2011, ill. Calvert és mtsai., Antioxid Redox Signal 12:

1203-17, 2010 alapján)

21

ban a kardiovaszkuláris rendszerben expresszálódik (Guo és mtsai., 2013). Lokalizációjának

megfelelően feltételezhető, hogy a vaszkuláris hatásokat kiváltó endogén H2S termelődése

elsősorban a CSE által katalizált reakciónak köszönhető (Kiss és mtsai., 2008).

A H2S molekuláris célpontjai, illetve a hatásait közvetítő molekuláris mechanizmusok és

jelátviteli útvonalak még nem teljesen tisztázottak. Korábbi irodalmi adatok már felvetették,

hogy a simaizom- és szívizomszövetben kifejtett hatásait valószínűleg ioncsatornák közvetítik.

A H2S által kiváltott vazodilatáció feltételezett mechanizmusai között így például felmerült az

K+ATP-csatornák, a KCNQ-típusú feszültségfüggő K+-csatornák, a Cl- csatornák és a Cl-/HCO3-

csatornák aktivációja, illetve a feszültségfüggő Ca2+-csatornák modulációja is (Al-Magableh és

Hart, 2011; Liang és mtsai, 2011; Schleifenbaum és mtsai, 2010). Ezen kívül az oxidatív

foszforiláció és az ATP-szintézis gátlása is hozzájárulhat az értágulat kialakulásához (Kiss és

mtsai, 2008). A H2S-ról ugyanakkor az is kiderült, hogy képes a fehérjék cisztein oldalláncait

S-szulfhidrációval megváltoztatni (Mustafa és mtsai, 2009). Ez utóbbi folyamat

feltételezhetően szerepet játszik a H2S ioncsatornákra kifejtett hatásaiban.

A H2S és a kapszaicin-szenzitív szenzoros neuronok kapcsolatát először tüdőben mutatták ki

(Prior és mtsai, 1990). Később fény derült a gázmediátor simaizomszövetben kifejtett hatásaira

is, melyet egyrészt a vizeletelvezető rendszerben (Patacchini és mtsai, 2004; Fernandes és

mtsai, 2013), másrészt izolált patkány mezenteriális artériákban írtak le (White és mtsai, 2013).

A H2S és a TRPA1 receptor közötti interakció lehetősége először akkor merült fel, amikor

TRPA1 receptort expresszáló kínai hörcsög ovárium (CHO) sejtekben H2S-stimulusra Ca2+-

jelet tudtak kimutatni (Streng és mtsai, 2008). Hátsó gyöki ganglion (DRG) sejtekben a [Ca2+]i

emelkedése elmaradt a kívülről beadott Ca2+ hiánya, illetve a szelektív TRPA1 receptor

antagonista HC-030031 alkalmazása esetén. Ugyanakkor a TRPV1 antagonista adása, valamint

a feszültségfüggő Ca2+-csatornák gátlása nem befolyásolta ezt a válaszreakciót (Miyamoto és

mtsai, 2011). Mindezek alapján felvetődött, hogy a H2S a kapszaicin-érzékeny szenzoros rostok

és az azokon kifejeződő TRPA1 ioncsatornák lehetséges endogén aktivátora.

Fontos megemlítenünk azt is, hogy H2S-ból oxigén jelenlétében poliszulfidok képződhetnek

(Kimura és mtsai., 2013), illetve, hogy a H2S-donorok többsége vizes oldatban poliszulfidokat

is tartalmaz (Greiner és mtsai., 2013). Ezek a poliszulfid vegyületek nagy valószínűséggel

befolyásolják a H2S-hatások közvetítésének molekuláris folyamatait, illetve feltehető, hogy a

korábban a H2S-nak tulajdonított hatások egy részéért maguk a poliszulfidok felelősek (Pozsgai

és mtsai., 2017).

22

5. A diabétesz mellitusz krónikus szövődményei és a peptiderg primer afferensek

kapcsolata, valamint a komplikációk megfelelő modellezésének problémái

2015-ben becslések szerint 415 millió ember szenvedett diabétesz mellituszban a világon, és

kb. 5 millió fő halt meg a betegség valamilyen szövődményében. A diabétesz krónikus

szövődményei, így például a diabéteszes retinopátia, nefropátia és neuropátia rontják az

életminőséget és fokozzák a mortalitást (Candrilli és mtsai, 2007; Deshpande és mtsai, 2008).

A diabéteszes retinopátia (DR) a betegek 50-75%-ában fordul elő, és a kórkép végstádiumában

5%-ban vezet vaksághoz (Engerman és Kern, 1995). A DR kialakulásának esélye szoros

összefüggésben áll a diabétesz fennállásnak időtartamával, valamint a rossz glikémiás

kontrollal (Yau és mtsai., 2012). A diabéteszes nefropátia (DNP) a betegek 30-40%-át érinti,

és a krónikus vesebetség, valamint a dialízis-függő végstádiumú veseelégtelenség vezető oka

manapság (Gross és mtsai., 2005; Reutens és Atkins, 2011). A páciensek kb. egyharmadában

alakul ki diabéteszes neuropátia (DN), és kb. 13% azok aránya, akik egyidejűleg érintettek DR-

val és DN-val. Ezek a szövődmények természetesen csökkent munkaképességet okoznak és az

egészségügyi rendszer fokozott igénybevételével járnak (Candrilli és mtsai, 2007).

Annak ellenére, hogy a kapszaicin-szenzitív primer afferensek és a DN közötti kapcsolatról

eleinte ellentmondásos adatok jelentek meg az irodalomban (Khan és mtsai., 2002), az

érzőideg-végződéseken expresszálódó TRPV1 receptornak a neuropátiát kísérő termális és

mechanikai hiperalgézia kialakulásában betöltött szerepét több publikáció is megerősítette

(Kamei és mtsai., 2001; Pabbidi és mtsai., 2008). Sőt, újabb adatok szerint a TRPV1-el

kolokalizálódó másik ioncsatorna, a TRPA1 aktivációja is fontos szerepet játszhat a DN

kialakulásában (Koivisto és mtsai., 2012). Ismert tény továbbá, hogy az érzőideg-

végződésekből felszabaduló P-anyag és NKA, valamint az NK1 receptor szintén részt vesznek

a streptozotocinnal kiváltott diabéteszt kísérő neuropátiás fájdalom szindrómában (Coudoré-

Civiale és mtsai., 2000). Munkacsoportunknak a TRPV1 génhiányos egerekkel végzett

kísérletei alapján ugyanakkor valószínűsíthető, hogy krónikus polineuropátiás állapotban a

TRPV1 aktivációja bizonyos ellenregulációs mechanizmusok beindítása (feltehetően a

szomatosztatin felszabadulása) révén antinociceptív hatást képes kifejteni (Bölcskei és mtsai.,

2005).

Egyre több adat lát ugyanakkor napvilágot azzal kapcsolatban, hogy a TRP ioncsatornák nem

csak a DN, hanem a DNP kórélettani mechanizmusaiban is fontos szerepet játszhatnak (Colsoul

és mtsai., 2013). Egyes adatok szerint a DNP kialakulása összefüggésben állhat a Tranziens

Receptor Potenciál Canonical 1 (TRPC1) gén polimorfizmusával (Nilius és Szallasi, 2014),

illetve kimutatták azt is, hogy előrehaladott nefropátiában csökken a TRPC1 expressziója

23

(Zhang és mtsai, 2009). Ennek a receptorcsaládnak egy másik tagja, a TRPC6 nagy

valószínűséggel fontos szerepet játszik a veseglomerulusban található podocitáknak a diabétesz

hatására létrejövő patológiás elváltozásaiban (Ilatovskaya és mtsai., 2015). Ezen kívül a DNP

során létrejövő morfológiai és immunológiai változásokat nagymértékben enyhíti a szenzoros

idegvégződésekből felszabaduló, antiinflammatorikus hatásokkal rendelkező PACAP (Bánki

és mtsai., 2013).

A különböző szenzoros neuropeptideknek a DR kialakulásában betöltött szerepére utalnak azok

az adatok, amelyek az endogén SP- ill. CGRP-termelés csökkenését, ezzel párhuzamosan pedig

az apoptotikus sejtek mennyiségének növekedését mutatták ki diabéteszes retinákban (Yang és

mtsai., 2013a; Yang és mtsai., 2013b). Ezen kívül ismert tény az is, hogy a szomatosztatin

expressziójának és termelődésének csökkenése már a humán DR korai fázisában bekövetkezik

(Carrasco és mtsai., 2007), továbbá hogy a különböző szomatosztatin analógok alkalmazása

kedvezően befolyásolja a preproliferatív DR progresszióját (Krassas és mtsai., 2007). A

szomatosztatin mellett a PACAP is védő hatásúnak bizonyult DR-ban, ugyanis képes

csökkenteni mind a fotoreceptor sejtek, mind a dopaminerg amakrin sejtek, mind pedig a

ganglionsejtek pusztulásának mértékét (Szabadfi és mtsai., 2012).

A diabétesz különböző szövődményeinek kezelésére szolgáló gyógyszerek kifejlesztése során

a preklinikai fázisban nagyon nagy szükség van olyan megbízható állatmodellekre, amelyek

korrelálnak a humán betegségben észlelhető elváltozásokkal. Az utóbbi években több

összefoglaló közlemény is megjelent a diabéteszes szemelváltozások, illetve a diabéteszes

nefropátia és neuropátia vizsgálatára szolgáló, jelenleg elérhető módszerekről (Breyer és mtsai.,

2005; Obrosova és mtsai., 2006; Freeman és mtsai., 2009; Robinson és mtsai., 2012; Islam,

2013; Jo és mtsai., 2013; Kong és mtsai., 2013). Ugyan az irodalomban számos diabétesz

modell ismeretes (Szabadfi és mtsai., 2014), ezek közül mégis kevés alkalmas a krónikus

hiperglikémia-függő szövődmények alapos vizsgálatára.

Az irodalomban eddig fellelhető kísérleti modellek legfőbb hátránya, hogy az antidiabetikus

terápia teljes hiányában a kísérleti állatok rendkívül gyenge fizikális státusza igen gyors

állapotromláshoz, valamint ebből következően nagyon rövid túlélési időhöz vezet (Fox és

mtsai., 1999). Ellentétben a diabétesz rövid távú, inzulinkezelést nélkülöző állatmodelljeivel,

melyek gyakorlatilag mindig rendkívül súlyos kórállapotokat idéznek elő (Chen és mtsai.,

2005), jelen tanulmányunk célja az volt, hogy egy olyan krónikusan fenntartható diabétesz

modellt hozzunk létre, amely jobban hasonlít a humán betegség komplikációinak

progressziójához. Ezeket az állatkísérletes körülményeket kellő ideig kell fenntartani ahhoz,

hogy funkcionálisan és morfológiailag észlelhető diabétesz-függő szövődmények

24

kialakuljanak. Ezért fontosnak tartottuk, hogy olyan kísérleti elrendezést alkalmazzunk, amely

az állatok tolerálható fizikális állapota mellett lehetőséget ad a krónikusan fennálló diabétesz

mellitusz során kialakuló komplikációk modellezésére, amelyre elsősorban a szuboptimális

glikémiás kontroll elérése ad lehetőséget.

A betegség fennállásának időtartama mellett a krónikus diabéteszes szövődmények

kialakulásának másik rizikófaktora a hiperglikémia súlyossága (Calcutt, 2004). A bőr alá

beültethető, folyamatos adagolást biztosító inzulinpumpák kifejlesztése új perspektívákat

nyitott meg a diabéteszes betegek ellátásában (Ward és mtsai., 2011). Ez a technikai áttörés

ugyanakkor lehetőséget ad arra, hogy a gyógyszerfejlesztés preklinikai fázisában a glikémiás

állapotok egész skáláját hozzuk létre és tegyük vizsgálhatóvá.

6. A szenzoros-immun interakciók jelentősége különböző szervrendszerek

megbetegedéseiben

Az ideg- és immunrendszer működése között fennálló kölcsönhatásoknak a különböző

patológiás állapotok kialakulásában betöltött szerepét eddig főként autoimmun és neurológiai

betegségekben vizsgálták (Otmishi és mtsai., 2008). Egyre több adat szól ugyanakkor amellett,

hogy más szervrendszerek megbetegedéseiben is szerepet játszhatnak. A szenzoros-immun

interakciók jelentőségét az érrendszerben nem csak a szisztémás keringés rendellenességeinek

(Abboud és mtsai., 2008), de a bőr lokális vaszkuláris betegségeinek (Aubdool és Brain, 2011)

létrejöttében is leírták. Továbbá feltehető, hogy a légzőrendszer akut és krónikus

megbetegedései (Otmishi és mtsai, 2008), valamint a diabéteszes neuropátia és retinopátia

(Bennett, 1999; Yu és mtsai., 2015) kialakulásához is hozzájárulnak.

Tekintettel arra, hogy a kapszaicin-érzékeny primer afferensek, ill. a neuronális és nem-

neuronális struktúrákon megtalálható TRP ioncsatornák és neuropeptidek fontos szerepet

játszhatnak a különböző keringési, légúti és metabolikus megbetegedésekben, és ezáltal

potenciális farmakológiai célpontokként szolgálhatnak, fontosnak tartottuk ezen

mechanizmusok állatkísérletes modellezését és in vivo vizsgálatát.

25

CÉLKITŰZÉSEK

A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések, a TRPA1 és TRPV1 receptorok, valamint a

különböző neuropeptidek szerepére fókuszálva PhD-munkám célkitűzései a következők voltak:

I. A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések szerepének meghatározása a H2S által

kiváltott vazodilatációs válaszban egérbőrben. Munkám első részének célja az volt, hogy

feltárjuk a kapszaicin-érzékeny primer afferensek, valamint a rajtuk expresszálódó TRPA1

és TRPV1 ioncsatornák szerepét a NaHS-dal kiváltott véráramlás fokozódásban. Ezen kívül

kíváncsiak voltunk arra is, hogy a szenzoros rostokból felszabaduló CGRP és P-anyag

milyen mértékben vesznek részt ebben a folyamatban. E vizsgálatainkat lézer Doppler

képalkotó technikával, farmakológiai eszközök és genetikailag módosított egerek

segítségével végeztük.

II. A TRPA1 receptor szerepének analízise akut és krónikus légúti gyulladásos

mechanizmusokban. Mivel a TRPA1 receptor a tüdőt gazdagon beidegző kapszaicin-

érzékeny idegvégződéseken, valamint gyulladásos- és immunsejteken is előfordul, ráadásul

számos gyulladásos mediátorral aktiválható, fontosnak tartottuk ezen ioncsatornák

szerepének komplex vizsgálatát akut és krónikus légúti gyulladásmodellekben TRPA1

génhiányos egerek segítségével.

III. A Tac4 gén által kódolt hemokinin-1 szerepének vizsgálata endotoxinnal kiváltott akut

pneumonitisz modellben. Ahhoz, hogy a HK-1 jelentőségét tisztázzuk az endotoxinnal

kiváltott légúti gyulladásban, illetve össze tudjuk hasonlítani a P-anyag korábban leírt

szerepével, komplex vizsgálatot végeztünk genetikailag módosított, Tac4 génhiányos egerek

segítségével. Ehhez funkcionális, morfológiai, biokémiai, immunológiai módszerek mellett

felhasználtuk a legmodernebb in vivo optikai képalkotó technikákat is.

IV. A diabétesz mikrovaszkuláris és szenzoros szövődményeinek vizsgálatára alkalmas

krónikus patkánymodell beállítása és optimalizálása. Célul tűztük ki, hogy az emberi

DR-hoz, DNP-hoz ill. DN-hoz hasonló, hiperglikémia-függő patológiai elváltozásokat

hozzunk létre patkányban oly módon, hogy a kísérleti állatok hosszú távon fenntartott

közepes fokú hiperglikémia mellett is elfogadható egészségi állapotban maradjanak. Egy

ilyen állatmodellben a humán diabéteszben észlelt szövődményekkel korreláló, kvalitatív és

kvantitatív módon jellemezhető patológiai állapotok alakulnak ki.

26

KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

KÍSÉRLETI ÁLLATOK

A mikrocirkulációs vizsgálatokat 20-30 g súlyú, azonos korú hím és nőstény Balb/c, C57BL/6

(Charles-River, Magyarország) vad típusú, TRPA1 receptor génhiányos (TRPA1-/-, Bautista és

mtsai, 2006), TRPV1 receptor génhiányos (TRPV1-/-, Jackson Laboratories, Egyesült Államok)

és NK1 receptor génhiányos (Tacr1-/-, De Felipe és mtsai., 1998; Laird és mtsai., 2000), valamint

CGRP vad típusú (CGRP+/+) és CGRPgénhiányos (CGRP-/-, Salmon és mtsai.,

1999; Smillie és mtsai., 2014) egereken végeztük. Az akut és krónikus légúti

gyulladásmodellekben 8-10 hetes hím és nőstény C57Bl/6, TRPA1+/+ vad típusú, illetve

TRPA1-/- és Tac4 génhiányos (Tac4-/-, Berger és mtsai, 2010) egereket használtunk (20-25 g).

Munkacsoportunkkkal történő kollaboráció keretén belül az eredeti TRPA1+/- heterozigóta

tenyészpárokat Prof. Pierangelo Geppetti (Firenze), míg az NK1 receptor génhiányos egereket

Prof. John Quinn (Liverpool), a Tac4-/- egereket pedig Alexandra Berger (Toronto) bocsátotta

rendelkezésünkre. A génhiányos egerek genetikai hátteréül a C57Bl/6 törzs szolgált alapul, a

kísérletekbe bevont egerek genotipizálása PCR módszerrel történt. A diabétesz mellitusz

indukciója 6-8 hetes hím Sprague-Dawley CFY patkányokon történt (180-200 g). Az állatok

tenyésztése és tartása a -CGRP+/+ és -CGRP-/- egerek esetében a londoni King’s College

Állatházában, a Sprague-Dawley CFY patkányok esetében a PTE ÁOK Központi Állatkísérleti

Laboratórium Állatházában, míg a többi állat esetében a PTE ÁOK Farmakológiai és

Farmakoterápiai Intézet Állatházában történt standard patogénmentes környezetben, 24-25°C-

os állandó hőmérsékleten, 12 órás megvilágítás mellett, normál élelemmel és vízzel korlátlanul

ellátva.

KÍSÉRLETI MODELLEK ÉS PARADIGMÁK, VIZSGÁLATI MÓDSZEREK

1. A mikrocirkuláció vizsgálata során alkalmazott protokollok és módszerek

1.1. A kapszaicin-érzékeny érzőidegek funkcionális inaktiválása RTX-

deszenzibilizációval

A kapszaicin-szenzitív szenzoros neuronok H2S-dal ill. AITC-tal kiváltott vazodilatációban

betöltött szerepének vizsgálatához a C57Bl/6 típusú egerek egy csoportját reziniferatoxinnal

(RTX) kezeltük elő. A marokkói kutyatejfélében (Euphorbia resinifera) megtalálható RTX a

TRPV1 receptor ultrapotens agonistájaként képes aktiválni ezeket az afferens rostokat (Elekes

27

és mtsai., 2007). Az előkezelés során az állatok 5 egymást követő napon keresztül emelkedő

dózisú (10, 20, 30, 70 és 100 μg/kg) RTX-t kaptak szubkután (s.c.). (Az oldatokat abszolút

etanolban készített 1 mg/ml koncentrációjú törzsoldatból higítottuk fiziológiás sóoldattal.)

Ezzel a szisztémás RTX-kezeléssel a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződéseket testszerte

működésképtelenné tettük (deszenzibilizáció), ugyanis az RTX magas dózisainak ismételt

adása az intracelluláris Ca2+ mitokondriumokban történő akkumulációjához vezet, mely végül

a sejtek metabolikus károsodását idézi elő (Szolcsányi és mtsai., 1990; 6. ábra). A szisztémás

RTX-deszenzibilizáció eredményességét 50 μl 0.1%-os kapszaicin oldat szembe

cseppentésével ellenőriztük (“wiping test”, Helyes és mtsai., 2004), és akkor fogadtuk el, ha ez

a kezelés nem váltott ki elhárító reakciót az állat részéről. Az RTX-kezelt állatokkal kapott

eredményeket intakt kontroll C57Bl/6 társaikéval hasonlítottuk össze.

6. ábra: Az RTX-deszenzibilizáció molekuláris mechanizmusa.

(Anand és Bley, Br J Anaesth, 107: 490-502, 2011 alapján)

1.2. A H2S hatásaiban részt vevő molekuláris mediátorok vizsgálata genetikai és

farmakológiai módszerekkel

Az in vivo vizsgálatok következő részében először genetikailag módosított egerek segítségével

vizsgáltuk a TRPA1 és TRPV1 receptoroknak a H2S-dal ill. AITC-tal kiváltott vazodilatációban

betöltött szerepét. A TRPA1 és TRPV1 génhiányos egerekkel végzett kísérletek eredményeit

C57BL/6 társaikéhoz hasonlítottuk.

A TRPA1 receptor szerepének alaposabb vizsgálatához farmakológiai gátlást végeztünk a

továbbiakban, melyhez a szelektív TRPA1 receptor antagonista HC-030031-at alkalmaztuk. A

28

HC-030031-t először dimetilszulfoxidban (DMSO) oldottuk fel, melyből 100 mmol/l

koncentrációjú törzsoldatot készítettünk. A kísérletek során ezt tovább higítottuk, és a

felhasznált oldatok 10% DMSO-t, 5% Tween 80-t és 85% fiziológiás sóoldatot tartalmaztak. A

Balb/c egerek 30 perccel a NaHS lokális alkalmazása előtt intraperitoneálisan (i.p.) kapták az

antagonistát (30-100 mg/kg, Silva és mtsai., 2011); a HC-030031-el kezelt állatok eredményeit

a vehiculummal kezelt társaikéval hasonlítottuk össze.

A gyulladáskeltő szenzoros neuropeptidek H2S-indukálta vazodilatációban betöltött szerepét

először genetikailag módosított, α-CGRP-/-, illetve NK1 receptorral nem rendelkező Tacr1-/-

egereken vizsgáltuk. Az α-CGRP-/- állatokkal kapott eredményeket α-CGRP+/+, míg a Tacr1-/-

egerekkel kapott eredményeket C57Bl/6 társaikéhoz hasonlítottuk.

Ezt követően a szisztémás farmakológiai gátlást az i.p. alkalmazott CGRP receptor antagonista

BIBN4096-al, az NK1 receptor antagonista CP99994-el, illetve a kettő kombinációjával

végeztük el. A BIBN4096-ot 5% DMSO, 5% Tween 80 és 90% fiziológiás sóoldat keverékében

oldottuk fel, és 0.1-1-10 mg/kg koncentrációkban adtuk (Starr és mtsai., 2008; Hirsch és mtsai.,

2013), a fiziológiás sóoldatban feloldott CP99994-et pedig 10-25-50 mg/kg koncentrációkban

alkalmaztuk (McLean és mtsai., 1993; Rupniak és mtsai., 1995). A különböző típusú

antagonista kezeléseket Balb/c egereken végeztük 30 perccel a NaHS adása előtt, a kapott

eredményeket pedig a vehiculummal kezelt társaikéhoz hasonlítottuk.

A K+ATP-csatornáknak a H2S-indukálta véráramlás fokozódásban betöltött szerepét Balb/c

egereknek injektált K+ATP-csatorna blokkoló glibenklamiddal vizsgáltuk (i.p., 50 mg/kg,

oldószer: 5% DMSO, 5% Tween 80 and 90% fiziológiás sóoldat keveréke), a mérési

eredményeket a vehiculummal kezelt csoportéval hasonlíottuk össze.

1.3. A bőr véráramlásának vizsgálata egérfülön

A fülbőr mikrocirkulációjának in vivo történő vizsgálatát lézer Doppler képalkotó technika

segítségével végeztük (Periscan PIM-II, Perimed, Svédország; Full-field Laser Perfusion

Imager, FLPI, Moor Instruments, Egyesült Királyság). Ehhez a kísérleti egereket ketaminnal

(100 mg/kg, s.c.) és xilazinnal (5 mg/kg, s.c.) elaltattuk, testhőmérsékletüket pedig melegítőlap

segítségével állandó 38°C-on tartottuk (7. ábra).

A vizsgálat során a műszer az állat fejéről készített natív fotót és perfúziós felvételt. A Doppler-

effektus lényege, hogy a mozgásban lévő vörösvértestekről visszaverődő lézerfény frekvenciája

megváltozik, és a frekvenciaeltolódás a mozgó vörösvértestek sebességével arányos. Az ezen

elv alapján kapott véráramlási értékek színkód segítségével vizuálisan is megjeleníthetők. A

29

fekete és a sötétkék színnel jelölt területeken alacsony perfúzió mérhető, míg a zöld, sárga és

piros színek az egyre fokozódó véráramlású területeket jelölik.

7. ábra: A bőr mikrocirkulációjának mérése altatott állaton lézer Doppler imager

készülékkel.

Az egérfülek alap véráramlásának meghatározásához három kontroll felvételt készítettünk,

majd a jobb egérfül dorzális felszínét NaHS-dal, mustárolajjal (AITC), NaOH-dal, NaSO3-tal

vagy NaCl-dal kezeltük, míg a bal fület a kezelésnek megfelelő vehiculummal kentük be. Ezt

követően - a mikrocirkuláció változásainak eltérő kinetikája miatt - a véráramlás vizsgálatokat

50 percen keresztül végeztük a NaHS, NaOH, NaSO3 és NaCl esetében, illetve 30 percen

keresztül az AITC esetében.

A lézer Doppler által vizsgált terület 30x64 képpontból állt, melynek szkennelése 2 percet vet

igénybe. Ez a kísérleti beállítás a két fül és a fej egyidejű megjelenítését tette lehetővé. A

szkennelt területen belül kijelöltük a két fület, mint ún. „regions of interest”-et (ROIs),

melyeken a kvantitatív méréseket végeztük (8. ábra). A fülbőr véráramlásának

meghatározásakor a regisztrált átlagos mikrocirkuláció értékeket a három kontroll felvétel

átlagához hasonlíottuk, a mikrocirkuláció változását pedig a kezdeti véráramlás értékének

százalékában adtuk meg. Ahhoz, hogy a szisztémás vérkeringés változásai ne befolyásolhassák

a méréseket, a vehiculummal kezelt bal fülek perfúziós értékeit kivontuk a NaHS-, AITC-,

NaOH-, NaSO3- ill. NaCl-kezelt jobb fülek véráramlás értékeiből. A vizsgált bőrterület által a

30

teljes mérési idő alatt adott érválasz méréséhez az időfüggést ábrázoló grafikonok görbe alatti

területeinek (area under the blood flow curves, AUCs) kvantifikáltuk.

Perfúziós kép

Fotó Regions of interest

(ROIs)

8. ábra: A lézer Doppler imager által készített natív és perfúziós felvételek, melyeken az

egérfüleket, mint vizsgálati területeket, azaz „regions of interest”-et (ROIs) kijelöltük.

1.4. A bőr vazodilatációjának kiváltása egérfülön

A vazodilatáció kiváltásához a jobb fül dorzális felszínét NaHS-dal (15 μl, 5%, pH=12.61) vagy

a mustárolajban megtalálható AITC-tal (15 μl, 2%) kezeltük. A hidrogén-szulfid donor nátrium-

hidrogénszulfidot (NaHS) 1.25% metilcellulózt tartalmazó fiziológiás sóoldatban, míg az

AITC-t folyékony paraffinban oldottuk fel. Ahhoz, hogy a pH és az ozmotikus nyomás

esetleges nem specifikus fizikai-kémiai hatásait kizárjuk, a Balb/c egerek egy-egy csoportjában

a NaHS-oldat pH-jával megegyező pH-jú NaOH-oldatot (15 μl, 0.16%, pH=12.61), valamint a

NaHS-oldat koncentrációjával megegyező sókoncentrációjú NaSO3- (15 μl, 5%) és NaCl-

oldatokkal (15 μl, 5%) kentük be az állatok jobb fülét. Mindhárom anyagot 1.25%

metilcellulózt tartalmazó fiziológiás sóoldatban oldva készítettük el. Az ellenoldali füleket 15

μl 1.25% metilcellulózt tartalmazó fiziológiás sóoldattal ill. ugyanennyi mennyiségű folyékony

paraffinnal kentük be, melyek vehiculummal kezelt kontrollként szolgáltak.

31

2. Az akut és krónikus légúti gyulladásmodellek alapelve és a vizsgálatok során

alkalmazott módszerek

2.1. Endotoxinnal kiváltott akut légúti gyulladásmodell

Az akut intersticiális pneumonitiszt 60 µl, 167 µg/ml koncentrációjú Escherichia coli (O83

szerotípus) endotoxin (lipopoliszacharid, LPS) intranazális (i.n.) alkalmazásával váltottuk ki

éteres altatásban, míg az intakt egerek azonos mennyiségű steril foszfátpufferrel kiegészített

fiziológiás sóoldatot (PBS) kaptak (Helyes és mtsai, 2010) (9/A ábra).

9. ábra: Az endotoxin intranazális beadása (A) és az LPS hatásmechanizmusa (B).

Az endotoxin a Gram-negatív baktériumok sejtfalának alkotóeleme, amely egy foszfoglikolipid

(lipid A) részből és egy ahhoz kovalensen kapcsolódó hidrofil heteropoliszacharid részből áll

(Rietschel és mtsai., 2000). Az LPS egy specifikus akut fázis fehérjével (LPS binding protein,

LBP) összekapcsolódva képes kötődni a makrofágokon és a monocitákon megtalálható Toll-

like receptor 4 (TLR4)-CD14 glikoprotein komplexhez (Poltorak és mtsai., 1998), ezen

keresztül aktiválja a p38-MAPK jelátviteli útvonalat, melynek eredményeképpen az

immunsejtek aktivációja és akkumulációja következik be (Haddad és mtsai., 2001; Togbe és

mtsai., 2007). Az aktiválódó immunsejtekből gyulladásos citokinek szabadulnak fel, így pl.

tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α), interleukin 1-béta (IL-1β), interleukin 6 (IL-6) és

keratinocita kemoattraktáns (KC) (Ulich és mtsai., 1991a; Ulich és mtsai., 1991b; Togbe és

mtsai., 2007). Ráadásul ezekből a sejtekből más, proinflammatorikus mediátorok is

kiáramlanak, pl. bradykinin, leukotriének és prosztaglandinok, amelyek képesek direkt

aktiválni a szenzoros idegvégződéseket (Helyes és Hajna, 2012). Az immunsejtek aktivációján

32

kívül az LPS a tüdőbronchusok kontrakcióját kiváltva a légúti ellenállást is fokozza (Lefort és

mtsai., 2001) (9/B ábra).

2.2. Dohányfüst expozícióval kiváltott krónikus légúti gyulladásmodell

A krónikus légúti gyulladást három hónapig tartó dohányoztatással váltottuk ki (teljes test

expozíció), melyhez egy kutatási célokra kifejlesztett, ún. referencia cigerattát alkalmaztunk

(3R4F Kentucky Research Cigarette; University of Kentucky, USA). Az egereket naponta

kétszer, hetente összesen 10 alkalommal dohányoztató kamrába helyeztük (Teague Enterprises,

USA; 10. ábra). A dohányoztatás menete a következő volt: a cigaretta 10 percig tartó teljes

leégése során képződő összes füst a dohányoztató kamrába áramlott, ahol az állatok 30 percet

töltöttek a dohányfüstben, majd újabb 30 percig tartó szellőztetést követően vettük ki őket a

kamrából.

10. ábra: Teljes test kisállat dohányfüst expozíciós készülék (Teague Enterprises).

Ellentétben az endotoxinnal kiváltott pneumonitisszel, amelyet széles körben használnak a

szubakut intersticiális tüdőgyulladás jól definiált mechanizmus modelljeként, a krónikus

dohányfüst expozíciós modell pontos mechanizmusa még nem tisztázott, ugyanakkor ez utóbbi

tekinthető a humán krónikus bronchitis leginkább releváns modelljének (Varecza és mtsai.,

2009).

33

2.3. A légúti válaszkészség funkcionális vizsgálata

A légúti hiperreaktivitást éber, szabadon mozgó állatokon mértük teljes test pletizmográf

segítségével (Buxco Europe, Winchester, Egyesült Királyság; 11. ábra). Az endotoxinnal

kiváltott akut pneumonitisz modellben a bronchokonstrikciót a muszkarin receptor agonista

carbachol (50 µl/egér) emelkedő koncentrációinak (5.5, 11 és 22 mM) belélegeztetésével

váltottuk ki.

11. ábra: A bronchiális reaktivitás mérése éber állatokon teljes test pletizmográf

készülékkel (Buxco).

A carbacholra adott légúti válaszkészség vizsgálata a PBS/LPS alkalmazása után 24 h-val

történt. A mérés során meghatároztuk a légzésfrekvenciát (f), ill. a bronchokonstrikcióval és a

következményes légúti ellenállással egyenesen arányos Penh (enhanced pause) értéket. A Penh

egy komplex származtatott paraméter, mely jól korrelál a hagyományos invazív módszerrel,

mesterségesen lélegeztetett állatokon mért légúti ellenállással (Helyes és mtsai, 2009).

𝑷𝒆𝒏𝒉 = (𝑡𝑒𝑥𝑝𝑡𝑟𝑒𝑙𝑎𝑥

− 1) (𝑃𝐸𝐹

𝑃𝐼𝐹)⁄

A dohányfüst expozícióval kiváltott krónikus légúti gyulladásmodellben a dohányoztatás

megkezdésétől a kísérleti periódus végéig minden hónapban elvégeztük a légzésfunkció

változásainak vizsgálatát, melynek során a következő paramétereket határoztuk meg: a

légzésfrekvencia, a légzési térfogat (tidal volume, TV), a kilégzés alatt elérhető maximális

áramlási sebesség (peak expiratory flow, PEF), valamint a már előzőekben ismertetett Penh.

34

2.4. Bronchoalveoláris mosás

A dohányfüst expozíciós modellben az egereket ketamin és xylazin kombinációjával elaltattuk,

majd az állat tüdejét tracheakanülön keresztül adagolt 5 ml PBS oldattal átöblítettük. A

visszanyert bronchoalveoláris mosófolyadékot (BALF) centrifugacsövekbe gyűjtöttük, majd

centrifugálás (1000 rpm, 5 min) után a felülúszót eltávolítottuk. A csövek aljára kitapadt

sejteket festőpufferben reszuszpendáltuk (500 µl PBS-ben oldott 0.1% NaN3 és 0.1% BSA),

majd CD45 FITC oldatot (1 µl) kevertünk hozzá. A 30 percig tartó inkubálás után 1 µl

propídium-jodid oldatot adtunk a mintákhoz, majd újabb centrifugálás (1000 rpm, 5 min) és a

felülúszó eltávolítása után a kitapadt sejteket fixálópufferben (700 µl PBS-ben oldott 3%

formaldehid) reszuszpendáltuk. A minták sejtprofilját CyFlow Space flow citométerrel (Partec,

Németország) határoztuk meg (Ma és mtsai., 2001).

2.5. A tüdők fénymikroszkópos szövettani vizsgálata

Mindkét modellben az állatok mélyaltatásban történő cervikális diszlokációját követően a teljes

tüdőt eltávolítottuk, majd a bal tüdőlebenyt szövettani feldolgozás céljából 4%-os

formaldehidben fixáltuk, és paraffinba ágyaztuk (Helyes és mtsai, 2009). Mikrotommal 5-7

µm-es metszeteket készítettünk, és hematoxylin-eozinnal (HE) festettük. Az endotoxinnal

kezelt egerek tüdőmintáiból egy-egy metszetet perjódsav-Schiff (PAS) reagenssel festettünk

meg a nyáktermelő sejtek láthatóvá tételéhez. A gyulladásos elváltozások szemikvantitatív

szövettani értékelését független patológus végezte. Az akut pneumonitisz modellben a

következő paramétereket értékeltük: a perivaszkuláris ödéma mértéke (0-3), a

perivaszkuláris/peribronchiális neutrofil granulociták akkumulációja (0-3), az aktivált

makrofágok és mononukleáris sejtek alveoláris térbe történő infiltrációja (0-2) és a

bronchiolusokban található kehelysejtek hiperpláziája (0-2) (Zeldin és mtsai, 2001; Helyes és

mtsai, 2010). A krónikus dohányfüst expozícióval kiváltott légúti gyulladásmodellben a

szövettani értékelést a következő paraméterek alapján végeztük: a perivaszkuláris ödéma

mértéke (0-3), a neutrofil granulociták peribronchiális-perivaszkuláris térbe történő

akkumulációja (0-3), a makrofágok és egyéb gyulladásos sejtek infiltrációja az alveoláris-

intersticiális térbe (0-2) és az alveoláris-intersticiális ödéma mértéke (0-2). Az egyes

hisztopatológiai szempontokra adott értékeket összeadva kaptuk az összetett szövettani

pontszámot (0-10 mindkét esetben).

35

2.6. Mieloperoxidáz (MPO) aktivitás meghatározása tüdőhomogenizátumból

spektrofotométerrel

A endotoxinnal kiváltott pneumonitisz során az akkumulálódott neutrofil granulociták,

monociták és makrofágok mieloperoxidáz enzimet termelnek (Nichols és Bainton, 1973;

Rodrigues és mtsai, 2002). Ennek az enzimnek az aktivitása jól korrelál a neutrofil granulociták

és a makrofágok mennyiségével, így jól használható a gyulladásos reakció intenzitásának

megítélésére. A tüdőhomogenizátumok MPO aktivitását spektrofotométerrel mértük, melyhez

H2O2-3,3’,5,5’-tetrametil-benzidint (TMB/H2O2) használtuk, és amelyet standard MPO-hoz

hasonlítottunk (Helyes és mtsai, 2009).

2.7. A tüdőbeli MPO aktivitás meghatározása IVIS Lumina biolumineszcens képalkotó

technika segítségével

A reaktív oxigén/nitrogén gyököknek (ROS/RNS) a pneumonitisz mértékével arányos

termelődését ex vivo lumineszcens képalkotással mértük, melyhez L-012-t használtunk. Az L-

012 stabil luminol analóg, mely oxidáló anyagok jelenlétében alkalmas a kemilumineszcens

aktivitás detektálására (Nishinaka és mtsai, 1993), ugyanakkor, mivel több ROS/RNS

szubsztráttal rendelkezik, ill. savas pH-val szemben ellenálló, ezért az anyavegyületnél

jelentősen nagyobb jelintenzitást mutat (Kielland és mtsai, 2009). Mivel az L-012 fő

szubsztrátja a peroxinitrit, ezért gyulladásos körülmények között jól használható a fagocitotikus

aktivitás meghatározására. A PBS/LPS beadása után 24 órával az egereket nátrium-

pentobarbitállal (50 mg/kg, i.p.) altattuk, majd ezt követően azonnal beadtuk a steril PBS-ben

oldott L-012-t is (25 mg/kg, i.p.). Az injekció után 5 perccel, az állatok cervikális diszlokációját

követően a tüdőket eltávolítottuk és az IVIS Lumina II (PerkinElmer, USA) műszerbe

helyeztük. A felvételeket 10 perccel az L-012 beadása után készítettük. Az adatok kiértékelését

a LivingImage szoftver segítségével végeztük, melynek során egységes méretű ROI-kat

jelöltünk ki. Ezeken a kijelölt területeken belül kvantitatíven határoztuk meg a lumineszcens jel

intenzitását. Az egyes ROI-kon belül mért lumineszcenciát teljes radianciaként (foton flux/s)

fejeztük ki (Botz és mtsai, 2014).

2.8. A tüdők citokin koncentrációinak mérése Luminex technika segítségével

A tüdőbeli gyulladásos citokinek meghatározása Luminex xMAP technológia segítségével

történt. A tüdőket folyékony nitrogénbe helyezve lefagyasztottuk és -80°C-on tároltuk. A

mintákat 500 µl Procarta Cell Lysis pufferben történt homogenizálás után centrifugáltuk (10000

rpm, 10 perc, 4°C). A minták teljes fehérje tartalmát Bio-Rad DC Protein Assay-vel határoztuk

36

meg. A Luminex Multiplex Immunassay-t a Procarta Immunoassay Kit segítségével végeztük,

amely hatféle specifikus befogó antitestet tartalmaz: egér IL-1β, IL-6, TNFα, keratinocita

kemoattraktáns/kemokin (C-X-C motívum) ligand 1 (KC/CXCL1), monocita kemoattraktáns

protein-1 (MCP-1), és makrofág inflammatorikus protein-1 alfa (MIP-1α) ellenes antitestet

polisztirén gyöngyökhöz kötve. A kapott adatokat a MasterPlex 2010 szoftverrel értékeltük ki,

az eredményeket pedig pg/g nedves szövetben adtuk meg.

3. A diabétesz hosszú távú modellezése során alkalmazott protokollok és módszerek

3.1. A különböző súlyossági fokú diabéteszes állapotok beállítására szolgáló kezelési

sémák

A diabéteszes állapotot 60 mg/kg streptozotocin (0.1 M, citrát pufferben oldva, pH=4.5) i.p.

injekciójával váltottuk ki, melyet a kísérleti állatoknak egy éjszakán át tartó éheztetés után

adtunk be (Szkudelski, 2001). Az állatok 40%-os glükózoldatot kaptak közvetlenül a kezelést

követően (5 ml/kg). A vércukor szinteket 48 h-val a STZ-injekció beadása után ellenőriztük, és

azokat az állatokat vontuk be a vizsgálatba, amelyeknek a vércukor szintje 14 mmol/l felett

volt.

A diabéteszes állatokat kezdetben három csoportra osztottuk, mely csoportok eltérő

inzulinkezelésben részesültek. Az első csoport (mely a későbbi (I) és (II) csoportokat

tartalmazta) egy egész darab bőr alá beültethető inzulin implantátumot (Linplant elnyújtott

felszívódású inzulin implantátum, inzulinkibocsátási ráta: 2 NE/24 h/implantátum, LinShin,

Canada), míg a második csoport (III) fél darab implantátumot kapott. A harmadik csoport (IV)

állatai ettől eltérő kezelésben részesültek: injekció formájában kapták az intermedier inzulint

minden második nap (i.p., 2 NE Humulin N, Lilly, Hungary). A kísérlet 9. hetében ugyanakkor

- vércukor szintjük függvényében - további két részre bontottuk az első csoportot. Azon állatok,

amelyek az első 8 hét során majdnem normoglikémiás szinten maradtak, képezték az (I) „eny-

Kontroll (I) csoport (II) csoport (III) csoport (IV) csoport

Kezelés a 1-8.

héten

- 1 inzulin

implantátum

1 inzulin

implantátum

0.5 inzulin

implantátum

kétnaponta 2

NE inzulin

Kezelés a 9-16.

héten

- 1 inzulin

implantátum

0.5 inzulin

implantátum

0.5 inzulin

implantátum

kétnaponta 2

NE inzulin

Átlagos

vércukor szint

5-7 mmol/l 8-10 mmol/l 16-18 mmol/l 22-25 mmol/l 30-33

mmol/l

1. táblázat : A diabétesz hosszú távú vizsgálatába bevont állatcsoportok kezelési sémái.

37

hén hiperglikémiás” csoportot: ők a vizsgálat második részére újból egy darab s.c.

implantátumot kaptak (1 + 1). Azon állatok, amelyek „enyhe-közepes hiperglikémiát” mutattak

az első 8 hétben, képezték a (II) csoportot, és ők további fél darab implantátumot kaptak a 9.

héten (1 + 0.5). A (III) csoport állatainak az első 8 héthez hasonlóan ismét fél darab

implantátumot ültettünk be (0.5 + 0.5) (1. táblázat).

A nem diabéteszes Kontroll csoport állatai esetében az intraperitoneális kezelés vehiculumot,

azaz citrát puffert jelentett, a továbbiakban pedig inzulint nem tartalmazó, ún. placebo

implantátumot (Palmitic Acid Micro Crystal implantátum) ültettünk be s.c. az 1. és a 9. héten.

Az implantátumok beültetése éteres altatásban történt (Havel és mtsai., 2000). A (IV) csoport

állatainak vizsgálatát a diabétesz indukció után 12 hétig, a többi csoportét pedig 16 héten át

tudtuk folytatni. A diabétesz modellkísérlet időbeosztását a 12. ábra mutatja.

12. ábra: A diabétesz modellben alkalmazott módszerek időbeosztása.

3.2. A diabéteszes állatok vércukor szintjének és testsúlyának, valamint folyadék- és

táplálékfogyasztásának monitorozása

A kísérlet időtartama alatt a vércukor szinteket a diabéteszes csoportokban hetente kétszer

ellenőriztük, a kontroll állatok esetében pedig havonta egyszer. Ehhez a farokvénából vettünk

vérmintát, melyből Accu-Check Active vércukormérő segítségével határoztuk meg a vércukor

értékét minden esetben reggel 8.00 órakor. A testsúly mérésére hetente kétszer került sor a

diabéteszes állatok esetében, míg a kontroll csoportban heti egy alkalommal. A

táplálékfogyasztást heti rendszerességgel ellenőriztük, míg a folyadékfogyasztást naponta

kontrolláltuk. Ezeket az in vivo adatokat a kísérleti periódus megkezdése előtt mért értékekhez

hasonlítottuk.

38

3.3. Szemvizsgálat és oftalmoszkópia

A szemek in vivo vizsgálatát ketamin-diazepam (30 mg/kg ill. 3 mg/kg) kombinációval történő

altatásban végeztük, a pupillákat pedig 5 mg/ml tropikamid szembe cseppentésével tágítottuk

ki. A szem elülső szegmensének vizsgálatához olyan színes fényképfelvételeket készítettünk az

anterior szegmensről, amelyek jól ábrázolják a szaruhártyát és a szivárványhártyát egyaránt. A

felszíni ill. a mély rétegek neovaszkularizációja által érintett terület nagyságát az elülső

szegmens teljes területéhez viszonyítva számítottuk ki. A cornea szövettani vizsgálatához az

eltávolított szemgolyót 4%-os formalinban fixáltuk, majd paraffinba ágyaztuk, a metszeteket

pedig hematoxilin-eozinnal festettük.

A szem hátsó szegmensének patológiai elváltozásait egy olyan optikai képalkotó rendszerrel

tanulmányoztuk, melyben az indirekt binokuláris oftalmoszkóp (IBO) egy számítógéppel áll

összeköttetésben (Heine lupe, 20D; Optibrand Clear View, Optibrand Ltd., USA). Ez a kísérleti

összeállítás lehetővé tette, hogy a fundoszkópos vizsgálatokról 30 másodperces

videofelvételeket készítsünk, melynek segítségével a láthatóvá tett retina részletes vizsgálatát

végezhettük el. Az oftalmoszkópos vizsgálatról történő videófelvétel készítés egyrészt kiváló

lehetőséget nyújtott arra, hogy az ideghártyán létrejövő változásokat részleteiben is nyomon

kövessük a látóidegfő (papilla; optic nerve head, ONH) vizsgálatával együtt, másrészt ezáltal a

retina értékelése jól reprodukálhatóvá vált. Az ideghártya állapotának értékelését egy

szemikvantitatív skála (össz retina pontszám = Total Retinal Score, TRS) segítségével végeztük

el, melynek során a következő paraméterek változásait értékeltük: (n1) a vaszkuláris

mikroaneurizmák mennyisége; (n2) vénás elváltozások (1: értágulat, 2: gyöngyfüzérszerű

vénák 3: erek tortuozitása, n2 = 1/2/3 x az elváltozások száma); (n3) az intraretinálisan

elhelyezkedő, lángnyelv alakú bevérzések száma; (n4) az intraretinális pontszerű bevérzések

mennyisége; (n5) az intraretinális cotton-wool gócok száma; (n6) a papilla

neovaszkularizációja (1: kis mennyiségben és lokalizáltan elhelyezkedve, 2: nagyobb

mennyiségben, de még lokalizáltan elhelyezkedve, 3: a normál, radiális irányban futó erek

mentén végigterjedően, n6 = 1/2/3 x 2, ahol az esetleges 2-es szorzó súlyosbító faktort jelent);

(n7) vaszkuláris permeabilitás – makuláris ödéma jelenléte (1: enyhe, 2: közepes, 3: súlyos, n7

= 1/2/3 x 2, ahol az esetleges 2-es szorzó súlyosbító faktort jelent). A TRS értékét az egyes

paraméterek értékeinek összeadásával kaptuk meg (TRS = n1 + n2 + n3 + n4 + n5 + n6 + n7).

3.4. A retina fénymikroszkópos szövettani és immunhisztokémiai vizsgálata

Az eltávolított szemgolyókat 4%-os paraformaldehidben (PFA) fixáltuk. A minták egy

csoportját a szövettani vizsgálatok elvégzésének érdekében Durcupan ACM gyantába ágyaztuk

39

be, és a félvékony (2 µm) metszeteket toluidinkékkel festettük meg. Ezt követően a következő

paraméterek kiértékelésére került sor: (i) a retina keresztmetszete a külső határmembrántól

(outer limiting membrane, OLM) a belső határmembránig (inner limiting membrane, ILM); (ii)

az egyes retinális rétegek vastagsága; (iii) a ganglionsejtek rétegében (ganglion cell layer, GCL)

lévő sejtek száma 100 µm retinahosszra vonatkoztatva (Szabadfi és mtsai., 2012).

Az eltávolított bulbusok másik részét indirekt immunhisztokémiai vizsgálatok elvégzésére

használtuk fel, melyhez a mintákat először Tissue-Tek fagyasztóközegbe ágyaztuk, majd ezt

követően kriosztáttal (Leica, Németország) 10 µm vastagságú metszeteket készítettünk belőlük.

Ezeket először egy éjszakán át inkubáltuk az anti-tirozin-hidroxiláz (TH), az anti-gliális

fibrilláris savas protein (GFAP) és az anti-Brn3a ellenes antitestek, illetve a FITC-konjugált

peanut agglutinin (PNA) valamelyikével. A metszeteket a következő napon a primer

antitestekre specifikus szekunder antitestekkel, Alexa Fluor „488” és ”568” fluoreszcens

markerekkel inkubáltuk, majd Fluoromount-G-vel fedtük le. A metszetekről a mikroszkópos

vizsgálat során (Nikon Eclipse 80i) fényképfelvételeket készítettünk, melyek szoftveres

értékelése Adobe Photoshop programmal történt (Szabadfi és mtsai., 2012).

Az apoptotikus sejtek arányának meghatározásához a minták harmadik részén terminális

dezoxiribonukleotidil transzferáz közvetített dUTP végjelölést, azaz TUNEL-módszert

hajtottunk végre a gyártó utasításai szerint (Roche, Magyarország). A TUNEL-pozitív sejtek

számát 1000 µm retinahosszra vonatkoztattuk (Szabadfi és mtsai., 2014).

3.5. Vizelet vizsgálat

A vizeletmintákat a vizsgálati periódus elején és végén gyűjtöttük, ezen kívül a (III) és (IV)

csoportokban a 8. héten is vettünk mintákat. A mintavételhez az állatokat egyenként helyeztük

bele egy-egy ún. metabolikus ketrecbe. A mintavétel időtartama 16 h volt, melynek során

táplálék nem, viszont ivóvíz korlátlan mennyiségben állt a vizsgált egyedek rendelkezésére. A

vizeletmintákat szobahőmérsékleten centrifugáltuk (6000 rpm, 5 min), a felülúszókból pedig -

20°C-os hőmérsékleten történt tárolás után a kreatinin, az összfehérje, valamint a mikroalbumin

koncentráció értékeket határoztuk meg (Haas, 1997).

3.6. A vesék fénymikroszkópos szövettani vizsgálata

A veseglomerulusok állapotának értékeléséhez a szövettani vizsgálat céljából vett veseminták

egy részét 4%-os formalinban történő fixációt követően paraffinba ágyaztuk. A 3 µm vékony

metszeteket hematoxylin-eozinnal ill. perjódsav-Schiff (PAS) reakcióval festettük meg. A

mikroszkópos vizsgálat során (Olympus E-450 digitális kamera) minden metszet esetében

40

legalább 10 glomerulusról készítettünk fényképfelvételeket, melyeket az Adobe Photoshop

program segítségével értékeltünk ki. Ennek során először kijelöltük a teljes glomeruláris

területet, majd ezt követően a - glomeruláris mesangiumot és a glomeruláris bazálmembránt is

tartalmazó - PAS-pozitív glomeruláris területet. A területi arányok kiszámítása ScionImage

szoftverrel történt.

A tubuláris elváltozások vizsgálata céljából a minták másik részét abszolút alkoholban fixáltuk.

Ezt követően PAS- majd emésztett PAS-reakcióval (azaz diasztáz enzimmel történő kezelés

után végzett PAS-reakcióval) festettük a metszeteket. Ezzel a módszerrel a vesetubulusokban

akkumulálódott glikogén mennyiségét (Armanni-Ebstein jelenség) határoztuk meg a tubuláris

elváltozások súlyosságának kiértékelése során, ugyanis a tubuláris PAS-pozitivitás diasztáz-

függő jelenléte egyértelműen bizonyítja a tubuláris granulumok glikogén tartalmát (Bánki és

mtsai., 2013).

3.7. A szemek és a vesék elektronmikroszkópos vizsgálata

Az elektronmikroszkópos vizsgálatok elvégzése érdekében a szem- és vesemintákat 1% ill. 5%-

os glutáraldehiddel kiegészített 4%-os PFA-ben fixáltuk, melyet 0.1 M koncentrációjú foszfát

pufferben (PB) oldottunk fel. Az 1%-os OsO4-ban történt utófixálást, majd a felszálló

alkoholsorban történő dehidrációt követően a retina és vesemintákat Durcupan ACM ill. Araldit

műgyantákba ágyaztuk. Ezt követően Reichert Ultracut S ultramikrotommal ultravékony (70

nm) metszeteket készítettünk, és Reynold-féle ólom-citráttal kontrasztoztuk. A metszeteket

JEOL 1200EX típusú elektronmikroszkóppal vizsgáltuk, és fényképfelvételeket készítettünk

(Szabadfi és mtsai., 2012).

3.8. A mechanoszenzitivitás és a hidegérzékenység vizsgálata

A hátsó végtag talpi felszínének érintési érzékenységét dinamikus plantáris eszteziométerrel

(DPA, Ugo Basile, Olaszország; 13/A ábra) határoztuk meg a 16. héten. Ennek során egy

digitális kijelzővel összeköttetésben álló tompa végű tűvel folyamatosan fokozódó erővel

ingereltük az éber állatok talpát. Abban a pilllanatban, amikor az állat elrántotta a lábát, a

reakcióküszöb értéke megjelent a kijelzőn. Mivel ez a mechanikai hatás patkányokban

alapvetően nem számít fájdalmas ingernek, ezért a mechanonociceptív küszöb csökkenésének

ezt a fajtáját allodíniának nevezzük (Bölcskei és mtsai., 2005). A hátsó végtag nyomásérzé-

41

13. ábra: (A) Az érintési érzékenység mérése dinamikus plantáris eszteziométerrel.

(B) A nyomásérzékenység vizsgálata Randall-Selitto analgeziméterrel.

kenységét Randall-Selitto analgeziméterrel (Ugo Basile, Olaszország; 13/B ábra) állapítottuk

meg a vizsgálati periódus végén. A digitális kijelzővel ellátott eszközzel folyamatosan erősődő

nyomást gyakoroltunk az állatok lábára, és ingerküszöbként azt a nyomásértéket határoztuk

meg, amelynél az állat elhúzta a lábát. Mivel ez a mechanikai hatás alapvetően is fájdalmas

ingernek számít, ezért ebben az esetben a mechanonociceptív küszöb csökkenését

hiperalgéziának tekintjük (Malcangio és Tomlinson, 1998).

A hidegérzékenység kialakulását mind a hátsó

végtagon, mind az állatok farkán vizsgáltuk a

kísérlet 16. hetében. A vizsgálat során jeget

tartalmazó 0°C-os vízbe merítettük az állat hátsó

végtagját vagy farkát (14. ábra), a hideg allodínia

mértékét pedig az elhárító reakció

latenciaidejében fejeztük ki (amennyiben az állat

egyáltalán nem húzta el a lábát/farkát, a

vizsgálatot maximum 180 mp-ig végeztük)

(Tékus és mtsai., 2016).

3.9. A plazma inzulin koncentrációk meghatározása

A kísérleti állatok vérplazma inzulin szintjének megállapítását [125I] immunoradiometriai

esszével végeztük (IRMA). Az inzulin koncentrációja egyenesen arányos a kémcsövekben mért

radioaktivitással. A kísérleti periódus végén az állatokat mélyaltatásban történő szívpunkcióval

14. ábra: A hideg allodínia vizsgálata.

42

termináltuk, melynek során artériás vérmintákat (2-3 ml/állat) vettünk. Ezeket a mintákat

EDTA-t (40 µl) és trazilolt (20 µl) tartalmazó jéghideg polipropilén kémcsövekbe töltöttük és

centrifugáltuk (1000 rpm 5 percig, majd 4000 rpm további 15 percig), a felülúszókat pedig a

mérés elvégzéséig -20°C-on tároltuk. Az immunoradiometriai vizsgálatot a gyártó utasításai

szerint végeztük (Izotóp Intézet Kft., Magyarország). Ezek alapján a bevont csövekbe 100 µl

mintát, standard peptidet vagy kontroll szérumot pipettáztunk, melyhez 200 µl 125I-tracer-t

adtunk (ez utóbbi tartalmazta a pufferben oldott 125-I-jelölt szignál antitestet és a jelöletlen

befogó antitestet). A standard sor a 0-500 µNE/ml tartományt fedte le. A bevont csöveket 2

órán keresztül rázógépen inkubáltuk (600 rpm, szobahőmérsékleten). Ezután a kémcsövekbe 2-

2 ml higított mosópuffert adagoltunk, majd a felülúszót leöntöttük. Ezt követően minden egyes

kémcső radioaktivitását 60 mp-en keresztül mértük gammaszámlálóval (Gamma NZ-310,

Magyarország). Végül a standard mintasor eredményei alapján felvett kalibrációs görbe

segítségével számítottuk ki az egyes vérplazma minták inzulin koncentrációját.

STATISZTIKAI ÉRTÉKELÉS

Minden kísérleti adat a csoportok átlagát mutatja az átlag standard hibájával (± SEM). A

mikrocirkulációs vizsgálatok eredményeit párosítatlan t-próbával, illetve egyutas

varianciaanalízist (ANOVA) követő Bonferroni poszt teszttel hasonlítottuk össze. A

légzésfunkciós paraméterek, az MPO aktivitás, a totál flux értékek és a citokin koncentrációk

értékelését egy- ill. kétutas ANOVA módszerrel, majd Bonferrroni poszt teszttel végeztük. Az

összetett szövettani pontszámokat box plot módszerrel ábrázoltuk, ezt követően pedig Kruskal-

Wallis próbával, majd Dunn-féle poszt teszttel hasonlítottuk össze. A diabéteszes állatok

eredményeinek értékelése során a statisztikai analízist Bonferroni poszt teszttel kiegészített

egyutas ANOVA módszerrel végeztük. Minden esetben a p<0.05 értéket tekintettük

statisztikailag szignifikánsnak.

ETIKAI VONATKOZÁSOK

Minden kísérleti eljárás és vizsgálat megfelelt az állatok védelmére és kíméletére vonatkozó

1998. évi XXVIII. magyarországi törvénynek, valamint az állatkísérletek végzéséről szóló

243/1998. számú kormányrendelet előírásainak. Kísérleteink minden esetben eleget tettek a

Helsinki Nyilatkozat ajánlásainak és az Egyesült Királyság Állatvédelmi Törvényében (1986)

foglalt előírásoknak, továbbá megegyeztek az International Association for the Study of Pain

(IASP) etikai alapelveivel, valamint az Európai Parlament és az Európai Unió Tanácsának

tudományos célokra felhasznált állatok védelméről szóló irányelveivel (2010/63/EU).

43

Kísérleteink során minden esetben törekedtünk a vizsgálatok elvégzéséhez szükséges legkisebb

állatszámmal dolgozni, összhangban a kísérleti állatok bevonásával végzett kísérletekről szóló

ARRIVE irányelvekkel (Kilkenny és mtsai., 2010; McGrath és mtsai., 2010). A kísérleti

eljárásokat a Pécsi Tudományegyetem állatkísérletekkel foglalkozó Etikai Bizottsága és a

londoni King’s College Állatvédelmi és Etikai Bizottsága engedélyezte (engedélyszámok: BA

02/2000-2/2012 illetve PPL No. 70/7959).

FELHASZNÁLT KÉMIAI ANYAGOK

A NaHS-ot, az AITC-ot, az RTX-t, a glibenklamidot, a carbacholt, a Durcupan ACM gyantát,

a hematoxilin és a toluidinkék festékeket, illetve az anti-gliális fibrilláris savas protein antitestet

(anti-GFAP; nyúl, 1:500) a Sigma Aldrich Kft-től (Magyarország) szereztük be. A HC-030031,

a BIBN4096 és a CP99994 vegyületeket a Tocris cégtől (Egyesült Királyság) vásároltuk. A

ketamint a Richter Gedeon Nyrt-től (Magyarország), míg a xilazint az Eurovet Animal Health

Kft-től (Hollandia) szereztük be. Az L-012 reagenst a Wako Chemical Europe vállalattól

(Németország), az eozin festékanyagot a Molar Chemicals Kft.-től (Magyarország), a nátrium-

pentobarbitált pedig a Produlab Pharma cégtől (Hollandia) szereztük be. A paraformaldehidet

(PFA) és az anti-tirozin-hidroxiláz antitestet (anti-TH; egér; 1:1000) a Merck-Millipore,

(Magyarország) vásároltuk. Az anti-Brn3a antitestet (egér, 1:100) a Santa Cruz

(Magyarország), a FITC-konjugált PNA-t (FITC-PNA; 1:500) a Vector (USA), az Alexa Fluor

„488” és ”568” (1:1000) fluoreszcens markereket az Invitrogen (Magyarország),a Tissue-Tek

oldatot a Sakura Finetech (Hollandia), a Fluoromount-G-t a Southern Biotech (USA), a TUNEL

Kit-et pedig a Roche (Magyarország) cégektől szereztük be.

44

EREDMÉNYEK, MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

1. A KAPSZAICIN-ÉRZÉKENY ÉRZŐIDEG-VÉGZŐDÉSEK, VALAMINT AZ

AZOKBÓL FELSZABADULÓ SZENZOROS NEUROPEPTIDEK SZEREPÉNEK

VIZSGÁLATA H2S-INDUKÁLTA VAZODILATÁCIÓBAN

1.1. EREDMÉNYEK

A kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződések fontos szerepet játszanak a H2S-, ill. az

AITC-indukálta vazodilatációban

Vad típusú C57Bl/6 egerekben a NaHS folyamatosan fokozta az egérfül bőrének vérátáramlását

a vizsgálat teljes időtartama alatt. A maximális, 42%-os vazodilatációt a mérés 48. percében

észleltük (15/A ábra). A kapszaicin-szenzitív afferens rostok RTX-előkezeléssel történő

funkcionális inaktiválása a NaHS-dal kiváltott vazodilatációt szignifikánsan csökkentette: a 48.

percben mért vazodilatáció mértéke 19.14% volt, a teljes mérési periódus alatt adott érválasz

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0C 5 7 B l/6 + 5 % N a H S

R T X -e lő k e z e lé s + 5 % N a H S

***

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

C 5 7 B L /6 R T X -e lő k e z e lé s0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

5 % N a H S

* *

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i

terü

let

(AU

C)

0 5 1 0 1 5 2 0 2 5 3 0

-5

0

5

1 0

1 5

2 0

2 5C 5 7 B L /6 + 2 % A IT C

R T X -e lő k e z e lé s + 2 % A IT C

***

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

C 5 7 B L /6 R T X -e lő k e z e lé s0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

2 % A IT C

* *

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i

terü

let

(AU

C)

A B

DC

15. ábra: A NaHS és az AITC vazodilatátor hatásának változása a kapszaicin-érzékeny

érzőideg-végződések RTX-deszenzibilizációja után. (**p<0.01, ***p<0.001 vs. előkezelést nem

kapott csoport; párosítatlan t-próba; n=6-12/csoport)

45

pedig 41.5%-al csökkent az RTX-deszenzibilizáció hatására (15/A-B ábra). A NaHS-hoz

hasonlóan az AITC fokozta a bőr mikrocirkulációját: ebben az esetben a vazodilatáció már a 8.

percben elérte a maximális értékét, 17.36%-ot. Az RTX-előkezelés az AITC-tal kiváltott

vazodilatációt is szignifikánsan csökkentette: mindössze 4.89%-os véráramlás fokozódást

észleltünk a 8. percben, a teljes érválasz pedig 81.5%-al csökkent (15/C-D ábra).

A TRPA1 és a TRPV1 receptorok eltérő szerepe a NaHS-dal, ill. az AITC-tal kiváltott

vazodilatációban

A TRPA1 receptor hiánya esetén a NaHS-dal kiváltott mikrocirkuláció fokozódás

szignifikánsan csökkent a C57Bl/6 egerekben mért értékekhez képest. Míg a vad típusú

csoportban a stabilan fokozódó vazodilatáció maximális értéke 44.18% volt a NaHS stimuláció

után 40 perccel, addig a TRPA1-/- egerek bőr perfúziójának maximuma 23.75% volt a vizsgálat

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

2 0

4 0

6 0

C 5 7 B L /6 + 5 % N a H S

T R P A 1-/-

+ 5 % N a H S

* * *

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

T R P V 1-/-

+ 5 % N a H S

C 5 7 B L /6 T R P A 1- /-

T R P V 1- /-

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

* *

5 % N a H S

. . .

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i

terü

let

(AU

C)

0 1 0 2 0 3 0

-1 0

0

1 0

2 0

3 0

C 5 7 B L /6 + 2 % A IT C

T R P A 1- / -

+ 2 % A IT C

T R P V 1- / -

+ 2 % A IT C

* * *

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

C 5 7 B L /6 T R P A 1- /-

T R P V 1- /-

-2 0 0

-1 0 0

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

*

2 % A IT C

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i

terü

let

(AU

C)

A B

DC

16. ábra: A NaHS és az AITC vazodilatátor hatása a TRPA1, illetve a TRPV1

génhiányos egerekben. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. C57Bl/6; egyutas ANOVA + Bonferroni

poszt teszt; n=5-8/csoport)

46

38. percében (16/A ábra). Ezekben az állatokban a mérés teljes időtartama alatt adott érválasz

47%-kal csökkent a C57Bl/6 egerekéhez képest (16/B ábra). A TRPA1-/- génhiányos állatokkal

kapott eredményekkel ellentétben a TRPV1-/- egerek esetében a mikrocirkulációs változások

időbeli lefolyása és a teljes érválasz nem különbözött szignifikánsan a C57Bl/6 csoportban

kapott adatokhoz képest (16/A-B ábra). Az AITC által kiváltott véráramlás fokozódás a TRPA1

génhiányos csoportban teljes mértékben elmaradt, a TRPV1-/- egerekben kiváltott vazodilatáció

mértéke ugyanakkor gyakorlatilag megegyezett a C57Bl/6 csoportban tapasztaltakkal (16/C-D

ábra).

A szelektív TRPA1 receptor antagonista HC-030031 gátolja a NaHS-dal ill. AITC-tal

kiváltott vazodilatációt

A TRPA1 ioncsatorna H2S-indukált vazodilatációban betöltött szerepének további vizsgálatára

a szelektív TRPA1 antagonistával, a HC-030031-el végeztünk kísérleteket (17. ábra). Az 5%-

os NaHS egérfülön történő alkalmazása a Balb/c egerekben nagyobb mértékű vazodilatációt

eredményezett, mint a C57Bl/6 típusú egereknél: a maximális érték 67.42% volt a vizsgálat 48.

percében (18/A ábra). A 30 mg/kg dózisú HC-030031 szignifikánsan csökkentette a véráramlás

17. ábra: Eredeti lézer Doppler felvételek, melyek a kísérleti állat füleinek véráramlását

ábrázolják közvetlenül a NaHS-kezelés előtt, illetve 50 perccel azután.

47

emelkedését a vizsgálat 20. percétől. A mérési periódus végén a vazodilatáció mértéke alig

haladta meg az 50%-ot. A 100 mg/kg dózisú HC-030031 alkalmazása után a mikrocirkuláció

emelkedése csak kb. 28-30%-os volt a vizsgálat első felében, a mérési periódus végén pedig

mindössze 18-20% körül alakult (18/A ábra). A HC-030031 két különböző dózisának

alkalmazása 24.6% illetve 51.4%-kal csökkentette a teljes érválaszt (18/B ábra).

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

5 % N a H S + v e h ic u lu m

5 % N a H S + 3 0 m g /k g H C -0 3 0 0 3 1

5 % N a H S + 1 0 0 m g /k g H C -0 3 0 0 3 1

* * *

* *

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

V e h ic u lu m 3 0 m g /k g 1 0 0 m g /k g0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

* * *

*

5 % N a H S

H C -0 3 0 0 3 1H C -0 3 0 0 3 1

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i

terü

let

(AU

C)

0 1 0 2 0 3 0

0

1 0

2 0

3 0

4 02 % A IT C + v e h ic u lu m

2 % A IT C + 3 0 m g /k g H C -0 3 0 0 3 1

2 % A IT C + 1 0 0 m g /k g H C -0 3 0 0 3 1

* * ** * *

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

V e h ic u lu m 3 0 m g /k g 1 0 0 m g /k g0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

* *

2 % A IT C

H C -0 3 0 0 3 1 H C -0 3 0 0 3 1

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i

terü

let

(AU

C)

A B

DC

18. ábra: A TRPA1 receptor antagonista HC-030031 hatása a NaHS-dal, illetve az

AITC-tal kiváltott vazodilatációra. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. vehiculummal kezelt csoport;

egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=5-6/csoport)

Az AITC által kiváltott vazodilatáció maximuma Balb/c egerekben 27.87% volt 6 perccel a

vizsgálat kezdete után. A bőr perfúziója ezt követően fokozatosan csökkent, de a mérés teljes

időtartama alatt a kiindulási érték felett maradt. Az intraperitoneálisan adott TRPA1 receptor

antagonista HC-030031 mindkét dózisa szignifikánsan csökkentette az AITC hatására létrejövő

vazodilatációt. A mikrocirkuláció AITC-tal kiváltott fokozódásának jellegzetes csúcsa

elmaradt, és a vazodilatáció ezt követően is csökkent mértékű volt (18/C ábra). A 30 és a 100

mg/kg dózisú HC-030031 54.5 illetve 53.6%-kal csökkentette az AITC-tal kiváltott véráramlás

fokozódást a teljes megfigyelési idő alatt (18/D ábra).

48

A CGRP fontos szerepet játszik a H2S-indukálta vazodilatációban

A fülbőr perfúziójának NaHS-dal kiváltott fokozódása szignifikánsan alacsonyabb volt az α-

CGRP-/- egerek esetében, mint az α-CGRP+/+ állatoknál (19/A ábra). A TRPA1 receptor

gátlásánál megfigyeltekhez hasonlóan a vazodilatáció mértéke látványosan csökkent a vizsgálat

14-15. percétől kezdve, és ezt követően stabilan, kb. 45-50%-al maradt el a génhiányos

egerekben a vad típusú társaikhoz képest. A mérés teljes időtartama alatt adott érválasz

összességében 55.5%-al volt alacsonyabb az α-CGRP gén hiányában (19/B ábra).

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

2 5

5 0

7 5

1 0 0

-C G R P+ /+

+ 5 % N a H S

-C G R P- /-

+ 5 % N a H S

***

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

W T -H 2 S K O -H 2 S

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

-C G R P+ /+

-C G R P- / -

5 % N a H S

*

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i te

rü

let

(AU

C)A B

19. ábra: A NaHS vazodilatátor hatása az α-CGRP génhiányos egerekben.

(*p<0.05, ***p<0.001 vs. α-CGRP+/+; párosítatlan t-próba; n=5-6/csoport)

A CGRP receptor antagonista BIBN4096 szignifikánsan csökkentette a NaHS-dal kiváltott

vazodilatációt (20. ábra). Ez a hatás koncentráció-függőnek mutatkozott, ugyanis míg a 0.1

mg/kg-os antagonista csak tendenciaszerűen mérsékelte a véráramlás fokozódását (21/A ábra),

addig a magasabb dózisokban (> 1 mg/kg) alkalmazott BIBN4096 szignifikáns mértékben

csökkentette azt (21/B-C ábra). A CGRP receptor antagonista 0.1 mg/kg, 1 mg/kg és 10 mg/kg

dózisai 13.2%., 49% ill. 45.7%-al csökkentették a teljes vaszkuláris választ (21/D ábra).

49

20. ábra: Eredeti lézer Doppler felvételek, melyek a kísérleti állat füleinek véráramlását

ábrázolják közvetlenül a NaHS-kezelés előtt, illetve 50 perccel azután.

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

5 0

1 0 0

V e h ic u lu m + 5 % N a H S

0 .1 m g /k g B IB N 4 0 9 6 + 5 % N a H S

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

5 0

1 0 0

V e h ic u lu m + 5 % N a H S

1 m g /k g B IB N 4 0 9 6 + 5 % N a H S

***

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

5 0

1 0 0

V e h ic u lu m + 5 % N a H S

1 0 m g /k g B IB N 4 0 9 6 + 5 % N a H S

***

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

V e h ic u lu m B IB N 4 0 9 6 B IB N 4 0 9 6 B IB N 4 0 9 6

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

5 % N a H S

** **

0 .1 m g /k g 1 0 m g /k g1 m g /k g

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i te

rü

let

(AU

C)

A B

C D

21. ábra: A CGRP receptor antagonista BIBN4096 hatása a NaHS-dal kiváltott

vazodilatációra. (**p<0.01, ***p<0.001 vs. vehiculummal kezelt csoport; párosítatlan t-próba ill. egyutas

ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=5-6/csoport)

50

Az NK1 tachykinin receptor szerepe a H2S-indukálta vazodilatációban

A NaHS-dal kiváltott mikrocirkuláció fokozódás szignifikánsan alacsonyabb volt a Tacr1-/-

egerekben - azaz azokban az állatokban, amelyek nem képesek expresszálni az NK1 receptort

–, mint a vad típusú társaik esetében (22/A ábra). Érdekes módon az α-CGRP génhiányos

állatokban megfigyelteknél korábban, már a vizsgálat 6-8. percében szemmel látható volt a

különbség a Tacr1-/- és a C57Bl/6 egerek véráramlás fokozódása között. A NaHS-ra adott teljes

érválasz 48.2%-al csökkent az NK1 receptort kódoló gén hiányában (22/B ábra).

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

C 5 7 B l/6 + 5 % N a H S

T a c r1- / -

+ 5 % N a H S

***

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

C 5 7 B l/6 T a c r1- /-

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

8 0 0

1 0 0 0

5 % N a H S

*

.......

.......

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i te

rü

let

(AU

C)

A B

22. ábra: A NaHS vazodilatátor hatása az Tacr1 génhiányos egerekben (azaz az NK1

receptor hiányában). (*p<0.05, ***p<0.001 vs. C57Bl/6; párosítatlan t-próba; n=4-6/csoport)

Az NK1 receptor antagonista CP99994 a BIBN4094-nál tapasztaltakhoz hasonlóan

koncentráció-függő módon csökkentette a NaHS által kiváltott vazodilatációt (23. ábra). Ugyan

az antagonista alacsonyabb dózisa (10 mg/kg) nem befolyásolta a vazodilatátor választ (24/A

ábra), a CP99994 –t magasabb dózistartományban (> 25 mg/kg) alkalmazva a vazodilatáció

szignifikáns gátlását figyelhettük meg (24/B-C ábra). A teljes vaszkuláris válasz 20.5%, 33.9%

ill. 47.9%-al csökkent a 10, 25 és 50 mg/kg-os antagonistakezelés hatására (24/D ábra).

51

23. ábra: Eredeti lézer Doppler felvételek, melyek a kísérleti állat füleinek véráramlását

ábrázolják közvetlenül a NaHS-kezelés előtt, illetve 50 perccel azután.

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

5 0

1 0 0

V e h ic u lu m + 5 % N a H S

1 0 m g /k g C P 9 9 9 9 4 + 5 % N a H S

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

5 0

1 0 0

V e h ic u lu m + 5 % N a H S

2 5 m g /k g C P 9 9 9 9 4 + 5 % N a H S

*

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

5 0

1 0 0

V e h ic u lu m + 5 % N a H S

5 0 m g /k g C P 9 9 9 9 4 + 5 % N a H S

***

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

V e h ic u lu m C P 9 9 9 9 4 C P 9 9 9 9 4 C P 9 9 9 9 4

0

5 0 0

1 0 0 0

1 5 0 0

2 0 0 0

5 % N a H S

**

2 5 m g /k g 5 0 m g /k g1 0 m g /k g

*

A v

érá

ra

mlá

s g

örb

e a

latt

i te

rü

let

(AU

C)

A B

C D

24. ábra: Az NK1 receptor antagonista CP99994 hatása a NaHS-dal kiváltott

vazodilatációra. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs. vehiculummal kezelt csoport; párosítatlan t-próba ill.

egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=4-6/csoport)

52

A CGRP és NK1 receptorok egyidejű farmakológiai gátlásának hatása a H2S-indukálta

vazodilatációra

A BIBN4096-tal és a CP99994-el történő kombinált kezelés a NaHS-dal indukált vazodilatáció

szignifikáns csökkenését eredményezte. A véráramlás változások kinetikáját tekintve érdekes

módon a mikrocirkuláció fokozódás kezdeti szakasza az NK1 receptor antagonistával történő

gátlásnál tapasztaltakhoz volt hasonló, míg a vaszkuláris reakció második szakasza inkább a

CGRP antagonistával történő kezelés esetében látottakra hasonlított (25. ábra).

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

-1 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0V e h ic u lu m + 5 % N a H S

1 m g /k g B IB N 4 0 9 6 + 2 5 m g /k g C P 9 9 9 9 4 + 5 % N a H S

2 5 m g /k g C P 9 9 9 9 4 + 5 % N a H S

1 m g /k g B IB N 4 0 9 6 + 5 % N a H S

********

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

25. ábra: A CGRP és NK1 antagonistákkal történt kombinált kezelés hatása a NaHS-dal

kiváltott vazodilatációra. (**p<0.01, ***p<0.001 vs. vehiculummal kezelt csoport; egyutas ANOVA +

Bonferroni poszt teszt; n=4-6/csoport)

A K+ATP-csatornák is szerepet játszanak a H2S-indukálta vazodilatációban

A K+ATP-csatorna blokkoló glibenklamiddal (50 mg/kg) történő szisztémás kezelés

szignifikánsan csökkentette a NaHS-dal kiváltott véráramlás fokozódást. A vazodilatáció

gátlásának kinetikája és mértéke hasonló volt a HC-030031-el kiváltott értágulat csökkenéshez

(26/A-B ábra).

53

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0 V e h ic u lu m + 5 % N a H S

5 0 m g /k g g lib e n k la m id + 5 % N a H S

*

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

A B

26. ábra: A K+-csatorna blokkoló glibenklamid hatása a NaHS-dal kiváltott vazodila-

tációra. (*p<0.05 vs. vehiculummal kezelt csoport; egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=5-10/csoport)

A kémhatás és az ozmotikus nyomás nem befolyásolják a bőr mikrocirkulációját

A NaHS-oldat alkalikus kémhatását modellező lokális NaOH-kezelés mikrocirkulációra

kifejtett hatása szignifikánsan kisebb volt a NaHS által kiváltott vazodilatációnál, és

gyakorlatilag nem befolyásolta a fülbőr regionális véráramlását. A NaHS-oldattal megegyező

koncentrációjú, így annak ozmotikus tulajdonságait modellező NaSO3- és NaCl-oldatok által

kiváltott perfúzió emelkedés is szignifikánsan alacsonyabb volt a NaHS alkalmazásakor

tapasztalttól: jelentős véráramlás fokozódást ezekben az esetekben sem detektáltunk (27. ábra).

0 1 0 2 0 3 0 4 0 5 0

-1 0

0

1 0

2 0

3 0

4 0

5 0

6 0

7 0

8 0

9 0

1 0 0 V e h ic u lu m + 5 % N a H S

V e h ic u lu m + 0 .1 6 % N a O H , p H = 1 2 .6 1

V e h ic u lu m + 5 % N a S O 3

V e h ic u lu m + 5 % N a C l

*********

N a S O 3

Id ő (p e rc )

A v

érá

ra

mlá

s v

ált

oz

ás

a (

%)

27. ábra: A pH és az ozmotikus hatások nem befolyásolják bőr vérátáramlását.

(***p<0.001 vs. NaHS-kezelés; egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=4-5/csoport)

54

1.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS

Jelen kísérleteinkkel in vivo bizonyítottuk, hogy a H2S által kiváltott vazodilatáció

közvetítésében a kapszaicin-szenzitív szenzoros neuronok fontos szerepet játszanak egérfül

bőrében. Bizonyítékot szolgáltattunk arra is, hogy a peptiderg primer afferenseken

expresszálódó TRPA1 receptor aktivációja kulcsszerepet játszik a H2S bőrben kifejtett

vaszkuláris hatásaiban, míg a TRPV1 receptor valószínűsíthetően nem vesz részt ebben a

folyamatban. Kimutattuk továbbá, hogy a TRPA1 ioncsatornák aktiválódását követően az

érzőideg-végződésekből felszabaduló vazoaktív szenzoros neuropeptidek, a CGRP és a P-

anyag közvetítik a mikrocirkuláció H2S által kiváltott fokozódását a CGRP, illetve az NK1

receptor stimulációján keresztül. Bizonyítottuk továbbá, hogy az érfali simaizom sejteken

található K+ATP-csatornák aktivációja szintén hozzájárul az egérfül bőrben található erek H2S

által előidézett vazodilatációjának kialakulásához. Ugyanakkor a pH változása, valamint az

ozmotikus hatások nem befolyásolják ezt a válaszreakciót (2. táblázat).

NaHS vazodilatáció

RTX-előkezelés hatása Tacr1 génhiány hatása

TRPA1 génhiány hatása NK1 antagonista hatása

TRPA1 antagonista hatása

TRPV1 génhiány hatása K+ATP-csatornák gátlása

α-CGRP-génhiány hatása pH hatása

CGRP-antagonista hatása Ozmotikus hatás

2. táblázat: A neurogén és nem neurogén struktúrák szerepe a NaHS-dal kiváltott

vazodilatációs válaszban.

A kapszaicin-érzékeny primer afferensek és a H2S kapcsolatát elsőként Prior és mtsai írták le

(1990), kimutatva, hogy ezek a neuronok fontos szerepet játszanak a tüdő H2S-dal kiváltott

gyulladásos folyamataiban. Ezen kívül ismert, hogy a húgyhólyag NaHS által kiváltott

kontrakciói során a kapszaicin-érzékeny érzőidegek aktiválódnak, és a belőlük felszabaduló

neuropeptidek az NK1 és NK2 receptorok stimulációjával közvetítik azokat (Patacchini és

55

mtsai., 2004). Ezeknek a szenzoros rostoknak a kapszaicinnel történő deszenzibilizációja

csökkenti a hólyagnyakban található simaizomsejtek H2S-dal kiváltott relaxációját (Fernandes

és mtsai., 2013). Izolált patkány mezenteriális artériával végzett kísérletek alapján feltételezték,

hogy a szenzoros rostok szerepet játszhatnak a H2S-indukálta vazodilatációs válaszban is

(White és mtsai., 2013).

Kísérleteink során a NaHS lokális alkalmazása a bőr mikrocirkulációjának szignifikáns

mértékű fokozódását idézte elő. Az egérfülön vizsgált lokális keringés a mérési periódus alatt

folyamatosan és fokozatosan emekedett, a vazodilatáció mértéke a vizsgálat végére Balb/c

egerekben megközelítette a 70%-ot, C57Bl/6 egerekben pedig a 45%-ot. A különbség

hátterében egértörzsek közötti eltérés feltételezhető, ugyanis ismert tény, hogy a Balb/c csoport

különösen jó modellt nyújt a neurogén gyulladás paramétereinek egérfülön történő vizsgálatára

(Bánvölgyi és mtsai., 2004).

Jelen vizsgálataink során a peptiderg primer szenzoros rostok RTX-előkezeléssel történő

deszenzibilizációja szignifikánsan csökkentette a NaHS által kiváltott vazodilatációt.

Tekintettel arra, hogy a kapszaicin-érzékeny érzőidegek funkcionális inaktiválása esetén a

mikrocirkuláció fokozódás jelentős mértékben elmaradt az RTX-előkezelésben nem részesült

állatokétól, egyértelmű in vivo bizonyítékot szolgáltattunk arra, hogy a kapszaicin-érzékeny

érzőidegek fontos szerepet játszanak a H2S által kiváltott dermális vazodilatációban.

Ahhoz, hogy a H2S által kiváltott és a kapszaicin-szenzitív szenzoros afferensek által közvetített

vazodilatációban részt vevő molekuláris mechanizmusokat feltárjuk, először megvizsgáltuk a

peptiderg afferenseken expresszálódó TRPA1 és TRPV1 ioncsatornák szerepét ebben a

folyamatban.

A TRPA1 receptorról már korábban leírták, hogy fontos szerepet játszik mind a neuronális

vazodilatáció (Bautista és mtsai., 2005; Pozsgai és mtsai., 2010; Kunkler és mtsai., 2011), mind

az endotél-mediálta vazorelaxáció (Earley és mtsai., 2009) közvetítésében. Újabb adatok szerint

a hidegingerre adott vaszkuláris reakcióban is részt vesz, és ebben a folyamatban a szenzoros

neuronok és a belőlük felszabaduló CGRP fontos szerepet játszanak (Aubdool és mtsai., 2014).

Arra, hogy a TRPA1 receptort a H2S esetlegesen aktiválni képes, először in vitro kísérletek

eredményei utaltak (Streng és mtsai., 2008; Miyamoto és mtsai., 2011). A TRPA1 receptornak

a NaHS által kiváltott fájdalomreakciókban betöltött szerepét később in vivo adatok is

megerősítették (Andersson és mtsai., 2012).

A genetikailag módosított egereken végzett vizsgálataink során azt találtuk, hogy TRPA1

receptor hiányában a H2S–dal kiváltott véráramlás fokozódás szignifikánsan kisebb volt a vad

típusú állatoknál tapasztaltakhoz képest. A génhiányos egerekkel kapott adatainkat

56

farmakológiai módszerrel is megerősítettük, melynek eredménye szerint a TRPA1 receptornak

a szelektív antagonista HC-030031-el történő gátlása szignifikánsan, koncentráció-függő

módon csökkentette a H2S-indukálta vazodilatációt.

Jelen kísérleteinkkel in vivo igazoltuk, hogy a TRPA1 ioncsatornák fontos szerepet játszanak

az egér fülbőr mikrocirkulációjának H2S által kiváltott fokozódásában, következésképpen a

TRPA1 aktivációját a H2S vazoaktív hatásainak fontos mediátoraként kell tekintenünk.

Munkacsoportunk tagjai a közelmúltban in vitro kísérletek segítségével kimutatták, hogy

TRPA1-/- egerek TRG sejtjein sem a NaHS, sem a Na2S nem képesek [Ca2+]i emelkedést

kiváltani, bizonyítva ezzel, hogy a Ca2+ fontos szereppel bír a H2S TRPA1 receptor által

közvetített hatásaiban. Ezek az eredmények összhangban állnak azokkal a korábbi irodalmi

adatokkal, melyek szerint a [Ca2+]i változásai fontos szerepet játszanak a húgyhólyagnyak

simaizomzatának H2S-indukálta relaxációjában (Fernandes és mtsai., 2013), valamint hogy a

Ca2+-jel TRPA1-függő változásai összefüggésben vannak a vazodilatációs válasszal patkány

cerebrális artériáiban (Qian és mtsai., 2013).

A H2S és a kapszaicin-érzékeny érzőideg-végződéseken expresszálódó TRPA1 receptor között

létrejövő kölcsönhatás molekuláris mechanizmusát illetően többféle elmélet látott napvilágot.

Egyrészt már korábban publikált adatok kimutatták, hogy a TRPA1 ioncsatorna N-terminális

reaktív cisztein oldalláncainak reverzibilis kovalens módosulása a receptor aktivációját idézi

elő (Macpherson és mtsai., 2007). A H2S-ról pedig leírták, hogy bizonyos célfehérjék cisztein

oldalláncain S-szulfhidrációt hoz létre (Mustafa és mtsai., 2009), annak ellenére, hogy a H2S

önmagában - egyéb közvetítő molekula hiányában - nem képes a fehérjéken található tiol

csoportokat oxidálni (Greiner és mtsai., 2013). Ugyanakkor ismert tény, hogy a leggyakrabban

használt H2S donorok vizes oldataiban poliszulfid vegyületek képződnek, melyekről

bebizonyosodott, hogy köztes mediátorokként vesznek részt számos olyan fehérje tiol

oxidációjában, melyekről korábban leírták, hogy H2S stimuláció hatására S-szulfhidrációval

módosulnak (Greiner és mtsai., 2013). Sőt, egy újabb tanulmány ki is mutatta, hogy a NaHS-

és Na2S oldatokban képződő poliszulfidok képesek aktiválni a TRPA1 receptort (Hatakeyama

és mtsai., 2015).

További vizsgálatok ugyanakkor kimutatták azt is, hogy a TRPA1 ioncsatornákon található

bizonyos cisztein oldalláncok között kialakuló diszulfid-híd kötések, valamint a citoplazma

felől elhelyezkedő N-terminális szakaszon létrejövő konformációs változások feltehetően

szintén hozzájárulnak a receptor aktiválódásához (Wang L és mtsai., 2012; Eberhardt és mtsai.,

2014). Ennek a folyamatnak egyik lehetséges mechanizmusa lehet a H2S és a NO reakciójának

végtermékeként létrejövő nitroxillal (HNO) történő kölcsönhatás (Eberhardt és mtsai., 2014).

57

A H2S és a NO interakcióját TRG neuron preparátumokon és a dura materben is vizsgálták,

ahol a [Ca2+]i emelkedését, illetve a meningeális véráramlás fokozódását írták le H2S- és NO-

donorok alkalmazása után (Wild és mtsai., 2015; Dux és mtsai., 2016).

Mivel korábbi adatok alapján ismert, hogy a TRPA1 és TRPV1 receptorok kolokalizálódnak a

szenzoros idegvégződéseken (Bodkin és Brain, 2010), ezért megvizsgáltuk azt is, hogy a

TRPV1 ioncsatorna részt vesz-e a véráramlás H2S által kiváltott fokozódásában. A TRPV1

receptornak a NaHS-indukálta szenzoros neuron aktivációban betöltött szerepét illetően

ellentmondásos adatok állnak rendelkezésre. Tengerimalaccal végzett légúti kísérletek szerint

a H2S által kiváltott neurogén gyulladás közvetítésében a TRPV1 receptor szerepet játszik

(Trevisani és mtsai., 2005), ugyanakkor patkány DRG neuronokban a TRPV1 antagonista nem

gátolta a NaHS-indukálta Ca2+-beáramlást (Miyamoto és mtsai., 2011).

Kísérleteink szerint a vazodilatáció mértéke a TRPV1 receptor génhiányos egerekben hasonló

volt a vad típusú állatokban tapasztaltakhoz képest, mely alapján arra következtethetünk, hogy

a TRPV1 receptor nem vesz részt a H2S dermális mikrocirkulációt fokozó hatásaiban. Az egér

fülbőr mikrocirkulációs modellben szerzett in vivo eredményeinket kutatócsoportunk in vitro

kísérletei is megerősítették. A TRPA1 ill. TRPV1 receptort expresszáló CHO sejtvonalakon

elvégzett radioaktív 45Ca2+-felvétel vizsgálatok alapján a H2S által indukált 45Ca2+ izotóp

felvétel a csak TRPA1-t expresszáló sejteken koncentráció-függő módon jelentkezett, míg a

csak TRPV1-t expresszáló sejteken egyáltalán nem volt detektálható. Mindezek alapján

elmondhatjuk, hogy feltehetően sem a TRPV1 receptor, sem a két vizsgált ioncsatorna közötti

interakció nem befolyásolják az egér fülbőr mikrocirkulációjának változásait.

A NaHS-nak a kapszaicin-érzékeny idegvégződéseket, illetve az azokon expresszálódó

ioncsatornákat aktiváló képességét összehasonlítottuk a mustárolajban megtalálható AITC-nak

a véráramlásra kifejtett hatásaival is. Az AITC-ot régóta használják lokális dermális neurogén

gyulladás kiváltására rágcsálókkal végzett kísérletekben. Ismert, hogy a kapszaicinnel történő

deszenzibilizáció képes felfüggeszteni az AITC által kiváltott hatásokat (Jancsó és mtsai., 1977;

Pintér és mtsai., 1999), ugyanakkor az AITC-tal kiváltott neurogén gyulladás a TRPV1

receptortól független mechanizmussal megy végbe (Bánvölgyi és mtsai., 2004). Kísérleteink

során azt találtuk, hogy kapszaicin-érzékeny érzőidegek funkcionális inaktiválása, valamint a

TRPA1 receptor genetikai hiánya esetén gyakorlatilag teljes mértékben hiányzott az AITC-ra

adott érválasz, a TRPV1 génhiányos egerekben megfigyelt AITC-indukálta hiperémia

ugyanakkor nem különbözött a vad típusú kontroll állatokban tapasztaltaktól. A TRPA1

antagonista HC-030031 szintén jelentős mértékben gátolta az AITC által kiváltott véráramlás

fokozódást. Eredményeinkhez hasonló adatok láttak napvilágot az irodalomban, részben

58

mikrocirkulációs vizsgálatok, részben egérfül ödéma tanulmányozása kapcsán (Pozsgai és

mtsai., 2010; Silva és mtsai., 2011).

Mivel irodalmi adatok szerint a H2S stimuláló hatással van a szenzoros neuropeptidek

felszabadulására rágcsálók légutaiban (Bhatia és mtsai., 2006), ezért megvizsgáltuk az érzőideg

végződésekből felszabaduló szenzoros neuropeptidek, a CGRP és a P-anyag lehetséges szerepét

a H2S által kiváltott és a kapszaicin-szenzitív szenzoros afferensek által közvetített

vazodilatációban. Ismert, hogy a TRPA1 receptor stimulációja következtében CGRP és SP

szabadul fel (Trevisani és mtsai., 2007). A TRPA1 receptor 4-oxo-2-nonenal-lal történő

aktivációja a regionális véráramlás fokozódásával jár, de ennek a jelenségnek a létrejötte α-

CGRP-/- egerekben elmarad, ami az α-CGRP szerepét feltételezi a TRPA1-mediálta

vazodilatációban (Graepel és mtsai., 2011). Patkány trigeminus ganglion neuronjaiban AITC

hatására létrejövő CGRP-felszabadulást írtak le, melyet a TRPA1 receptor antagonista HC-

030031 gátolni képes. A CGRP receptor antagonista CGRP8-37 pedig teljes mértékben

felfüggesztette az intranazálisan adott AITC meningeális vérátáramlást fokozó hatását (Kunkler

és mtsai., 2011). A Na2S i.v. injekciója után a CGRP-szint emelkedését észlelték patkány

liquorban (Eberhardt és mtsai., 2014). A húgyhólyagnyak simaizomzatában a CGRP receptor

CGRP8-37-tel történő farmakológiai blokádja csökkentette a H2S által kiváltott relaxációt

(Fernandes és mtsai., 2013). Sőt, izolált mezenteriális artériákban a CGRP receptor antagonista

olcegepant és CGRP8-37 is mérsékelte a NaHS-dal ill. a Na2S-dal kiváltott vazodilatációt (White

és mtsai., 2013; Eberhardt és mtsai., 2014). Munkacsoportunk korábbi in vitro eredményei

kimutatták, hogy a TRPA1 antagonista HC030031 gátolja a NaHS-dal kiváltott CGRP-

felszabadulást izolált patkány trachea szenzoros idegvégződéseiből (Pozsgai és mtsai., 2012).

Jelen kísérleteink során az α-CGRP-/- egerekkel, illetve a CGRP antagonista BIBN4096-tal

kapott eredmények egyértelmű in vivo bizonyítékkal szolgáltatnak arra, hogy a CGRP fontos

mediátor szereppel bír a H2S-indukálta véráramlás fokozódásban bőr mikrocirkulációjában.

Ismert, hogy a H2S egér tüdőben neurogén gyulladás és akut pneumonitisz kiváltására képes,

melynek közvetítésért a SP felelős az NK1 receptor aktivációján keresztül (Bhatia és mtsai.,

2006). Másrészt a TRPA1 agonista AITC fokozza a bőr vérátáramlását, mely szignifikánsan

alacsonyabb az NK1 receptor antagonista előkezelésben részesült α-CGRP-/- és vad típusú

egerekben is (Grant és mtsai., 2005). Mindezek alapján feltételezhető volt, hogy a neurogén

vazodilatáció létrejöttéért nem csak a CGRP, hanem az NK1 receptor által mediált útvonal is

felelős. Jelen kísérleteinkkel kimutattuk, hogy a NaHS-indukálta vazodilatáció mértéke kisebb

mind az NK1 receptor génhiányos, mind az NK1 receptor antagonista CP99994-el kezelt

59

egerekben a kezeletlen vad típusú csoporthoz képest, bizonyítva ezzel, hogy a CGRP mellett a

SP is felelős a H2S-dal kiváltott vazodilatáció kialakulásáért.

Mivel a H2S vazodilatátor hatásának egy része a BIBN4096-al, illetve a CP99994-el történő

kezelés után is megmaradt, ezért vizsgálatainkat a két antagonistával történő kombinált

kezeléssel folytattuk. Ugyan a CGRP antagonista és az NK1 receptor antagonista egyidejű

alkalmazása nem eredményezett additív hatást, de a vazodilatáció gátlásának kinetikája

érdekesen alakult. Valószínűsíthető, hogy a H2S által kiváltott véráramlásfokozódás az első 10-

15 percben főként az NK1 receptor gátlásának köszönhető, a vizsgálat további részében pedig

inkább a CGRP receptor blokádjának. Eredményeink alapján egyrészt feltételezhető, hogy a

szenzoros idegvégződések stimulációja során a SP felszabadulása gyorsabban megy végbe,

másrészt az is, hogy az NK1 receptor aktivációjakor beinduló jelátviteli útvonalak hatása

gyorsabban jön létre, mint a CGRP esetében. Természetesen nem hagyható figyelmen kívül az

a tény, hogy a vazodilatáció gátlásának eltérő kinetikája a két antagonista eltérő

farmakokinetikai sajátosságaiból is adódhat. Mindezen eredményeinkkel bizonyítottuk, hogy a

kapszaicin-szenzitív szenzoros neuronok aktivációja, valamint a belőlük felszabaduló

neuropeptidek fontos szerepet játszanak a lokális mikrocirkuláció H2S-indukálta

fokozódásának közvetítésében.

28. ábra: A H2S által kiváltott vazodilatáció hatásmechanizmusának összefoglalása.

60

Mindazonáltal azon megfigyeléseink, melyek szerint a H2S-dal kiváltott vazodilatáció

csökkenése sem a TRPA1 receptor hiányában, sem a TRPA1 antagonistával kezelt egerek

esetében nem volt teljes mértékű, illetve hogy a CGRP és NK1 receptor antagonistákkal történő

kombinált kezelés a vazodilatációnak csak részleges gátlását eredményezi, felveti annak

lehetőségét, hogy a H2S vazodilatátor hatásának közvetítésében a neurogén mechanizmusokon

kívüli, egyéb targetek is szerepet játszanak (Li és mtsai., 2011). Cerebrális és mezenteriális

artériákban, valamint izolált aorta preparátumon leírták, hogy a H2S által kiváltott vazodilatáció

közvetítésében K+-csatornák is részt vesznek (Zhao és mtsai., 2001; Cheng és mtsai., 2004;

Liang és mtsai., 2011). Ugyan a K+ATP-csatornák szerepét más simaizomszövetek relaxációs

folyamataiban is vizsgálták (Fernandes és mtsai., 2013), egymásnak ellentmondó

eredményekről számol be az irodalom (White és mtsai., 2013; Eberhardt és mtsai., 2014). Jelen

kísérleteinkben a glibenklamid szignifikánsan csökkentette a NaHS által kiváltott dermális

vazodilatációt, bizonyítva ezzel, hogy az érfali simaizomsejteken található K+ATP-csatornák

hozzájárulnak a bőrerek relaxációjához. Sőt, mivel a glibenklamid-szenzitív K+ATP-csatornákról

ismert, hogy tengerimalac ureter simaizomban a CGRP hatásainak közvetítésében szerepet

játszanak (Santicioli és Maggi, 1994; Maggi és mtsai., 1996), ezért feltételezhető, hogy a

kapszaicin-érzékeny primer afferensek és a belőlük felszabaduló neuropeptidek, valamint a

K+ATP-csatornák interakcióba lépnek a H2S-indukálta vazodilatációt közvetítő molekuláris

folyamatok során is. A H2S lokális alkalmazásával kiváltott vazodilatáció kísérleteinkkel

igazolt hatásmechanizmusait a 28. ábra szemlélteti.

Mivel az 5%-os NaHS oldat igen magas pH-val rendelkezik, melyről ismert, hogy képes

aktiválni a TRPA1 receptort (Fujita és mtsai., 2008), ezért megvizsgáltuk azt is, hogy az

általunk használt NaHS oldat lúgos kémhatásával megegyező pH-jú NaOH-oldat képes-e

vazodilatációt kiváltani egérfül bőrében. Ezen kívül kíváncsiak voltunk arra is, hogy az 5%-os

NaHS-oldat ozmotikus hatása esetlegesen nem befolyásolja-e az általa kiváltott vazodilatátor

hatást, ezért 5%-os NaSO3- és NaCl-oldattal is elvégeztük a kísérleteket. A dermális véráramlás

fokozódás mindegyik esetben szignifikánsan alacsonyabb volt a NaHS által kiváltott

vazodilatációnál, bizonyítva azt, hogy ezek a nem specifikus fizikai és kémiai hatások nem

befolyásolják a H2S mikrocirkulációra kifejtett hatásait. Ezek az eredmények összhangban

vannak munkacsoportunk korábbi eredményeivel, ahol az alkalikus pH nem befolyásolta a

CGRP H2S-indukálta felszabadulását izolált patkány trachea szenzoros idegvégződéseiből

(Pozsgai és mtsai., 2012).

61

2. A TRPA1 RECEPTOR SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA AKUT ÉS KRÓNIKUS

LÉGÚTI GYULLADÁSMODELLEKBEN

2.1. EREDMÉNYEK

A TRPA1 receptor protektív szerepet játszik az endotoxinnal kiváltott bronchiális

hiperreaktivitás kialakulásában

Az intranazális LPS beadása után 24 órával a légúti válaszkészséget jelző Penh az emelkedő

koncentrációjú muszkarin receptor antagonista carbachol hatására mind a TRPA1+/+, mind a

TRPA1-/- egerekben szignifikánsan, koncentráció-függő módon megemelkedett a PBS-kezelt

csoportokhoz képest, ami a gyulladásos légúti hiperreaktivitás kialakulására utal. Az

endotoxinnal kiváltott bronchiális hiperreaktivitás a genetikailag módosított állatokban

szignifikánsan nagyobb volt, mint a vad típusú társaikban (29/A ábra). Az endotoxin-kezelést

követően egy nappal a légzésfrekvencia alapértéke mind a TRPA1+/+, mind a TRPA1-/-

csoportokban szignifikánsan csökkent a PBS-kezelés esetén mért értékekhez képest. A

carbachol inhaláció hatására ugyanakkor a légzésfrekvencia koncentráció-függő módon

csökkent a TRPA1-/- egerekben, a TRPA1+/+ csoportban viszont nem mutatott eltérést. A

génhiányos és a vad típusú csoport közötti különbség szignifikánsnak bizonyult (29/B ábra).

0

0

2

4

6

T R P A 1+ /+

P B S

T R P A 1- / -

P B S

T R P A 1+ /+

L P S

T R P A 1- / -

L P S

5 .5 1 1 2 2

**

C a rb a c h o l k o n c e n trá c ió (m M )

Pe

nh

A

+ +

+ +

+

+ + +

+ +

62

0

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

T R P A 1+ /+

P B S

T R P A 1- / -

P B S

T R P A 1+ /+

L P S

T R P A 1- / -

L P S

** *

C a rb a c h o l k o n c e n trá c ió (m M )

Lé

gz

és

fre

kv

en

cia

(B

PM

)

B

+

+ + +

+ +

+

+ + +

5 .5 1 1 2 2

29. ábra: Gyulladásos légúti hiperreaktivitás: carbachollal kiváltott bronchokonstrikció

(A) és légzésfrekvencia változások (B). (+p<0.05, ++p<0.01, +++p<0.001 vs. PBS-kezelt megfelelő

csoport; *p<0.05, **p<0.01 vs. LPS-kezelt TRPA1+/+; kétutas ANOVA+Bonferroni poszt teszt; n=5-10/csoport)

A TRPA1 receptor fontos szerepet játszik a gyulladásos neutrofil mieloperoxidáz aktivitás

fokozódásában a tüdőben

A főként neutrofil granulociták és makrofágok által termelt MPO enzim alapaktivitása közel

azonos volt a két PBS-el kezelt kontroll egércsoportban. Huszonnégy órával az LPS alkalma-

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

5 0

1 0 0

1 5 0

2 0 0

+ + +**

P B S -k e z e lt L P S -k e z e lt

MP

O a

kti

vit

ás

(U

nit

s/m

g t

üd

ő)

+

30. ábra: Az egyes tüdőminták mieloperoxidáz aktivitása 24 h-val az LPS beadása után.

(+p<0.05, +++p<0.001 vs. PBS-kezelt megfelelő csoport; **p<0.01 vs. LPS-kezelt TRPA1+/+; egyutas ANOVA +

Bonferroni poszt teszt; n=5-8/csoport)

63

zását követően a vad típusú egerekben jelentős mértékű MPO aktivitás növekedést

tapasztaltunk. Az MPO aktivitás emelkedése a TRPA1 génnel nem rendelkező egerekben

szignifikánsan nagyobb mértékű volt, mint a receptort expresszálni képes vad típusú társaik

esetében (30. ábra).

A TRPA1 receptor nem befolyásolja a tüdő endotoxinnal kiváltott szöveti elváltozásait

A PBS-el kezelt állatcsoportokhoz viszonyítva (31/A-B ábrák) szignifikáns mértékű

perivaszkuláris/peribronchiális ödéma, gyulladásos sejt akkummuláció és kehelysejt

hiperplázia alakult ki a vad típusú egerekben az LPS beadása után egy nappal (31/C és 32.

ábrák). Az endotoxinnal kiváltott gyulladás mértéke a TRPA1-/- egerekben hasonló mértékű

volt, mint amit az ugyanilyen kezelést kapott TRPA1+/+ állatok esetében tapasztaltunk (31/D

ábra). Ennek megfelelően az LPS-el kezelt egércsoportok összetett gyulladásos hisztopatológiai

pontszámai között sem láttunk különbséget (32. ábra).

31. ábra: A tüdő endotoxinnal kiváltott szöveti elváltozásai TRPA1+/+ (A, C) és TRPA1-/-

(B, D) egerekben. (hematoxilin-eozin festés; 200x nagyítás; a: alveolus, b: bronchiolus, v: venula, oed:

ödéma)

64

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

2

4

6

P B S -k e z e lt L P S -k e z e lt

+ +

Ös

sz

ete

tt h

isz

top

ato

lóg

iai

po

nts

zá

m

32. ábra: A tüdő gyulladásos elváltozásainak szemikvantitatív szövettani értékelése

TRPA1+/+ és TRPA1-/- egerekben. (++p<0.01 vs. PBS-kezelt TRPA1+/+; Kruskal-Wallis + Dunn-féle

poszt teszt; n=7-13/csoport)

A TRPA1 receptor nem befolyásolja a légzésfunkció krónikus dohányfüst expozíció által

kiváltott változásait

h ó n a p o k

Lé

gz

és

fre

kv

en

cia

(B

PM

)

0 1 2 3

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

5 5 0

6 0 0

T R P A 1+ /+

T R P A 1- / -

+ + + + + ++ +

+ + ++ + ++ + +

h ó n a p o k

TV

(m

l)

0 1 2 3

0 .2 0

0 .2 5

0 .3 0

0 .3 5

0 .4 0

T R P A 1+ /+

T R P A 1- / -

h ó n a p o k

PE

F (

ml/

se

c)

0 1 2 3

4

5

6

7

8T R P A 1

+ /+

T R P A 1- / -

h ó n a p o k

Me

an

Pe

nh

0 1 2 3

0 .4

0 .6

0 .8

1 .0T R P A 1

+ /+

T R P A 1- / -

A B

C D

33. ábra: A légzésfunkciós paraméterek változásai a 3 hónapig tartó dohányoztatás

során TRPA1+/+ és TRPA1-/- egerekben. (++p<0.01, +++p<0.001 vs. 0. hónap; kétutas ANOVA +

Bonferroni poszt teszt; n=7-28/csoport)

65

A légzésfrekvencia a krónikus dohányfüst expozíció első hónapjától kezdve mind a TRPA1+/+,

mind a TRPA1-/- egerekben szignifikánsan lecsökkent, a vad típusú és a génhiányos állatok

frekvenciaértékei között ugyanakkor nem volt különbség egyik mérési időpontban sem (33/A

ábra). A légzési térfogat, a PEF és a Mean Penh paraméterekben nem találtunk szignifikáns

változást a dohányzás 3 hónapja során (33/B-D ábra).

A TRPA1 receptor fontos szerepet játszik a tüdő dohányzás által kiváltott gyulladásos

elváltozásainak kialakulásában

A dohányoztatás megkezdése után egy hónappal mindkét vizsgált egércsoportban jelentős

mértékű perivaszkuláris ödéma alakult ki, amely a második és a harmadik hónapban

fokozatosan és szignifikánsan csökkent (34/A ábra). A TRPA1-/- (35/A,C,E,G ábrák) és a vad

h ó n a p o k

Pe

riv

as

zk

ulá

ris

öd

ém

a

1 2 3

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5T R P A 1

+ /+

T R P A 1- / -

+ + +

+ + ++ + +

h ó n a p o k

Ne

utr

ofi

l g

ra

nu

loc

itá

k

1 2 3

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0T R P A 1

+ /+

T R P A 1- / -

* *

h ó n a p o k

Ma

kro

fág

ok

1 2 3

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

T R P A 1+ /+

T R P A 1- / -

* *

h ó n a p o k

Alv

eo

láris

-in

ters

tic

iáli

s ö

dé

ma

1 2 3

0 .0

0 .5

1 .0

1 .5

2 .0

2 .5

T R P A 1+ /+

T R P A 1- / -

* *

A B

C D

34. ábra: A dohányfüst által kiváltott tüdőszöveti elváltozások szemikvantitatív

szövettani értékelése TRPA1+/+ és TRPA1-/- egerekben. (+++p<0.001 vs. 1. hónap, **p<0.01 vs.

TRPA1+/+; Kruskal-Wallis + Dunn-féle poszt teszt; n=6-13/csoport)

típusú (35/B,D,F,H ábrák) egerek között nem találtunk különbséget ebben a paraméterben.

Ugyanakkor az akkumulálódó neutrofil granulociták száma az első hónap végén magasabb volt,

66

a makrofág infiltráció, illetve az alveoláris-intersticiális ödéma mértéke viszont a második

hónapban alacsonyabb volt a TRPA1-/- csoportban, mint vad típusú társaikban (34/B-D ábra).

35. ábra: A krónikus dohányfüst expozíció által kiváltott tüdőszöveti elváltozások

TRPA1+/+ (A, C, E, G) és TRPA1-/- (B, D, F, H) egerekben. (hematoxilin-eozin festés; 200x

nagyítás; a: alveolus, b: bronchiolus, v: venula, oed: ödéma, e: emphysema)

A TRPA1 receptor hiányában a limfocita sejtek fokozott akkumulációja észlelhető

A bronchoalveoláris mosófolyadékban a limfociták mennyisége a dohányzás megkezdését

követő második hónap végén tendenciaszerűen, a harmadik hónap végére pedig már

67

szignifikánsan magasabb volt a TRPA1-/- egerekben a vad típusú állatokhoz képest. A neutrofil

granulociták és a makrofágok mennyiségében nem találtunk eltérést a két egércsoport között

(36. ábra).

g ra n u lo c iták

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0

1 0 0 0 0

se

jts

zá

m/m

l

m a k ro fá g o k

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

1 0 0 0 0

2 0 0 0 0

3 0 0 0 0

4 0 0 0 0

se

jts

zá

m/m

l

lim fo c iták

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

se

jts

zá

m/m

l

A B C

g ra n u lo c iták

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

4 0 0

se

jts

zá

m/m

l

m a k ro fá g o k

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

2 0 0

4 0 0

6 0 0

se

jts

zá

m/m

l

lim foc iták

T R P A 1+ /+

T R P A 1- /-

0

1 0 0

2 0 0

3 0 0

se

jts

zá

m/m

l

*

D E F

36. ábra: A bronchoalveoláris mosófolyadékban (BALF) található gyulladásos sejtek

koncentrációja két (A-C), illetve három hónapos (D-F) dohányoztatás után TRPA1+/+ és

TRPA1-/- egerekben. (*p<0.05 vs. TRPA+/+; párosítatlan t-próba; n=6-12/csoport)

2.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS

Eredményeink bizonyították, hogy a TRPA1 receptor protektív szerepet játszik az endotoxinnal

kiváltott bronchiális hiperreaktivitás kialakulásában, valamint a neutrofil granulociták és a

mononukláris sejtek aktiválódásában. Az akut intersticiális gyulladás általános mértékét

ugyanakkor nem befolyásolja a TRPA1 receptor. Ezen kívül kimutattuk, hogy a dohányfüst

expozícióval kiváltott krónikus légúti gyulladás átmeneti fázisában (második hónap) a TRPA1

ioncsatorna feltehetően közvetítő szerepet játszik a gyulladásos sejtek, elsősorban a

makrofágok infiltrációjában és az alveoláris-intersticiális ödéma létrejöttében. Érdekes módon

viszont a gyulladás krónikus fázisában (harmadik hónap) a TRPA1 gátló hatást fejt ki a

limfociták akkumulációjára. A receptor aktivációja a légzésfunkcióra nincs hatással (3.

táblázat).

68

Endotoxinnal kiváltott

akut gyulladás

TRPA1

génhiány

hatása

Dohányfüst expozícióval

kiváltott krónikus gyulladás

TRPA1

génhiány

hatása

Bronchiális

hiperreaktivitás Penh, f, PEF, TV

Mieloperoxidáz

aktivitás

Neutrofil granulocita

akkumuláció

Makrofág infiltráció

Gyulladásos

hisztopatológiai

elváltozások

Alveoláris-intersticiális

ödéma

Limfocita akkumuláció

3. táblázat: A TRPA1 receptor szerepe az akut és krónikus légúti gyulladásmodellekben

vizsgált különböző paraméterekben.

Korábbi adatok alapján jól ismert, hogy a légutak rendkívül gazdagon innerváltak kapszaicin-

érzékeny szenzoros rostokkal (Barnes, 1990; Watanabe és mtsai., 2005), melyek aktivációja

során felszabaduló neuropeptidek egyrészt bronchokonstrikciót (Szolcsányi és Barthó, 1982),

másrészt gyulladásos reakció kialakulását idézik elő (Lundberg, 1995; Maggi, 1995,

Szolcsányi, 1996). A kapszaicin-szenzítív primer afferensek végződésein mind a TRPA1, mind

a TRPV1 receptor expresszálódik (Nassenstein és mtsai., 2008). A légzőrendszerben nem

neuronális eredetű TRPA1 jelenlétét is kimutatták fibroblasztokon, epitél- és simaizomsejteken,

valamint limfocitákon is (Jaquemar és mtsai., 1999; Koh és mtsai, 1998; Stokes és mtsai., 2006;

Nassini és mtsai., 2012).

Számos irodalmi adat utal arra, hogy a TRPA1 receptor fontos szerepet tölt be a légzőrendszer

működésében és különböző légúti megbetegedések patomechanizmusaiban (Nassini és mtsai.,

2010; Banner és mtsai., 2011; Grace és mtsai, 2014). Szerepét kimutatták többek között a légúti

szenzitizáció, az asztma, a COPD és a krónikus köhögés kialakulásában (Bessac és Jordt, 2008;

Simon és Liedtke, 2008; Geppetti és mtsai., 2010; Yang és Li, 2016), azonban aktivációs

mechanizmusairól és pontos kórélettani szerepéről kevés és ellentmondásos adat áll

rendelkezésre. Ennek oka valószínűleg az a komplex szerep, ami a szenzoros

idegvégződéseken, valamint az epitél- és immunsejteken található TRPA1 receptorok eltérő

hatásainak tulajdonítható.

69

A TRPA1 ioncsatorna és a bakteriális endotoxin közötti kapcsolat vizsgálatakor azt találták,

hogy az LPS által kiváltott akut gyulladásos fájdalom- és érválasz a primer szenzoros

neuronokon expresszálódó TRPA1 aktivációján keresztül valósul meg (Meseguer és mtsai.,

2014). A TRPA1 receptor fahéjaldehiddel történő stimulálása ugyanakkor komplex

immunomodulátor hatásokat eredményezett az LPS-el kiváltott SIRS kialakulásában (Mendes

és mtsai., 2016). A TRPA1 és az LPS közötti interakció molekuláris mechanizmusának

komplexitását jól jelzi, hogy míg az LPS által kiváltott és a TRPA1 receptoron keresztül mediált

neurogén gyulladásos válasz a TLR4 jelátviteli útvonaltól függetlenül valósul meg (Meseguer

és mtsai., 2014), addig a fájdalmas hideg érzékelésében a TRPA1 aktivációja és p38-MAPK

szignalizációs mechanizmusok egyaránt részt vesznek (Obata és mtsai., 2005; Mizushima és

mtsai., 2006).

A TRPA1 receptor és a légúti simaizomzat működése között fennálló kapcsolatot tekintve

érdekes módon az ioncsatorna kontrakciót közvetítő szerepét írták le krónikus asztma

modellekben. Egyrészt az allergén-indukálta légúti gyulladás során a TRPA1 farmakológiai,

ill. genetikai gátlása a bronchiális hiperreaktivitás csökkenését idézte elő (Jha és mtsai, 2015),

másrészt a TRPA1 gén hiányában elmaradt a mérgező anyagok által kiváltott kémiai-irritatív

asztmát kísérő légúti válaszkészség-fokozódás (Devos és mtsai., 2016).

A TRPA1 receptornak a bronchiális simaizom kontrakcióban betöltött szerepével kapcsolatos

látszólagos ellentmondás feloldásához figyelembe kell vennünk azt a tényt, hogy az

endotoxinnal kiváltott pneumonitisz kísérletek során a légúti gyulladás akut mechanizmusaiban

vizsgáltuk a TRPA1 funkcióját, ellentétben a fent említett asztma modellekkel, melyekben a

krónikus folyamat során felszabaduló endogén mediátorok különbözőképpen és komplex

módon befolyásolhatják az ioncsatorna aktivációjának hatásait.

A TRPA1 receptornak a gyulladásos folyamatok akut fázisában fellépő bronchiális

hiperreaktivitással szemben kifejtett protektív hatását támasztják alá a munkacsoportunk által

végzett korábbi vizsgálatok is, melyek során részletesen elemezték a peptiderg primer

afferensek és a TRPV1 receptor szerepét az endotoxinnal kiváltott akut légúti gyulladás

kialakulásában (Elekes és mtsai., 2007; Helyes és mtsai., 2007). Ezek alapján a kapszaicin-

érzékeny érzőideg-végződések TRPV1 receptoron keresztüli aktivációja védő hatással bír mind

az endotoxinnal kiváltott légúti gyulladás, mind a következményes bronchiális hiperreaktivitás

kialakulásában.

Jelen eredményeink alapján a TRPV1-hez hasonlóan a TRPA1 receptor aktivációja is protektív

szerepet játszik nem csak a légúti hiperreaktivitás kialakulásában és a légzésfrekvencia

változásaiban, hanem a neutrofil granulocita ill. makrofág eredetű MPO termelésben is akut

70

pneumonitisz során. A két ioncsatorna hasonló funkciója egyébként nem meglepő annak

fényében, hogy koexpresszálódnak a kapszaicin-szenzitív szenzoros rostok végződésein

(Nassenstein és mtsai., 2008), sőt, irodalmi adatok alapján feltételezhető, hogy az általuk

mediált hatások közvetítése során sok esetben fizikai és funkcionális interakcióba is lépnek

egymással (Lee és mtsai., 2015). A TRPA1 receptor által kiváltott protektív folyamatokat a

primer afferensekből felszabaduló antiinflammatorikus neuropeptidek, ezek közül is elsősorban

a szomatosztatin magyarázhatja (Helyes és mtsai., 2009).

Arra vonatkozóan, hogy a TRPA1 receptornak fontos szerepe lehet a dohányfüst által a

légzőrendszerre gyakorolt káros hatások kialakulásában, több publikáció is megjelent, azonban

ezek túlnyomó része in vitro adatokon alapul. Tengerimalac izolált szervi kísérletek eredményei

szerint a cigarettafüst alkotóelemeinek vizes oldata (cigarettafüst kivonat = cigarette smoke

extract, CSE), illetve az abban megtalálható akrolein és krotonaldehid a CGRP és a SP Ca2+-

függő felszabadulását okozza a kapszaicin-érzékeny érzőideg végződésekből. Ezen kívül

kimutatták, hogy a CSE-indukálta tracheális plazma extravazáció és bronchokonstrikció

kialakulásában a TRPA1 receptor fontos szerepet játszik (André és mtsai., 2008). Újabb adatok

szerint a cigarettafüst kivonat fokozza a TRPA1 receptor expresszióját légúti epitélsejteken,

melynek közvetítésében a HIF1α transzkripciós faktor fontos szerepet játszik (Nie és mtsai.,

2016). Érdekes módon a dohányfüstben megtalálható másik toxikus anyagról, a nikotinról is

kimutatták, hogy magasabb koncentrációban (mM) alkalmazva képes aktiválni a TRPA1

receptort, sőt, ezek az ioncsatornák a nikotin inhalációval kiváltott bronchokonstrikció

közvetítésében is részt vesznek (Talavera és mtsai., 2009). Tekintettel arra, hogy a ROS és

különböző lipidperoxidációs termékek a TRPA1 receptor agonistájaként viselkednek, nem

meglepő, hogy a dohányzás által kiváltott COPD-t kísérő oxidatív stressz aktiválni képes ezeket

az ioncsatornákat (Bessac és Jordt, 2008).

Jelen kísérleteinkben a krónikus dohányfüst expozíció in vivo modelljében azt találtuk, hogy a

peribronchiális/perivaszkuláris ödéma mértéke mindkét vizsgált egércsoportban a dohányzás

első hónapjában (akut fázis) volt a legsúlyosabb, majd a vizsgálati periódus további részében

az ödéma fokozatosan megszűnt, és helyette granulocita-, makrofág- és limfocita-beáramlás

dominálta a szövettani képet. Ezen eredményeink összhangban állnak munkacsoportunk

legfrissebb adataival, melyek szerint az ödémaképződés az első, a sejtes gyulladás mértéke

pedig a második hónapban (átmeneti fázis) éri el maximumát ebben a modellben (Kemény és

mtsai., közlésre beküldve). A TRPA1 gén hiánya esetén a neutrofil granulociták akkumulációja

szignifikánsan magasabb volt a dohányzás megkezdése után egy hónappal, ugyanakkor a

makrofágok által dominált gyulladásos sejt-infiltráció, valamint a kialakuló alveoláris-

71

intersticiális ödéma mértéke szignifikánsan alacsonyabb volt a dohányzás második hónapjában.

Mindezek alapján feltételezhető, hogy a TRPA1 receptor aktivációja a dohányzással kiváltott

légúti gyulladás akut fázisában védő hatású, míg a folyamat előrehaladtával a

proinflammatorikus kaszkád tagjaként hozzájárul a szöveti gyulladás kialakulásához.

A jelenség egyik lehetséges magyarázata, hogy a dohányfüstben is megtalálható toxikus

vegyületek a TRPA1 receptor átmeneti aktivációján keresztül jellemzően védekező reakciókat

váltanak ki, a gyulladás krónikussá válása során termelődő endogén ágensek ugyanakkor az

ioncsatorna permanens stimulálásával folyamatosan fenntartják a neurogén gyulladás állapotát

(Chen és mtsai., 2012). Másfelől tekintetbe kell vennünk azt a fontos tényezőt, hogy a TRPA1

jelentős mértékű extraneurális expressziós mintázattal rendelkezik: a peptiderg primer

afferensek végződésein kívül a receptor számos immunsejten is megtalálható, többek között a

dohányfüst által kiváltott gyulladás átmeneti fázisában megjelenő makrofágokon is (Chao és

mtsai., 2008; Kun és mtsai., 2017). Mindezek figyelembe vételével valószínűsíthető, hogy a

TRPA1 különböző struktúrákon történő aktivációja eltérő jelátviteli mechanizmusokat indít be,

melynek eredményeképpen különböző hatások jönnek létre a krónikus gyulladás egyes

fázisaiban.

Az a tény, hogy kísérleteink során a dohányzás harmadik hónapjában (krónikus fázis) – amikor

az akutan kialakuló masszív gyulladásos reakció már csökkenő tendenciát mutat, és limfocita-

domináns szöveti kép látható (Kemény és mtsai., közlésre beküldve) – a TRPA1 gén hiánya a

limfocita sejtek fokozott akkumulációjához vezetett, felveti annak lehetőségét, hogy az

ioncsatorna aktivációja gátolni képes a krónikus gyulladást kísérő limfocita funkciókat.

Tekintve, hogy a TRPA1 extraneurális expressziójának vizsgálata során az ioncsatornát T- és

B-limfocitákon is kimutatták (Stokes és mtsai., 2006), illetve hogy a TRPA1 agonista

fahéjaldehid gátolja a limfocita proliferációt és fokozza a T-sejt differenciációt (Koh és mtsai.,

1998), valószínűsíthető, hogy a TRPA1 receptor szabályozó szerepet játszik a limfociták

működésében.

A légzőrendszer dohányfüst okozta funkcionális eltéréseinek komplex analízise kimutatta,

hogy a légzésfrekvencia mindkét vizsgált csoportban szignifikáns csökkenést mutatott a

dohányzás első hónapjától kezdve, a vad típusú és a TRPA1 génhiányos egerek között azonban

érdekes módon nem találtunk különbséget. Így eredményeink nem igazolják azt a korábbi, in

vitro adatokon alapuló feltételezést, mely szerint az ioncsatorna mediátor szereppel bír a

tüdőfunkció változásaiban.

Érdemes megjegyezni, hogy az endogén úton képződő H2S-ról leírták, hogy krónikus

dohányfüst expozíció esetén antiinflammatorikus és bronchodilatátor hatásokat képes kiváltani

72

(Chen és mtsai., 2011). Ez különösen annak fényében érdekes, hogy a H2S vaszkuláris

rendszerben kifejtett hatásairól kiderült, hogy azok a TRPA1 receptor aktivációján keresztül

valósulnak meg (l. Eredmények, megbeszélés és következtetések/1. fejezet). Mivel mind a

dohányfüstben megtalálható toxikus anyagok, mind pedig a H2S képes aktiválni a TRPA1-et,

feltételezhető a különböző szignalizációs útvonalaknak ezen a ponton történő interakciója.

Mindezek alapján pedig valószínűsíthető, hogy a TRPA1 receptornak a krónikus bronchitis

kialakulásában betöltött szerepe sokkal összetettebb, mint azt korábban gondoltuk.

Ugyan a TRPA1 receptornak a krónikus dohányfüst expozícióval kiváltott tüdőhatások

kialakulásában betöltött szerepéről megjelent irodalmi adatok többsége az ioncsatorna

gyulladásos reakciót közvetítő szerepére utal, jelen kísérleteink eredményei alapján

feltételezhető, hogy a TRPA1 receptor összetett szabályozó funkcióval rendelkezik ezekben a

krónikus gyulladásos folyamatokban. Sőt, mivel az endotoxinnal kiváltott akut légúti gyulladás

és a következményes bronchiális hiperreaktivitás vizsgálatára végzett kísérleteink eredményei

az ioncsatorna protektív, antiinflammatorikus szerepét igazolták, joggal valószínűsíthető, hogy

a kapszaicin-érzékeny érzőidegek és gyulladásos sejtek TRPA1 receptor általi aktivációja

komplex modulátor hatásokat eredményez a tüdő akut és krónikus gyulladásos folyamataiban.

73

3. A HK-1 SZEREPÉNEK VIZSGÁLATA ENDOTOXINNAL KIVÁLTOTT AKUT

LÉGÚTI GYULLADÁSMODELLBEN

3.1. EREDMÉNYEK

A hemokinin-1 nem befolyásolja az endotoxinnal kiváltott légúti hiperreaktivitást

A Penh alapértéke szignifikáns emelkedést mutatott az LPS beadása után 24 órával mind a vad

típusú, mind a Tac4-/- csoportban a PBS-kezelt kontroll állatokhoz képest. A carbachol

emelkedő koncentrációinak inhalációja koncentráció-függő bronchokonstrikciót okozott,

melynek mértéke az LPS-el kezelt egerekben szignifikánsan nagyobb volt. Ez az LPS által

kiváltott légúti hiperreaktivitás a Tac4 génhiányos egerekben hasonló mértékű volt, mint a vad

típusú társaikban (37/A ábra). Egy nappal az LPS intranazális alkalmazása után a

légzésfrekvencia alapértékének szignifikáns csökkenését tapasztaltuk mind a vad típusú, mind

a Tac4-/- egerekben, a PBS-kezelt állatokkal összehasonlítva. A carbachol belélegeztetését

követően a légzésfrekvencia mindkét LPS-kezelt csoportban koncentráció-függő módon

csökkent, nem volt különbség a vad típusú és a génhiányos egerek között (37/B ábra).

0

0

2

4

6

8

1 0 C 5 7 B l/6 P B S

T a c 4- / -

P B S

C 5 7 B l/6 L P S

T a c 4- / -

L P S

5 .5 1 1 2 2

+

+ +

A

C a rb a c h o l k o n c e n trá c ió (m M )

Pe

nh

1 0 0

1 5 0

2 0 0

2 5 0

3 0 0

3 5 0

4 0 0

4 5 0

5 0 0

5 5 0

6 0 0 C 5 7 B l/6 P B S

T a c 4- / -

P B S

C 5 7 B l/6 L P S

T a c 4- / -

L P S

0 5 .5 1 1 2 2

+

+

B

C a r b a c h o l k o n c e n tr á c ió (m M )

Lé

gz

és

fre

kv

en

cia

(B

PM

)

37. ábra: Gyulladásos légúti hiperreaktivitás. Carbachollal kiváltott (A)

bronchokonstrikció és (B) légzésfrekvencia változások. (+p<0.05, ++p<0.01 vs. PBS-kezelt

C57Bl/6; egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=14-16/csoport)

A hemokinin-1 gyulladáskeltő szerepet játszik a tüdő endotoxinnal kiváltott szöveti

elváltozásaiban

Az endotoxin i.n. alkalmazása peribronchiális/perivaszkuláris ödémát, a neutrofil granulociták

peribronchiális akkumulációját, az aktivált mononukleáris sejtek infiltrációját és a kehelysejtek

hiperpláziáját okozza a vad típusú egerekben (38/B ábra), míg a PBS-el kezelt kontroll állatok

74

tüdejében nem látható ilyen elváltozás (38/A ábra). Azokban az egerekben, amelyekben a Tac4

gén hiánya miatt nem termelődik hemokinin-1, az LPS kiváltotta pneumonitisz szövettani jelei

szignifikánsan enyhébbek voltak, mint vad típusú társaik esetében (38/C ábra). Ebből

következően az összetett hisztopatológiai pontszám is jelentősen alacsonyabb volt (39. ábra).

38. ábra: A tüdő endotoxinnal kiváltott szöveti elváltozásai C57Bl/6 (A-B) és

Tac4-/- (C-D) egerekben. (hematoxilin-eozin festés; A-C: 200x, D. 100x nagyítás; a: alveolus,

b: bronchiolus, v: venula, oed: ödéma)

Érdekes módon, az LPS-kezelt Tac4-/- egerek tüdejében – a jellegzetes gyulladásos hisztológiai

paraméterek csökkenése ellenére – peribronchiálisan és perivaszkulárisan elhelyezkedő

nagyméretű és igen denz, tüszőszerű limfoid struktúrákat észleltünk a tüdőben több helyen is.

Ez a jelenség sem a vad típusban, sem a munkacsoportunk által már korábban vizsgált többi

egértörzsben nem volt látható (38/D ábra).

75

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

0

2

4

6

8

1 0

*

+ + +

P B S L P S

Ös

sz

ete

tt h

isz

top

ato

lóg

iai

po

nts

zá

m

39. ábra: A tüdő endotoxinnal kiváltott gyulladásos elváltozásainak szemikvantitatív

szövettani értékelése C57Bl/6 és Tac4-/- egerekben. (+++p<0.001 vs. PBS-kezelt C57Bl/6, *p<0.05

vs LPS-kezelt C57Bl/6; Kruskal-Wallis + Dunn-féle poszt teszt; n=4-20/csoport)

A hemokinin-1 fontos szerepet játszik a neutrofil MPO aktivitás növekedésében a tüdőben

Mindkét PBS-kezelt csoportban hasonlóan alacsony biolumineszcens jelintenzitást mértünk.

Egy nappal az LPS beadását követően az endotoxinnal kezelt csoportokban a tüdők

jelintenzitása szignifikánsan magasabb volt a PBS-kezelt egerekhez képest, ami a fagocitotikus

sejtek fokozott szabadgyök (ROS/RNS) termelését jelzi. Az LPS-kezelt Tac4 génhiányos

egerek tüdejében szignifikánsan alacsonyabb biolumineszcens jelet mértünk a hasonló

kezelésben részesült vad típusú állatokéhoz képest (40. és 41. ábrák).

40. ábra: A tüdőminták biolumineszcens jelintenzitása 24 h-val a PBS (A, C)

ill. LPS (B, D), valamint 10 perccel az L-012 beadása után.

76

C 5 7 B l/6 T a c 4-/-

C 5 7 B l/6 T a c 4-/-

0

5 .01 0 5

1 .01 0 6

1 .51 0 6

2 .01 0 6

2 .51 0 6

*

+ + +

P B S L P S

To

tal

flu

x [

p/s

]

41. ábra: A tüdőmintákban mért biolumineszcens jelintenzitás kvantitatív analízise.

(+++p<0.001 vs. PBS-kezelt C57Bl/6, *p<0.05 vs LPS-kezelt C57Bl/6; egyutas ANOVA + Bonferroni poszt

teszt; n=3-6/csoport)

A hemokinin-1 fokozza a tüdőben mérhető mieloperoxidáz aktivitást

A PBS-kezelt egércsoportok tüdőmintáiban mérhető alap MPO aktivitásban nem tapasztaltunk

különbséget. Az LPS beadása után 24 órával a vad típusú egértüdőkben szignifikánsan

magasabb MPO aktivitást mértünk, mely a neutrofil granulociták és a mononukleáris sejtek

endotoxin-stimulusra adott válaszaként értelmezhető. Azokban az egerekben, amelyek a Tac4

C 5 7 B l/6 T a c 4-/-

C 5 7 B l/6 T a c 4-/-

0

2

4

6+ + +

* *

P B S L P S

MP

O a

kti

vit

ás

(U

nit

s/m

g t

üd

ő)

+ + +

42. ábra: Az egyes tüdőminták mieloperoxidáz aktivitása 24 h-val az LPS beadása után.

(+++p<0.001 vs. PBS-kezelt megfelelő csoport, **p<0.01 vs LPS-kezelt C57Bl/6; egyutas ANOVA + Bonferroni

poszt teszt; n=4-8/csoport)

77

gén hiánya miatt nem képesek hemokinin-1-et szintetizálni, az MPO aktivitás emelkedése

szignifikánsan kisebb volt a vad típusú társaikhoz képest (42. ábra).

A hemokinin-1 fokozza a gyulladásos citokinek termelődését a tüdőben

Az IL-1β, IL-6, KC, TNFα, MCP-1 és a MIP-1α koncentrációja közel azonos volt a kontroll

egércsoportokban. A vad típusú egerekben az LPS beadása után egy nappal az összes vizsgált

citokin szintje jelentősen megemelkedett. A Tac4 génhiányos egerek tüdejében az IL-1β, IL-6,

KC, TNFα és MCP-1 koncentrációi szignifikánsan alacsonyabbak voltak az LPS-kezelt vad

típusú állatokhoz képest, míg a MIP-1α szintje ennek megfelelően tendenciaszerűen

alacsonyabb volt (43. ábra).

IL -1

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

2 5 0 0 0

+ + +

***

pg

/g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

P B S L P S

IL -6

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

0

2 0 0 0

4 0 0 0

6 0 0 0

8 0 0 0 + +

***

pg

/g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

P B S L P S

K C

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

+ + +

***

pg

/g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

P B S L P S

T N F -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

0

1 0 0 0

2 0 0 0

3 0 0 0

4 0 0 0

5 0 0 0

+

**

pg

/g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

P B S L P S

M C P -1

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

0

5 0 0 0

1 0 0 0 0

1 5 0 0 0

2 0 0 0 0

+

***

pg

/g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

P B S L P S

M IP -1

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

C 5 7 B l/6 T a c 4- / -

0

2 0 0 0 0

4 0 0 0 0

6 0 0 0 0

8 0 0 0 0

pg

/g n

ed

ve

s s

zö

ve

t

P B S L P S

43. ábra: A tüdőhomogenizátumokban mért gyulladásos citokin koncentrációk.

(+p<0.05, ++p<0.01, +++p<0.001 vs. PBS-kezelt C57Bl/6, **p<0.01, ***p<0.001 vs. LPS-kezelt C57Bl/6; egyutas

ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=4/csoport)

3.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉS

Kísérletsorozatunkkal elsőként bizonyítottuk, hogy a hemokinin-1 fontos szerepet játszik az

endotoxinnal kiváltott intersticiális pneumonitisz kialakulásában. A Tac4 gén hiánya esetén az

immunsejtek, a neutrofil granulociták és makrofágok akkumulációja, aktivációja és gyulladásos

78

citokin termelése jelentős mértékben csökken. A csökkent gyulladásos válasz ellenére a légúti

válaszkészséget nem befolyásolja a hemokinin-1 hiánya (4. táblázat).

Endotoxinnal kiváltott akut pneumonitisz Tac4 génhiány hatása

Bronchiális hiperreaktivitás

Gyulladásos hisztopatológiai elváltozások

Mieloperoxidáz aktivitás

Proinflammatorikus citokinek termelődése

4. táblázat: A hemokinin-1 szerepe az akut intersticiális pneumonitisz különböző

paramétereinek kialakulásában.

Ugyan az endotoxinnal kiváltott pneumonitisz modell nem sorolható a klasszikus

betegségmodellek közé, mégis alkalmas a tüdő nem allergiás típusú gyulladásos folyamatainak

feltárására, valamint arra, hogy az ebben fontos szerepet játszó mediátorokról és a lehetséges

gyógyszercélpontokról minél több információt szerezhessünk (Kips és mtsai., 2003; Chen és

mtsai., 2010; Helyes és Hajna, 2012). Az emberi légutakban az endotoxin képes arra, hogy a

makrofágokat aktiválva gyulladásos citokinek (TNF-α, IL-1, IL-6) és arachidonsav metabolitok

felszabadulását idézze elő. Bár a makrofágok kulcsszerepet játszanak az LPS alkotóelemeinek

felismerésében, létezik egy makrofágoktól független, neutrofil granulociták által közvetített

útvonal is (Marasco és mtsai., 1984; Martin, 2000). Az endotoxin belélegzése megnöveli a teljes

fehérvérsejtszámot ill. a neutrofil granulociták mennyiségét az emberi vérben, valamint a

bronchoalveoláris mosófolyadékban és a köpetben (Michel, 2000).

Ennek a modellnek a segítségével munkacsoportunk és más kutatócsoportok részletesen

vizsgálták a jellegzetes gyulladásos mediátorok (citokinek, kemokinek, neutrofil granulociták,

makrofágok, natural killer sejtek), a kapszaicin-érzékeny érzőideg végződések, a neuro-immun

interakciók, illetve a bronchopulmonális funkcionális eltérések és a gyulladás kapcsolatát is

(Elekes és mtsai., 2007; Takeda és mtsai., 2011). Munkacsoportunk korábbi kísérletei

kimutatták, hogy a Tac1 gén által kódolt tachykininek, a P-anyag és az NKA, valamint a NK1

receptor fontos szabályozó szerepet játszanak ezekben a folyamatokban (Elekes és mtsai., 2007;

Helyes és mtsai., 2010).

79

A HK-1 szerkezete, immunológiai és receptor kötődési tulajdonságai jelentős hasonlóságot

mutatnak a P-anyagéval, de egyre több adat utal arra, hogy e hasonlóságok ellenére a HK-1 a

P-anyagétól eltérő funkciókkal rendelkezik. Míg a P-anyag és az NKA elsősorban a kapszaicin-

érzékeny érzőideg végződésekből szabadulnak fel (Helyes és mtsai, 2010), addig a HK-1

elsősorban gyulladásos és immunsejtekben termelődik. Ezen kívül a tüdőben a Tac4 gén sokkal

nagyobb mértékben expresszálódik, mint a Tac1 gén (Duffy és mtsai., 2003; Page, 2006).

Mikroglia sejtekben kimutatták, hogy az LPS képes fokozni a HK-1 expresszióját, melynek

közvetítésében az NF-κB és a p38-MAPK útvonalnak is fontos szerepet tulajdonítanak (Sakai

és mtsai., 2012). A HK-1 és a MAPK útvonal kapcsolata a B-sejtek proliferációs folyamataiban

is igazolódott (Wang és mtsai., 2010).

Érdekes módon, munkacsoportunknak az NK1 génhiányos egértörzzsel kapott korábbi

eredményeivel ellentétben, ahol nem volt különbség a gyulladásos szövettani eltérésekben

(Helyes és mtsai., 2010), a HK-1 hiánya esetén szignifikánsan csökkent az ödéma és a

gyulladásos sejtek akkumulációja is. Ezen kívül a neutrofil granulociták és a makrofágok

aktivációjának köszönhető MPO aktivitás is markánsan csökkent a Tac4 génhiányos egerekben,

míg a korábbi kísérletek alapján az NK1-/- és a vad típusú állatok között ebben a paraméterben

sem volt különbség (Helyes és mtsai., 2010). A szövettani eredmények és az MPO aktivitás

párhuzamos változása arra enged következtetni, hogy a HK-1 fontos szerepet játszik a tüdő

endotoxinnal kiváltott gyulladásos folyamataiban, de ezt a hatását nem az NK1 receptor

közvetíti.

Jelen eredményeinkhez hasonlóan, munkacsoportunk korábban publikált eredményei

kimutatták, hogy a komplett Freund adjuvánssal (CFA) kiváltott krónikus egér artritisz

modellben az ízületi gyulladásos folyamatok az NK1 receptor aktivációtól függetlenül mennek

végbe, míg a következményes mechanikai hiperalgézia NK1-receptor mediált folyamat

(Borbély és mtsai., 2013). Ezek az eredmények tovább erősítik azt a feltételezést, hogy a HK-

1 valószínűleg rendelkezik egy specifikus saját receptorral, amely a perifériás gyulladáskeltő

hatások közvetítéséért felelős (Endo és mtsai., 2006.; Borbély és mtsai., 2013).

Az a megfigyelés, hogy az LPS-kezelt Tac4-/- egerek tüdejében olyan, az erekhez és

bronchusokhoz asszociált, nagyméretű, denz, tüszőszerű struktúrák voltak láthatók, melyek

más génhiányos egértörzsekben nem voltak megfigyelhetők, arra enged következtetni, hogy az

endotoxinnal kiváltott pneumonitisz során a HK-1 feltehetően részt vesz a limfocita aktiváció

szabályozásában is. Ezzel az in vivo modellben kapott eredménnyel elsőként mutattuk ki a HK-

1 ilyen jellegű szerepét légutakban, mely összhangban áll a HK-1 korábban leírt, B-limfocita

fejlődést serkentő funkciójával (Zhang és mtsai., 2000; Berger és mtsai., 2010).

80

Ismert, hogy az endotoxinnal kiváltott pneumonitisz során a makrofágokon kívül elsősorban

neutrofil granulociták aktiválódnak (Savov és mtsai., 2002). Ezért fontos kiemelni, hogy a Tac4

génhiányos állatokban nemcsak a neutrofil granulociták és makrofágok akkumulációja, hanem

azok aktivációja is csökkent mértékben valósul meg, erre utalnak az MPO aktivitás mérése

során, illetve a reaktív oxigén szabadgyökök (ROS) ex vivo biolumineszcens képalkotással

történő vizsgálata során kapott eredményeink. Mivel az általunk vizsgált modellben ennek a két

paraméternek a változásai jól korreláltak egymással, így valószínűsíthetjük, hogy a tüdőben

mért biolumineszcens jelintenzitás az MPO aktivitás eredményeképpen jött létre.

A LPS-kiváltotta gyulladásos reakció során számos gyulladáskeltő citokin szabadul fel, így pl.

a TNFα, IL-1β, IL-6 és KC (Helyes és Hajna, 2012). A jelen kísérleteinkben vizsgált citokineket

(IL-1β, IL-6, KC, TNFα, MIP-1α és MCP-1) főként aktivált makrofágok és monociták termelik.

Ezen kívül az IL-1, IL-6, KC és MIP-1α a neutrofil granulociták aktivációjában is szerepet

játszik (Menten és mtsai., 2002; Deshmane és mtsai., 2009). Az egyes gyulladáskeltő citokinek

kölcsönhatásaival kapcsolatban ismert az is, hogy endotoxin stimuláció esetén a MIP-1α

fokozza az IL-1, IL-6 és TNFα szintézisét (Fahey és mtsai., 1992), tovább növelve a

gyulladásos reakció mértékét, míg a HK-1 és a citokin rendszer (IL-1β, TNFα) között létező

kapcsolat in vitro kísérletek alapján szintén felvetődött (Berger és mtsai., 2007). Kísérleteink

segítségével kimutattuk, hogy Tac4-/- egerekben a gyulladásos citokin szintek LPS-indukálta

emelkedése jelentősen alacsonyabb volt, tovább erősítve azt a megfigyelést, mely szerint a HK-

1 kulcsszerepet játszik a tüdő gyulladásos folyamatai során létrejövő citokin termelődésben és

a következményes immunsejt aktivációban.

A P-anyaggal és az NKA-val ellentétben a HK-1 nem befolyásolja sem a légzésfrekvenciát,

sem a légúti hiperreaktivitást. Ugyan megjelentek adatok arra vonatkozóan, hogy a hHK-1

képes bronchokonstrikciót kiváltani (Grassin-Delyle és mtsai., 2010), a HK-1 esetében ez a

hatás nem igazolódott az általunk használt az egérmodellben. Ennek oka valószínűleg abban

keresendő, hogy a hemokininek és endokininek csoportja emberben bonyolultabb rendszert

alkot, mint amilyen az egerekben fellelhető. A humán TAC4 gén négy különböző splice

variánssal rendelkezik, amelyek szekvenciája különbözik az egérben található megfelelőiktől,

sőt az expressziós mintázatuk is eltérő: a γ- és δTAC4 a perifériás szövetek jóval nagyobb

hányadában mutatható ki, mint az α- és βTAC4 (Page, 2004). A kódolt peptidek szerkezetbeli

különbségein kívül eltérőek a receptorkötődési tulajdonságaik is: a HK-1-el ellentétben az EKC

és EKD például gyakorlatilag alig kötődik a jelenleg ismert NK receptorokhoz (Page, 2005).

Egy másik lehetséges magyarázat, hogy a gyulladásos eredetű bronchokonstrikciót elsősorban

az NK2 receptor közvetíti, ahogy azt munkacsoportunk korábbi eredményei is kimutatták

81

(Elekes és mtsai., 2007; Helyes és mtsai., 2010), ugyanakkor a HK-1 sokkal kisebb affinitással

kötődik az NK2 receptorhoz, mint az NK1-hez (Bellucci és mtsai., 2002).

Jelen eredményeinkkel elsőként bizonyítottuk, hogy a hemokinin-1 fontos mediátor szereppel

bír a légúti gyulladás kialakulásában. Részt vesz az endotoxinnal kiváltott perivaszkuláris

ödémaképződésben, a neutrofil granulociták és makrofágok akkumulációjában és

aktivációjában, de nem befolyásolja légúti válaszkészséget. Ezen kívül a HK-1 feltehetően

specifikus szabályozó szerepet játszik a limfocita funkciókban gyulladásos körülmények

között, melynek pontos mechanizmusa egyelőre még nem ismert.

82

4. PATKÁNY DIABÉTESZ MELLITUSZ MODELL KIFEJLESZTÉSE A

KRÓNIKUS SZÖVŐDMÉNYEK KOMPLEX VIZSGÁLATÁRA

4.1. EREDMÉNYEK

Az állatok vércukor szintjének, testsúlyának, víz- és táplálékfogyasztásának változásai a

vizsgálat ideje alatt

A kísérletben részt vevő állatok vércukor értékei alapján a kialakult diabétesz négy súlyossági

fokát különböztettük meg. A Kontroll állatoknál mért vércukor szintekhez képest (5-7 mmol/l),

az egyes csoportok átlagos értékei a következőképpen alakultak. Az (I) csoportban 8-10

mmol/l-es vércukor szinteket mértünk, mely egy ún. „enyhe diabéteszes” állapot kialakulását

eredményezte. A (II) csoport vércukor értékei a 16-18 mmol/l-es tartományban voltak, amely

egy ún. „enyhe-közepes diabétesz” kialakulására utalt. A (III) csoport állatainál a vércukor

szintek 22-25 mmol/l-ra emelkedtek, melynek eredményeképpen ún. „közepes fokú” diabétesz

kialakulásáról beszélhetünk. A (IV) csoport esetében a vércukor értékek a 30-33 mmol/l-es

tartományba estek, „súlyos fokú” diabétesz kialakulását okozva ezzel. Az első három

csoportban a kísérlet teljes időtartama alatt, azaz 16 héten át, míg a (IV) csoportban csak 12

héten keresztül tudtuk vizsgálni a különböző diabétesz okozta komplikációk létrejöttét (1.

táblázat, 44/A ábra). Az (I)-(III) csoportok állatainak súlygyarapodása alig maradt el a Kontroll

állatokban megfigyelhető, normál súlygyarapodáshoz képest. A (IV) csoportban ugyanakkor ez

a fiziológiás súlygyarapodás teljes mértékben elmaradt, ehelyett a vizsgálati periódus végén

egy 13.4 %-os súlyvesztést észleltünk a streptozotocin-kezelést megelőző kontroll méréshez

képest (233.0 ± 24.62 g vs. 269.63 ± 10.49 g, 44/B ábra). Az (I) és (II) csoportok testsúlyra vo-

83

44. ábra: A vércukor szint (A), a testsúly (B), valamint a testsúlyra vonatkoztatott

folyadék- (C) és táplálékfogyasztás (D) változásai a kísérleti periódus teljes időtartama

alatt. (*p<0.05, ***p<0.001 vs Kontroll; egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=6-14/csoport)

84

natkoztatott víz- és táplálékfogyasztása gyakorlatilag nem különbözött a Kontroll állatokétól.

A (III) csoportban ezek a paraméterek közepes mértékben megemelkedtek, a (IV) csoport

esetében pedig már a Kontroll állatokénál jelentősen magasabb relatív víz- és

táplálékfogyasztást észleltünk (44/C-D ábra). Az (I) és (II) csoportokkal ellentétben a (III) és

(IV) csoportok eredményei minden vizsgált paraméter esetén szignifikáns eltérést mutattak a

Kontroll csoporthoz képest.

A szem elülső szegmensének neovaszkularizációja, valamint a hátsó póluson észlelt

patológiás elváltozások

45. ábra: A szem elülső (A-D) és hátsó (E-F) szegmenséről készült reprezentatív

felvételek: Kontroll (A, C, E), ill. (III) diabéteszes csoportból (B, D, F) származó minták.

(D: patológiás érújdonképződés a cornea stromában (vastag nyilak); F: dilatált kapillárisok a GCL-ben (páros

nyílhegyek) és a choroideában (csillag), érújdonképződés az ILM és GCL határán (vastag nyilak))

85

A fundoszkópos vizsgálatok során kiderült, hogy a (III) és (IV) csoport állatainál jelentős

mértékű neovaszkularizáció alakult ki a szem elülső szegmensén (45/A-B ábra), melyet

szövettani vizsgálatok segítségével is igazoltunk (45/C-D ábra). A Kontroll és az (I) csoport

esetében neovaszkularizáció egyáltalán nem volt kimutatható, ugyanakkor a (IV) csoportban

észlelt neovaszkularizáció mértéke szignifikánsan magasabb volt, mint a (II) és a (III) csoportok

esetén mért értékek (46/A ábra).

46. ábra: (A) Az elülső szegmens neovaszkularizációjának, illetve (B) a hátsó pólus

elváltozásainak kvantitatív értékelése. (***p<0.001 vs Kontroll csoport; ##p<0.01, ###p<0.001 vs. (I)

diabéteszes csoport; egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=6-14/csoport

86

A (II), (III) és (IV) csoportok össz retina pontszáma (TRS) szignifikánsan megemelkedett nem

csak a Kontroll állatoknál, de az (I) csoportnál mért értékekhez képest is. Ezen kívül a (III) és

(IV) csoportok TRS értékei szignifikánsan magasabbak voltak a (II) csoport állatainál

észlelthez képest (46/B ábra). Az intraretinális és choroideális neovaszkularizáció jelenlétét a

szemfenék fénymikroszkópos vizsgálata szintén igazolta (45/E-F ábra).

A diabéteszes retinopátiában észlelt hisztológiai elváltozások

A Kontroll állatok szemmintáiból készült preparátumokon jól megfigyelhetők a retina

anatómiai rétegei (kívülről befelé haladva): fotoreceptor réteg (photoreceptor layer, PL), külső

magvas réteg (outer nuclear layer, ONL), külső rostos réteg (outer plexiform layer, OPL) belső

magvas réteg (inner nuclear layer, INL), belső rostos réteg (inner plexiform layer, (IPL) és a

ganglionsejtes réteg (ganglion cell layer, GCL) (47/A ábra).

47. ábra: A diabétesz retinára gyakorolt hatásának vizsgálata szövettani (A, B) és

immunhisztokémiai (C-H) módszerekkel. Kontroll: A, C, E, G; (III) csoport: B, D, F, H.

87

A retina fénymikroszkópos vizsgálata során a diabéteszes retinákban a külső és belső

határmembrán közötti (OLM-ILM) távolság, valamint az OPL és az IPL vastagságának enyhe

eltéréseit észleltük a Kontroll csoport állataihoz képest (47/A-B és 48/A-B ábrák). Ezen kívül

a GCL réteg 100 µm-ére számított összsejtszám ill. a ganglionsejtek száma is szignifikánsan

alacsonyabb volt a diabéteszes állatokban (48/C-D ábra); ez utóbbi paraméter a (III) csoportban

szignifikánsan különbözött a (II) és (IV) csoportok állatainál mért értékekhez képest.

48. ábra: A retina kvantitatív morfometriai értékelése.

(*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 vs Kontroll csoport; #p<0.05, ##p<0.01 vs. (I) diabéteszes csoport;

egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=6-10/csoport)

A retina immunhisztokémiai vizsgálata során jelentős mértékben emelkedett GFAP

immunoreaktivitást észleltük minden diabéteszes csoportban, hiszen a Kontroll retinákkal

88

ellentétben – ahol a GFAP-jel szelektíven a Müller–sejtek végtalpára lokalizálódik (47/C ábra)

– az (I)-(IV) csoportok állatainál a GFAP-aktivitás a retina teljes szélességében kimutatható

volt (47/D ábra).

A diabéteszes retinák többségében a csapok külső szegmensének súlyos degenerációja

figyelhető meg, ezen kívül az OPL rétegben található csap terminálisok száma is szignifikánsan

alacsonyabb volt a (II)-(IV) csoportokban, mint a Kontroll állatok esetében (47/E-F és 48/E

ábrák). A rövid távú diabétesz indukcióra igen érzékeny dopaminerg amakrin sejtek (Szabadfi

és mtsai, 2012; Szabadfi és mtsai., 2014) nyúlványai fiziológiás körülmények között a retina

INL és IPL rétegeinek határán találhatóak (47/G ábra). A (III) és (IV) csoportokban

elvékonyodott nyúlványokat észleltünk, sőt, a (IV) csoport esetében ezek a nyúlványok sok

esetben teljesen el is tűntek (47/H ábra).

A TUNEL-pozitív apoptotikus sejtek jelenléte a diabéteszes állatok összes csoportjában, a

retina összes magvas rétegében (ONL, INL és GCL) igazolható volt, melyek közül az ONL

érintettsége volt a legsúlyosabb. Az apoptotikus sejtek között találtunk fotoreceptorokat,

bipoláris, amakrin és horizontális sejteket, valamint Müller glia és ganglion sejteket is. A

TUNEL pozitív sejtek száma szignifikánsan magasabb volt a (III) és (IV) csoportokban a

Kontroll retinákhoz képest (48/F ábra).

Az elektronmikroszkópiai vizsgálatok során a (III) és (IV) csoportokban jól megfigyelhető volt,

hogy a pigment epitélium degenerációjának első jeleként az epitélsejtek elvesztették a

mikrovillusaikat, a sejttestekben pedig vakuólumok jelentek meg (49/B ábra), ellentétben a

Kontroll preparátumokon látható ép morfológiai viszonyokkal (49/A ábra). A (II)-(IV)

csoportokban ezen kívül degeneratív elváltozásokat, diszkontinuitást, ill. a choroideából a

retinába betüremkedő érgomolyagok is megfigyelhettünk. A retinális szalag (ribbon)

szinapszisok és más szinaptikus struktúrák is patológiás elváltozásokat mutattak a diabéteszes

állatcsoportokban. Az OPL rétegben a fotoreceptorok szalag szinapszisainál inkomplett

posztszinaptikus triád szerkezeteket észleltünk (49/D ábra). A szinaptikus struktúrákat az IPL

réteg esetében az összes diabéteszes csoportban jobb általános állapotban találtuk, mint az OPL-

ben; előbbiben a hagyományos szinaptikus kapcsolódások mellett bipoláris ribbon

szinapszisokat is láthatók voltak (49/C,E ábrák). Az IPL réteg degenerációja a (III) csoportban

jelentkezett legnagyobb mértékben (49/F ábra), melynek hátterében a funkcionális integritás

súlyos károsodása feltételezhető. A (III)-(IV) csoportok állataiból származó minták esetében

olyan, a retinára nem jellemző struktúrákat figyelhettünk meg, mint az OPL, INL és IPL

rétegekben található makrofágok, ill. a - valószínűleg az üvegtestből származó - mikroglia

sejtek az IPL rétegben. Ezen kívül a (IV) csoportban mind a ganglionsejtek, mind az ILM réteg

89

körül degeneratív elváltozásokat észleltünk. Sőt, a (III) csoportból származó retinák ILM

rétegében jól látható, hogy az ún. „tight junction” struktúrákat alkotó gliasejt membránok

elváltak egymástól, az ILM súlyos degenerációját okozva ezzel (49/G,H ábrák).

49. ábra: A diabétesz által okozott retina elváltozások elektronmikroszkópos vizsgálata.

Kontroll: A, C, E, G; (III) csoport: B, D, F, H.

A diabéteszes nefropátiában észlelt hisztológiai elváltozások

A PAS-pozitív glomeruláris terület (50/A-B ábra) relatív százalékos aránya mindegyik

diabéteszes állatcsoportban szignifikánsan megemelkedett a Kontrollhoz képest, ráadásul a

(IV) csoport esetében mért érték szignifikánsan magasabb volt az összes többi vizsgált

csoporténál (Kontroll: 11.74 ± 1.28%; (I) csoport: 24.80 ± 1.83; (II) csoport: 25.36 ± 1.24; (III)

csoport: 23.66 ± 1.43; (IV) csoport: 56.96 ± 8.00). Ezen kívül a (III) csoportból származó

vesemintákban a teljes glomeruláris terület szignifikánsan alacsonyabb volt a Kontroll

csoporténál, amely feltehetőleg a glomerulosclerosis létrejöttére utal (18.13 ± 1.36 vs. Kontroll

21.94 ± 1.13%). Az elektronmikroszkópos vizsgálatok során a glomeruláris bazálmembrán

90

szegmentális megvastagodását, a podocita lábak nyúlványainak multifokális fúzióját, valamint

a mezangiális mátrix expanzióját észleltük, melyek mind a DNP kialakulásának jeleiként

értékelhetők (50/C-D ábra).

50. ábra: A veseglomerulusok és –tubulusok szövettani elváltozásai diabétesz hatására.

Kontroll: A, C, E, G; (III) csoport: B, D, F, H.

Az Armanni-Ebstein jelenséget, azaz a súlyos diabéteszes állapotban a vesetubulusok epitél

sejtjeiben megjelenő glikogén granulumokat - melyek PAS-pozitivitása diasztáz enzimmel

emészthető -, az (II)-(IV) csoportok állatainak 33.3%, 81.8% ill. 100%-ában tudtuk igazolni, a

Kontroll és az (I) csoportban viszont egyáltalán nem észleltünk ilyen elváltozásokat (50/E-F

ábra).

A diabéteszes nefropátia laboranalitikai értékelése

A kísérleti periódus végére a kiválasztott vizelet mennyisége szignifikáns mértékben

megnövekedett mind a (II), mind a (III) csoportokban, ráadásul nem csak a Kontroll, hanem az

(I) csoport értékeivel összehasonlítva is (18.41 ± 3.07 ml és 28.00 ± 6.27 ml vs. 9.50 ± 0.64 ml

és 10.67 ± 1.62 ml). A vizeletmennyiség kiválasztásának ilyetén mértékű fokozódása jelentős

poliuriára utal. A (IV) csoportban ugyanakkor, egy poliuriás fázist követően, a vizsgálati

időszak végére nagymértékben lecsökkent a kiválasztott vizelet mennyisége (17.80 ± 2.94 ml

91

és 15.00 ± 1.65 ml vs. Kontroll 10.81 ± 1.38 ml), mely ebben az esetben a fenyegető anuria

jeleként fogható fel. A vizeletben található, kreatininre vonatkoztatott összfehérje mennyiség

(totál protein/kreatinin arány) az (I) és (II) csoportokban enyhén megemelkedett (126.87 ±

15.87 mg/mmol és 111.74 ± 8.61 mg/mmol vs. Kontroll 88.49 ± 7.04 mg/mmol). A (III) és (IV)

csoportokban ez az arányszám az előzőektől eltérő módon változott: míg a kísérlet első felében

nagymértékű emelkedést figyelhettünk meg (160.51 ± 17.93 mg/mmol és 135.67 ± 16.95

mg/mmol vs. Kontroll 93.98 ± 5.70 mg/mmol), a vizsgálati időszak végére jelentős csökkenést

tapasztaltunk (107.88 ± 7.25 mg/mmol és 100.61 ± 19.48 mg/mmol vs. Kontroll 88.49 ± 7.04

mg/mmol). A mikroalbumin kiválasztás a kísérleti periódus első felében a (III) csoportban

megemelkedett a Kontrollhoz viszonyítva (12.96 ± 2.84 mg/l vs. 6.58 ± 0.83 mg/l), de később

itt is csökkenő értéket mértünk (4.01 ± 1.03 mg/l vs. 6.43 ± 1.06 mg/l).

Mechanikai hiperalgézia és hideg allodínia

K o n tro ll ( I) c s o p o r t ( I I) c s o p o r t ( I I I) c s o p o r t

4 0

4 2

4 4

4 6

4 8

5 0

5 2

***

Érin

tés

i é

rz

ék

en

ys

ég

:

me

ch

an

on

oc

ice

ptí

v k

üs

zö

b (

g)

K o n tro ll ( I) c s o p o r t ( I I) c s o p o r t ( I I I) c s o p o r t

0

2

4

6

8

1 0

1 2

1 4

***

******

Ny

om

ás

érz

ék

en

ys

ég

:

me

ch

an

on

oc

ice

ptí

v k

üs

zö

b (

g)

K o n tro ll ( I) c s o p o r t ( I I) c s o p o r t ( I I I) c s o p o r t

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

***

***# #

Fa

ro

k v

iss

za

hú

zá

si

late

nc

iaid

ő

0°C

-os

víz

fürd

őb

ől

(se

c)

K o n tro ll ( I) c s o p o r t ( I I) c s o p o r t ( I I I) c s o p o r t

0

2 0

4 0

6 0

8 0

1 0 0

1 2 0

1 4 0

*** ******

Vé

gta

g v

iss

za

hú

zá

si

late

nc

iaid

ő

0°C

-os

víz

fürd

őb

ől

(se

c)

A B

C D

51. ábra: A diabéteszes neuropátia vizsgálata a mechanikai hiperalgézia (A-B) és a hideg

allodínia (C-D) részletes elemzésével. (*p<0.05, ***p<0.001 vs Kontroll csoport; ##p<0.01 vs. (I)

diabéteszes csoport; egyutas ANOVA + Bonferroni poszt teszt; n=6-10/csoport)

Az érintési és nyomásérzékenység vizsgálata során mindegyik diabéteszes csoportban

szignifikánsan alacsonyabb mechanonociceptív küszöböt detektáltunk, mint a Kontroll állatok

92

esetében (51/A-B ábra). Ezen kívül a hátsó végtagok jeges vízből történő visszahúzási

latenciaideje is szignifikánsan alacsonyabb volt a diabéteszes csoportok mindegyikében (51/C

ábra). Mindezen mérési eredmények egyértelmű jelei a mechanikai allodínia és hiperalgézia,

valamint a hideg allodínia kialakulásának. Míg a fenti a változások hasonló mértékűek voltak

az (I)-(III) állatcsoportokban, addig a 0°C-os vízből történő farokvisszahúzási latenciaidő

egyértelmű hiperglikémia-függést mutatott (51/D ábra).

A plazma inzulin koncentrációja

A plazma inzulin szintek tekintetében nem találtunk különbséget a (III) diabéteszes csoport,

valamint a Kontroll állatok között (19.93 ± 2.95 µNE/ml vs. 18.92 ± 0.98 µNE/ml).

4.2. MEGBESZÉLÉS ÉS KÖVETKEZTETÉSEK

Jelen tanulmányunkban különböző inzulin kezelési protokollokat alkalmaztunk annak

érdekében, hogy az állatok viszonylagosan jó általános állapotban tartása mellett hosszú ideig

fenntarthassuk a hiperglikémiás állapot különböző súlyossági fokait. A nyújtott hatású inzulin

implantátumok (Havel és mtsai., 2000) használata alkalmasnak bizonyult arra, hogy

segítségével célzott glikémiás kontrollt hozzunk létre. Az implantátumok különböző

„dózisainak” alkalmazása lehetővé tette a hiperglikémia eltérő súlyossági fokainak beállítását,

következésképpen a hiperglikémia-függő patológiai állapotok vizsgálatát. Kísérleteink során

elsősorban olyan elváltozásokra fókuszáltunk, amelyek humán diabéteszben is megtalálhatók,

de ugyanakkor jól kvantifikálhatók is. Komplex vizsgálatsorozatunk során a diabéteszes

patkányok (III) csoportja bizonyult a krónikus szövődmények leginkább alkalmas modelljének,

ahol a szem, a vesék és a perifériás idegrendszer elváltozásait 16 héten át vizsgáltuk a diabétesz

kiváltását követően.

Diabétesz mellituszban a szem csökkent kapilláris perfúziója következtében fokozódik a

vaszkuláris endoteliális növekedési faktor (VEGF) termelése, amely fontos szerepet játszik

mind az anterior szegmens, mind a retina neovaszkularizációjában, így valószínűsíthető, hogy

jelentősége van a szaruhártya és az írisz, valamint a papilla érintettségében is (Jiang és mtsai,

2009; Klaassen és mtsai., 2013). A DR kialakulása során sérül a belső vér-retina gát, melynek

eredményeképpen mikroaneurizmák és intraretinális bevérzések jönnek létre, a kiserek

abnormális fenesztrációja pedig makula ödémát és üvegtesti bevérzéseket okoz (Klaassen és

mtsai., 2013). Jelen kísérleteink során bebizonyítottuk, hogy az olyan jellegzetes paraméterek,

mint az anterior szegmens neovaszkularizációval érintett területének aránya, ill. a TRS

segítségével definiált retinális elváltozások, egyértelműen hiperglikémia-függő módon

93

viselkednek. Ezen kívül a GFAP fokozott expressziójának kimutatásával egyértelmű

bizonyítékot szolgáltattunk a metabolikus stresszállapot kialakulására a patkány retinában.

Habár a GFAP fiziológiás körülmények között nem, vagy nagyon kis mértékben expresszálódik

a Müller glia sejtek végtalpában (Bignami és Dahl, 1979; Chang és mtsai., 2007), kísérleteink

során kimutattuk, hogy a (III) csoport állatainak esetében az ideghártya teljes vastagságában

fokozott GFAP immunoreaktivitás tapasztalható. A Müller sejtek ilyen fokú aktivációja a teljes

retinát érintő súlyos metabolikus károsodás immunhisztokémiai markereként teinthető, amely

ebben az esetben a diabéteszes retinakárosodás egyértelmű jele. A károsodott sejtmetabolizmus

az ideghártyában található neuronok apoptotikus folyamatainak beindulásához vezet, melynek

eredményeképpen a dopaminerg amakrin sejtek és a ganglion sejtek fokozatos, kumulatív

csökkenését okozza (Nishimura és Kuriyama, 1985; Shirao és Kawasaki, 1998; Osborne és

mtsai., 2004; Liu és mtsai., 2008). Ez a folyamat már 4 héttel a diabétesz indukció után

megkezdődik, és folyamat előrehaladása, romlása akár 12 hónapon keresztül is megfigyelhető

(Zeng és mtsai., 2000; Kern és Barber, 2008; Szabadfi és mtsai., 2014). Jelen tanulmányunkban

kimutattuk, hogy a fotoreceptorok csap terminálisain kívül a diabétesz mellitusz okozta

anyagcsere változásokra leginkább érzékeny sejttípus, a dopaminerg amakrin sejtek is jelentős

mértékben károsodtak a (III) csoport állataiból származó retinamintákban, a TUNEL-pozitív

apoptotikus sejtek mennyisége pedig a hiperglikémia súlyosságával egyenesen arányosnak

bizonyult. A szinaptikus kapcsolatok elváltozásai, valamint az ILM rétegben található, gliális

sejtek közötti szoros összeköttetések („tight junction”) felnyílása azt eredményezheti, hogy a

retinális struktúrák könnyen hozzáférhetővé válnak bizonyos beáramló immunsejtek számára.

Az ideghártya sejtjeinek jelen kísérleteink során megfigyelt apoptózisa és degenerációja a retina

igen jelentős mértékű elvékonyodását idézte elő, mely gyakorlatilag a humán diabéteszes

folyamatok késői fázisának modelljeként tekinthető. Az ideghártya ilyetén mértékű atrófiája a

vérkeringés károsodásának, továbbbá a neuronok következményes pusztulásának

eredményeképpen jön létre, melyet emberben jellemzően egy kezdeti, retinális ödémával kísért

fázist követően figyelhetünk meg (Skarf, 2002; Takahashi és Chihara, 2008; Sugimoto és

mtsai., 2010).

A DNP kialakulása során humánban jellemzően megfigyelhető a podocita sejtek számának

csökkenése és a podocitalábak nyúlványainak összeolvadása, a glomeruláris bazálmembrán

megvastagodása, a mezangiális állomány expanziója, illetve a glomerulusok hipertrófiája és a

glomeruloszklerózis, valamint a tubuláris atrófia és a vesetubulusok glikogéntartalmának

fokozódása (Armanni-Ebstein-jelenség, Ritchie és Waugh, 1957). A hiperglikémiás állapot

fennállása következményeképpen károsító hatások egész sora jön létre, így például oxidatív

94

stressz, a fehérjék irreverzibilis glikációs módosulása, lipid peroxidáció és gyulladás, melyek

együttesen egy kaszkádot alkotva felelősek a DNP-ban megfigyelhető elváltozások

kialakulásáért (Dronavalli és mtsai., 2008; Zhou és mtsai., 2013). Vizsgálataink során a (III)

csoport állataiból származó vesemintákban jelentős mértékű glomeruláris PAS pozitivitást, a

mezangiális mátrix állományának megnövekedését, a glomerulusok bazálmembránjának

szegmentális megvastagodását, illetve a podocita lábnyúlványok összeolvadását figyelhettük

meg, in vivo pedig masszív poliuria jött létre. Az a jelenség, hogy az állatok vizelet

összfehérje/kreatinin aránya a vizsgálat első szakaszában megemelkedett, majd a késői fázisban

jelentős mértékben lecsökkent, egyértelmű összhangban van a humán diabéteszben kialakuló

nefropátia progressziójával. A proteinuria eme látszólagos javulása, amely megegyezik a

végstádiumú veseelégtelenségben (end-stage renal failure, ESRF) szenvedő diabéteszes

betegekkel szerzett tapasztalatokkal, megerősíti a glomerulusok súlyos károsodásának és

elzáródásának tényét.

A DN a humán diabéteszes betegek esetében leggyakrabban disztális szimmetrikus

polineuropátia formájában jelentkezik, amely gyakran okoz érzészavarokat, így például

hiperalgéziát és allodíniát (Brown és Asbury, 1984; Sun és mtsai., 2012). A DN kialakulásáért

felelős tényezők között vezető helyen a hiperglikémia áll, de rágcsálókban felmerült annak

lehetősége is, hogy az inzulin molekulák direkt szignalizációjának károsodása is hozzájárulhat

a tünetek kialakulásához (Sugimoto és mtsai, 2002; Brussee és mtsai., 2004). Ezen kívül

figyelembe kell vennünk az állatkísérletek során alkalmazott STZ-nak a szenzoros neuronokra

esetlegesen kifejtett közvetlen hatását is (Pabbidi és mtsai., 2008; Bishnoi és mtsai., 2001).

Mindezen tényezők ismeretében a diabéteszes állatok esetében megfigyelt neuropátiás tünetek

megjelenhetnek nemcsak hiperglikémia-függő, hanem inzulin-függő, illetve akár STZ-függő

módon is. Kísérleteink során a hátsó végtagon kialakult allodíniát és hiperalgéziát, valamint a

farok hideg allodíniáját figyeltük meg, melyek alapvetően a diabéteszes neuropátia

következményeinek tekinthetők. Ennek megfelelően a farkon észlelt hideg allodínia esetében

kimondható, hogy ez a jelenség teljes mértékben hiperglikémia-függő módon viselkedett,

hiszen míg az „enyhe diabéteszes” csoport esetében nem volt eltérés a Kontroll állatok

farokvisszahúzási latenciaidejéhez képest, addig a (III) csoport állatainál ezen paraméter

szignifikáns csökkenését tapasztaltuk. Következésképpen kijelenthető, hogy a patkányfarok

hideg allodíniájának mérése egy megbízható és releváns lehetőséget nyújt a krónikusan

fennálló, folyamatos vagy változó mértékű hiperglikémiás állapotokkal kísért diabéteszes

neuropátia vizsgálatára.

95

Hiperglikémia-függő paraméterek

Diabéteszes

szemelváltozások

Anterior szegmens neovaszkularizáció

Total retinal score (TRS)

A retina apoptotikus sejtjeinek száma

Diabéteszes nefropátia Glomeruláris PAS-pozitivitás

Vizelet totál protein/kreatinin arány

Diabéteszes neuropátia Hideg allodínia

5. táblázat: A diabétesz mellitusz krónikus szövődményeinek preklinikai vizsgálatára

alkalmas hiperglikémia-függő paraméterek.

Eredményeink alapján elmondható, hogy egy olyan kezelési stratégiát fejlesztettünk ki, amely

lehetővé teszi a diabéteszes komplikációk létrejöttének hosszú távú vizsgálatát patkányban.

Tekintettel arra, hogy a (III) diabéteszes csoport esetében az állatok tolerálható általános

állapota mellett hiperglikémia-függő elváltozások egész sorát figyelhettünk meg, ezért joggal

feltételezhető, hogy ez az általunk meghatározott kezelési séma megbízható modellként

szolgálhat a szem, a vese és a perifériás idegek diabéteszes elváltozásainak preklinikai

vizsgálatai során. Az általunk javasolt vizsgálati paraméterek közé tartozik a szem elülső

szegmensének fokozott neovaszkularizációja, az ideghártyát értékelő össz retina pontszám

(TRS) és a retina apoptotikus sejtjeinek száma, továbbá a veseglomerulusok PAS-

pozitivitásának fokozódása és a vizelet összfehérje/kreatinin arányának változása éppúgy, mint

a neuropátiás hideg allodínia (5. táblázat). Jelen tanulmányunk hiánypótló az irodalomban,

hiszen a fent említett többszervi elváltozások glikémia-függésének párhuzamos, ugyanakkor

hosszú távú vizsgálatát mutatja be. Mindezek alapján elmondhatjuk, hogy a kísérleteink során

szerzett tapasztalatok nagymértékben hozzájárulhatnak ahhoz, hogy a diabéteszes

komplikációk megelőzésére szolgáló gyógyszerek kifejlesztése során megbízható preklinikai

modellt alkalmazzanak.

96

ÚJ EREDMÉNYEK ÖSSZEFOGLALÁSA

1. Elsőként szolgáltattunk in vivo bizonyítékot, hogy a kapszaicin-érzékeny érzőideg-

végződések fontos mediátor szerepet játszanak a H2S-dal kiváltott vazodilatációban a

bőrben. Igazoltuk, hogy a H2S vazodilatátor hatása a szenzoros rostokon található TRPA1

receptor aktivációján keresztül jön létre, míg a TRPV1 receptor nem vesz részt ebben a

folyamatban. A kapszaicin-szenzitív szenzoros afferensek H2S általi stimulációjának

eredményeképpen vazoaktív szenzoros neuropeptidek, CGRP és SP szabadulnak fel, melyek

a CGRP és a tachykinin NK1 receptoraikon fejtik ki vazodilatátor hatásukat. Az érfali

simaizomsejteken található K+ATP-csatornák H2S általi aktivációja szintén hozzájárul az

egérfül mikrocirkulációjának fokozódásához, míg a pH és az ozmotikus hatások nem

befolyásolják ezt az érválaszt.

2. Elsőként bizonyítottuk, hogy a TRPA1 receptor komplex szabályozó hatásokat közvetít

a tüdő akut és krónikus gyulladásos folyamataiban. A TRPA1 fontos protektív szerepet

játszik az endotoxinnal kiváltott akut bronchiális hiperreaktivitás kialakulásában, valamint a

neutrofil granulociták és a mononukláris sejtek aktiválódásában a korábban leírt TRPV1

receptor szerepéhez hasonlóan. Az összesített szövettani gyulladásos változásokat a TRPA1

nem befolyásolja. Ezen kívül kimutattuk, hogy a dohányfüst expozícióval kiváltott krónikus

légúti gyulladás progressziója során a TRPA1 fontos és összetett szereppel bír a

granulociták, makrofágok és limfociták működésének szabályozásában, valamint az

alveoláris-intersticiális ödéma kialakulásában. A receptor aktivációja a légzésfunkcióra

nincs hatással.

3. Elsőként bizonyítottuk, hogy a tachykinin család legújabb tagja, a HK-1 gyulladáskeltő

hatásokat közvetít akut intersticiális pneumonitiszben. Kimutattuk, hogy a HK-1

fokozza a neutrofil granulociták és a makrofágok akkumulációját és aktivációját a tüdőben,

illetve elősegíti a proinflammatorikus citokinek termelődését. Eredményeink alapján

valószínűsíthető, hogy a HK-1 fontos szerepet játszik a limfocita funkciók szabályozásában

is, de ennek mechanizmusa egyelőre még nem tisztázott. A perifériás gyulladásos reakció

kialakulásában betöltött szerepével ellentétben a HK-1 a gyulladásos légúti válaszkészség

változásaira nincs hatással.

97

4. A diabétesz krónikus szövődményeinek prevenciójára alkalmas gyógyszerek

kifejlesztéséhez elengedhetetlenül szükséges e komplikációk hosszú távú, lehetőség szerint

párhuzamos vizsgálata. Kísérleteink során egy olyan preklinikai modellt fejlesztettünk

ki és karakterizáltunk, amely lehetővé teszi a krónikus diabéteszes szemelváltozások,

valamint a nefropátia és a neuropátia egyidejű értékelését. Eredményeink alapján az

anterior szegmens neovaszkularizációja, a retina állapotát komplexen értékelő TRS

paraméter, az ideghártyában megtalálható apoptotikus sejtek mennyisége, továbbá a

veseglomerulusok fokozott PAS-pozitivitása, a vizelet összfehérje/kreatinin arányának

változásai, illetve a hideg allodínia mértéke olyan hiperglikémia-függő paramétereknek

bizonyultak, amelyek összetett kvantitatív analízise esszenciális elemként szolgálhat a

diabéteszes komplikációk megelőzésére szolgáló gyógyszerek preklinikai fejlesztése során.

Széles körben ismert tény, hogy az ideg- és immunrendszer működése között szoros kapcsolat

áll fenn nem csak fiziológiás, de patológiás körülmények között egyaránt. A két rendszer között

létrejövő interakciók rendellenességei többek között keringési, légúti és metabolikus

megbetegedések kialakulásához is hozzájárulnak. Az ezekben a folyamatokban részt vevő

mediátorok és célmolekulák azonosítása, továbbá a megfelelő mechanizmus- és

betegségmodellek alkalmazása elengedhetetlen a terápiás potenciállal bíró vegyületek

preklinikai fejlesztéséhez. Eredményeink alapján megállapíthatjuk, hogy a kardiovaszkuláris

rendszerben és gyulladásos folyamatokban komplex szereppel bíró H2S molekula képes

interakcióba lépni a kapszaicin-érzékeny peptiderg afferensekkel, illetve az általuk expresszált

TRPA1 receptorral és szenzoros neuropeptidekkel (CGRP, P-anyag), mely tény komoly

jelentőséggel bír a gázmediátor fiziológiájának megértése és farmakoterápiai hasznosíthatósága

szempontjából. Kísérleteinkkel továbbá bizonyítást nyert, hogy a szenzoros idegvégződéseken

kívül különböző gyulladásos és immunsejteken is kifejeződő TRPA1 receptor, továbbá az

említett struktúrákból felszabaduló HK-1 fontos szerepet játszanak a légzőrendszer akut és

krónikus gyulladásos megbetegedéseiben, így a jövőben potenciális targetként szolgálhatnak új

típusú gyulladáscsökkentő szerek kifejlesztéséhez. Mivel a neuro-immun interakciók a

diabétesz krónikus szövődményeinek kialakulásában is részt vesznek, preklinikai szempontból

fontosnak tartjuk az e hatások komplex elemzését lehetővé tévő állatmodell alkalmazását. Az

általunk vizsgált folyamatok hatásmechanizmusának részletes feltérképezése nagymértékben

elősegítheti azoknak az új típusú gyógyszereknek a fejlesztését, amelyek támadáspontja az

ideg- és immunrendszer kölcsönhatásában rejlik.

98

IRODALMI HIVATKOZÁSOK

1. Abboud FM, Harwani SC, Chapleau MW. (2012) Autonomic neural regulation of the immune system:

implications for hypertension and cardiovascular disease. Hypertension. 59: 755-62.

2. Al-Magableh MR, Hart JL. (2011) Mechanism of vasorelaxation and role of endogenous hydrogen sulfide

production in mouse aorta. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 383: 403-413.

3. Anand P, Bley K. (2011) Topical capsaicin for pain management: therapeutic potential and mechanisms

of action of the new high-concentration capsaicin 8% patch. Br J Anaesth. 107: 490-502.

4. Andersson DA, Gentry C, Bevan S. (2012) TRPA1 has a key role in the somatic pro-nociceptive actions

of hydrogen sulfide. PLoS One. 7: e46917.

5. Andersson DA, Gentry C, Moss S, Bevan S. (2008) Transient receptor potential A1 is a sensory receptor

for multiple products of oxidative stress. J Neurosci. 28: 2485–2494.

6. Andrè E, Campi B, Materazzi S, Trevisani M, Amadesi S, Massi D, Creminon C, Vaksman N, Nassini

R, Civelli M, Baraldi PG, Poole DP, Bunnett NW, Geppetti P, Patacchini R. (2008) Cigarette smoke-

induced neurogenic inflammation is mediated by alpha, beta-unsaturated aldehydes and the TRPA1

receptor in rodents. J Clin Invest. 118: 2574-82.

7. Atoyan R, Shander D, Botchkareva NV. (2009) Non-neuronal expression of transient receptor potential

type A1 (TRPA1) in human skin. J Invest Dermatol. 129: 2312–5.

8. Aubdool AA, Brain SD. (2011) Neurovascular aspects of skin neurogenic inflammation. J Investig

Dermatol Symp Proc. 15: 33-9.

9. Aubdool AA, Graepel R, Kodji X, Alawi KM, Bodkin JV, Srivastava S, Gentry C, Heads R, Grant AD,

Fernandes ES, Bevan S, Brain SD. (2014) TRPA1 is essential for the vascular response to environmental

cold exposure. Nat Commun. 5: 5732.

10. Bandell M, Story GM, Hwang SW, Viswanath V, Eid SR, Petrus MJ, Earley TJ, Patapoutian A. (2004)

Noxious cold ion channel TRPA1 is activated by pungent compounds and bradykinin. Neuron. 41: 849-

57.

11. Bánki E, Degrell P, Kiss P, Kovács K, Kemény Á, Csanaky K, Duh A, Nagy D, Toth G, Tamas A, Reglodi

D. (2013). Effect of PACAP treatment on kidney morphology and cytokine expression in rat diabetic

nephropathy. Peptides. 42: 125-130.

12. Banner KH, Igney F, Poll C. (2011) TRP channels: emerging targets for respiratory disease. Pharmacol

Ther. 130: 371-84.

13. Bánvölgyi Á, Pozsgai G, Brain SD, Helyes Z, Szolcsányi J, Ghosh M, Melegh B, Pintér E. (2004) Mustard

oil induces a transient receptor potential vanilloid 1 receptor-independent neurogenic inflammation and

a non-neurogenic cellular inflammatory component in mice. Neuroscience. 125, 449-459.

14. Barnes PJ. (1990) Neurogenic inflammation in airways and its modulation. Arch Int Pharmacodyn Ther.

303: 67-82.

15. Barnes PJ. (2001) Potential novel therapies for chronic obstructive pulmonary disease. Novartis Found.

Symp. 234: 255-267.

16. Barwell J, Wootten D, Simms J, Hay DL, Poyner DR. (2012) RAMPs and CGRP receptors. Adv Exp Med

Biol. 744: 13–24.

99

17. Bautista DM, Movahed P, Hinman A, Axelsson HE, Sterner O, Högestätt ED, Julius D, Jordt SE, Zygmunt

PM. (2005) Pungent products from garlic activate the sensory ion channel TRPA1. Proc Natl Acad Sci U

S A. 102: 12248-52.

18. Bautista, D.M., Jordt, S.E., Nikai, T., Tsuruda, P.R., Read, A.J., Poblete, J., Yamoah, E.N., Basbaum,

A.I., Julius, D. (2006) TRPA1 mediates the inflammatory actions of environmental irritants and

proalgesic agents. Cell. 124, 1269-1282.

19. Bellucci F, Carini F, Catalani C, Cucchi P, Lecci A, Meini S, Patacchini R, Quartara L, Ricci R,

Tramontana M, Giuliani S, Maggi CA. (2002) Pharmacological profile of the novel mammalian

tachykinin, hemokinin 1. Br J Pharmacol. 135: 266–74

20. Bennett GJ. (1999) Does a neuroimmune interaction contribute to the genesis of painful peripheral

neuropathies? Proc Natl Acad Sci U S A. 96: 7737-8.

21. Berger A, Benveniste P, Corfe SA, Tran AH, Barbara M, Wakeham A, Mak TW, Iscove NN, Paige CJ.

(2010) Targeted deletion of the tachykinin 4 gene (TAC4−/−) influences the early stages of B lymphocyte

development. Blood. 116: 3792–801.

22. Berger A, Tran AH, Paige CJ. (2007) Co-regulated decrease of neurokinin-1 receptor and Hemokinin-1

gene expression in monocytes and macrophages after activation with pro-inflammatory cytokines. J

Neuroimmunol. 187: 83–93.

23. Bessac BF, Jordt SE. (2008) Breathtaking TRP channels: TRPA1 and TRPV1 in airway chemosensation

and reflex control. Physiology (Bethesda). 23: 360-70.

24. Bessac BF, Sivula M, von Hehn CA, Caceres AI, Escalera J, Jordt SE. (2009) Transient receptor potential

ankyrin 1 antagonists block the noxious effects of toxic industrial isocyanates and tear gases. FASEB. J.

23: 1102-1114.

25. Bhatia M. Hydrogen sulfide and substance P in inflammation. (2010) Antioxid Redox Signal. 12: 1191-

202.

26. Bhatia M, Zhi L, Zhang H, Ng SW, Moore PK. (2006) Role of substance P in hydrogen sulfide-induced

pulmonary inflammation in mice. Am. J. Physiol. Lung. Cell. Mol. Physiol. 291: L896-L904.

27. Bignami A, Dahl D. (1979) The radial glia of Müller in the rat retina and their response to injury. An

immunofluorescence study with antibodies to the glial fibrillary acidic (GFA) protein. Exp Eye Res. 28:

63-9.

28. Bishnoi M, Bosgraaf CA, Abooj M, Zhong L, Premkumar LS. (2011) Streptozotocin-induced early

thermal hyperalgesia is independent of glycemic state of rats: role of transient receptor potential vanilloid

1 (TRPV1) and inflammatory mediators. Mol Pain. 7: 52.

29. Bodkin JV, Brain SD. (2011) Transient receptor potential ankyrin 1: emerging pharmacology and

indications for cardiovascular biology. Acta Physiol. (Oxf.) 203, 87-98.

30. Borbély E, Hajna Z, Sándor K, Kereskai L, Tóth I, Pintér E, Nagy P, Szolcsányi J, Quinn J, Zimmer A,

Stewart J, Paige C, Berger A, Helyes Z. (2013) Role of tachykinin 1 and 4 gene-derived neuropeptides

and the neurokinin 1 receptor in adjuvant-induced chronic arthritis of the mouse. PLoS One 8: e61684.

31. Borbély É, Helyes Z. Role of hemokinin-1 in health and disease. Neuropeptides. 2016 Dec 13. pii: S0143-

4179(16)30156-1. doi: 10.1016/j.npep.2016.12.003. [Epub ahead of print]

100

32. Botz B, Bölcskei K, Kereskai L, Kovács M, Németh T, Szigeti K, Horváth I, Máthé D, Kovács N,

Hashimoto H, Reglődi D, Szolcsányi J, Pintér E, Mócsai A, Helyes Z. (2014) Differential regulatory role

of pituitary adenylate-cyclase activating polypeptide in the serum-transfer-induced arthritis model.

Arthritis Rheumatol. 66: 2739–50.

33. Bölcskei K, Helyes Z, Szabó A, Sándor K, Elekes K, Németh J, Almási R, Pintér E, Petho G, Szolcsányi

J. (2005) Investigation of the role of TRPV1 receptors in acute and chronic nociceptive processes using

gene-deficient mice. Pain. 117: 368-376.

34. Brain SD, Cox HM. (2006) Neuropeptides and their receptors: innovative science providing novel

therapeutic targets. Br J Pharmacol 147 (Suppl. 1): S202–11.

35. Brain SD, Williams TJ, Tippins JR, Morris HR, MacIntyre I. (1985) Calcitonin gene-related peptide is a

potent vasodilator. Nature. 313: 54-56.

36. Breyer MD, Böttinger E, Brosius FC 3rd, Coffman TM, Harris RC, Heilig CW, Sharma K; AMDCC..

(2005) Mouse models of diabetic nephropathy. J Am Soc Nephrol. 16: 27-45.

37. Brierley SM, Castro J, Harrington AM, Hughes PA, Page AJ, Rychkov GY, Blackshaw LA. (2011)

TRPA1 contributes to specific mechanically activated currents and sensory neuron mechanical

hypersensitivity. J Physiol. 589: 3575-93.

38. Brown MJ, Asbury AK. (1984) Diabetic neuropathy. Ann Neurol. 15: 2-12.

39. Brussee V, Cunningham FA, Zochodne DW. (2004) Direct insulin signaling of neurons reverses diabetic

neuropathy. Diabetes, 53: 1824-1830.

40. Calcutt NA. (2004) Experimental models of painful diabetic neuropathy. J Neurol Sci. 220: 137-139.

41. Calvert JW, Coetzee WA, Lefer DJ. (2010) Novel insights into hydrogen sulfide-mediated cytoprotection.

Antioxid Redox Signal. 12: 1203-17.

42. Candrilli, SD, Davis KL, Kan HJ, Lucero MA, Rousculp MD. (2007) Prevalence and the associated

burden of illness of symptoms of diabetic peripheral neuropathy and diabetic retinopathy. J Diabetes

Complications. 21: 306-314.

43. Cao T, Gerard NP, Brain SD. (1999) Use of NK(1) knockout mice to analyze substance P-induced edema

formation. Am J Physiol. 277(2 Pt 2): R476-81.

44. Cao T, Pintér E, Al-Rashed S, Gerard NP, Hoult R, Brain S. (2000) Neurokinin-1 receptor agonists are

involved in mediating neutrophil accumulation in the inflamed, but not normal, cutaneous

microvasculature: an in vivo study using neurokinin-1 receptor knockout mice. J. Immunol. 164: 5424-

5429.

45. Carrasco E, Hernández C, Miralles A, Huguet P, Farrés J, Simó R. (2007) Lower somatostatin expression

is an early event in diabetic retinopathy and is associated with retinal neurodegeneration. Diabetes Care.

30: 2902-8.

46. Caterina MJ, Schumacher MA, Tominaga M, Rosen TA, Levine JD, Julius D. (1997) The capsaicin

receptor: a heat-activated ion channel in the pain pathway. Nature. 389: 816-24.

47. Chang ML, Wu CH, Jiang-Shieh YF, Shieh JY, Wen CY. (2007). Reactive changes of retinal astrocytes

and Müller glial cells in kainate-induced neuroexcitotoxicity. J Anat. 210: 54-65.

101

48. Chao LK, Hua KF, Hsu HY, Cheng SS, Lin IF, Chen CJ, Chen ST, Chang ST. (2008) Cinnamaldehyde

inhibits pro-inflammatory cytokines secretion from monocytes/macrophages through suppression of

intracellular signaling. Food Chem Toxicol. 46: 220-31.

49. Chen H, Bai C, Wang X. (2010) The value of the lipopolysaccharide-induced acute lung injury model in

respiratory medicine. Expert Rev Respir Med. 4: 773–83.

50. Chen H, Brahmbhatt S, Gupta A, Sharma AC. (2005) Duration of streptozotocin-induced diabetes

differentially affects p38-mitogen-activated protein kinase (MAPK) phosphorylation in renal and

vascular dysfunction. Cardiovascular Diabetology. 4: 3.

51. Chen J, Hackos DH. (2015) TRPA1 as a drug target—promise and challenges. Naunyn Schmiedebergs

Arch Pharmacol. 388: 451–463.

52. Chen J, Mcgaraughty S, Kym PR. (2012) TRPA1 in drug discovery. In: Szallasi A, Bíró T, editors. TRP

channels in drug discovery. Methods in pharmacology and toxicology, vol. 1., pp. 43-59. ISBN: 978-1-

62703-077-9 (online)

53. Chen YH, Wang PP, Wang XM, He YJ, Yao WZ, Qi YF, Tang CS. (2011) Involvement of endogenous

hydrogen sulfide in cigarette smoke-induced changes in airway responsiveness and inflammation of rat

lung. Cytokine. 53: 334-41.

54. Cheng Y, Ndisang JF, Tang G, Cao K, Wang R. (2004) Hydrogen sulfide-induced relaxation of resistance

mesenteric artery beds of rats. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287: H2316-23.

55. Colsoul B, Nilius B, Vennekens R. (2013) Transient receptor potential (TRP) cation channels in diabetes.

Curr Top Med Chem. 13: 258-69.

56. Cordero-Morales JF, Gracheva EO, Julius D. (2011) Cytoplasmic ankyrin repeats of transient receptor

potential A1 (TRPA1) dictate sensitivity to thermal and chemical stimuli. Proc Natl Acad Sci U S A. 108:

E1184-91.

57. Corey DP. (2003) New TRP channels in hearing and mechanosensation. Neuron. 39: 585-8.

58. Coudoré-Civiale M, Courteix C, Boucher M, Fialip J, Eschalier A. (2000) Evidence for an involvement

of tachykinins in allodynia in streptozocin-induced diabetic rats. Eur J Pharmacol. 401: 47-53.

59. Cunin P, Caillon A, Corvaisier M, Garo E, Scotet M, Blanchard S, Delneste Y, Jeannin P. (2011) The

tachykinins substance P and hemokinin-1 favor the generation of human memory Th17 cells by inducing

IL-1, IL-23, and TNF-like 1A expression by monocytes. J Immunol. 186: 4175–82.

60. Cvetkov TL, Huynh KW, Cohen MR, and Moiseenkova-Bell VY. (2011) Molecular Architecture and

Subunit Organization of TRPA1 Ion Channel Revealed by Electron Microscopy. J Biol Chem. 286:

38168–38176.

61. De Felipe C, Herrero JF, O'Brien JA, Palmer JA, Doyle CA, Smith AJ, Laird JM, Belmonte C, Cervero

F, Hunt SP. (1998) Altered nociception, analgesia and aggression in mice lacking the receptor for

substance P. Nature. 392: 394-7.

62. del Camino D, Murphy S, Heiry M, Barrett LB, Earley TJ, Cook CA, Petrus MJ, Zhao M, D'Amours M,

Deering N, Brenner GJ, Costigan M, Hayward NJ, Chong JA, Fanger CM, Woolf CJ, Patapoutian A,

Moran MM. (2010) TRPA1 contributes to cold hypersensitivity. J Neurosci. 30: 15165-74.

63. De Swert KO, Joos GF. (2006) Extending the understanding of sensory neuropeptides. Eur. J. Pharmacol.

533: 171-181.

102

64. Deshmane SL, Kremlev S, Amini S, Sawaya BE. (2009) Monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1):

an overview. J Interferon Cytokine Res 29: 313–26.

65. Deshpande AD, Harris-Hayes M, Schootman M. (2008) Epidemiology of diabetes and diabetes-related

complications. Physical Therapy. 88: 1254-1264.

66. Devos FC, Boonen B, Alpizar YA, Maes T, Hox V, Seys S, Pollaris L, Liston A, Nemery B, Talavera K,

Hoet PH, Vanoirbeek JA. (2016) Neuro-immune interactions in chemical-induced airway hyperreactivity.

Eur Respir J. 48: 380-92.

67. Dronavalli S, Duka I, Bakris GL. (2008) The pathogenesis of diabetic nephropathy. Nat Clin Pract

Endocrinol Metab. 4: 444–452.

68. Duffy RA, Hedrick JA, Randolph G, Morgan CA, Cohen-Williams ME, Vassileva G, Lachowicz JE,

Laverty M, Maguire M, Shan LS, Gustafson E, Varty GB. (2003) Centrally administered hemokinin-1

(HK-1), a neurokinin NK1 receptor agonist, produces substance P-like behavioral effects in mice and

gerbils. Neuropharmacology. 45: 242–50.

69. Dux M, Will C, Vogler B, Filipovic MR, Messlinger K. (2016) Meningeal blood flow is controlled by

H2S-NO crosstalk activating a HNO-TRPA1-CGRP signalling pathway. Br J Pharmacol 173: 431-45.

70. Earley S, Gonzales AL, Crnich R. (2009) Endothelium-dependent cerebral artery dilation mediated by

TRPA1 and Ca2+-activated K+ channels. Circ. Res. 104: 987-994.

71. Earley S. (2012) TRPA1 channels in the vasculature. Br J Pharmacol. 167: 13-22.

72. Eberhardt M, Dux M, Namer B, Miljkovic J, Cordasic N, Will C, Kichko TI, de la Roche J, Fischer M,

Suárez SA, Bikiel D, Dorsch K, Leffler A, Babes A, Lampert A, Lennerz JK, Jacobi J, Martí MA,

Doctorovich F, Högestätt ED, Zygmunt PM, Ivanovic-Burmazovic I, Messlinger K, Reeh P, Filipovic

MR. (2014) H2S and NO cooperatively regulate vascular tone by activating a neuroendocrine HNO-

TRPA1-CGRP signalling pathway. Nat Commun. 5: 4381.

73. Elekes K, Helyes Z, Németh J, Sándor K, Pozsgai G, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szabó A, Szolcsányi

J. (2007) Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory neuropeptides in endotoxin-induced airway

inflammation and consequent bronchial hyperreactivity in the mouse. Regul Pept. 141: 44-54.

74. Endo D, Ikeda T, Ishida Y, Yoshioka D, Nishimori T. (2006) Effect of intrathecal admin- istration of

hemokinin-1 on the withdrawal response to noxious thermal stimulation of the rat hind paw. Neurosci

Lett. 392: 114–7.

75. Engerman RL, Kern TS. (1995). Retinopathy in animal models of diabetes. Diabetes Metab Rev. 11: 109-

120.

76. Fahey 3rd TJ, Tracey KJ, Tekamp-Olson P, Cousens LS, Jones WG, Shires GT, Cerami A, Sherry B.

(1992) Macrophage inflammatory protein 1 modulates macrophage function. J Immunol. 148: 2764–9.

77. Fernandes ES, Fernandes MA, Keeble JE. (2012) The functions of TRPA1 and TRPV1: moving away

from sensory nerves. Br J Pharmacol. 166: 510-21.

78. Fernandes VS, Ribeiro AS, Barahona MV, Orensanz LM, Martínez-Sáenz A, Recio P, Martínez AC,

Bustamante S, Carballido J, García-Sacristán A, Prieto D, Hernández M. (2013) Hydrogen sulfide

mediated inhibitory neurotransmission to the pig bladder neck: role of K+ATP channels, sensory nerves

and calcium signalling. J Urol. 190: 746-56.

103

79. Fox A, Eastwood C, Gentry C, Manning D, Urban L. (1999) Critical evaluation of the streptozotocin

model of painful diabetic neuropathy in the rat. Pain. 81: 307-316.

80. Freeman WM, Bixler GV, Brucklacher RM, Walsh E, Kimball SR, Jefferson LS, Bronson SK. (2009).

Transcriptomic comparison of the retina in two mouse models of diabetes. J Ocul Biol Dis Infor. 2: 202-

213.

81. Fujita F, Uchida K, Moriyama T, Shima A, Shibasaki K, Inada H, Sokabe T, Tominaga M. (2008)

Intracellular alkalization causes pain sensation through activation of TRPA1 in mice. J. Clin. Invest. 118:

4049-4057.

82. García-Añoveros J, Nagata K. (2007) TRPA1. Handb Exp Pharmacol. 179: 347-62.

83. Gaudet R. (2008) A primer on ankyrin repeat function in TRP channels and beyond. Mol Biosyst. 4: 372–

379.

84. Gentry C, Stoakley N, Andersson DA, Bevan S. (2010) The roles of iPLA2, TRPM8 and TRPA1 in

chemically induced cold hypersensitivity. Mol Pain. 6: 4.

85. Geppetti P, Patacchini R, Nassini R, Materazzi S. (2010) Cough: The Emerging Role of the TRPA1

Channel. Lung. 188 Suppl 1: S63-8.

86. Grace MS, Baxter M, Dubuis E, Birrell MA, Belvisi MG. (2014) Transient receptor potential (TRP)

channels in the airway: role in airway disease. Br J Pharmacol. 171: 2593-607.

87. Graepel R, Fernandes ES, Aubdool AA, Andersson DA, Bevan S, Brain SD. (2011) 4-oxo-2-nonenal (4-

ONE): evidence of transient receptor potential ankyrin 1-dependent and -independent nociceptive and

vasoactive responses in vivo. J. Pharmacol. Exp. Ther. 337: 117-124.

88. Graham GJ, Stevens JM, Page NM, Grant AD, Brain SD, Lowry PJ, Gibbins JM. (2004) Tachykinins

regulate the function of platelets. Blood. 104: 1058–65.

89. Grant A. (2002) Leukocytes and neurogenic inflammation. Inflammopharmacology 9: 403-420.

90. Grant AD, Pinter E, Salmon AM, Brain SD. (2005) An examination of neurogenic mechanisms involved

in mustard oil-induced inflammation in the mouse. Eur J Pharmacol. 507: 273-80.

91. Grassin-Delyle S, Buenestado A, Vallat L, Naline E, Marx S, Decocq J, Debré P, Bernard OA, Advenier

C, Devillier P, Merle-Béral H. (2011) Expression and proliferative effect of hemokinin-1 in human B-

cells. Peptides. 32: 1027–34.

92. Grassin-Delyle S, Naline E, Buenestado A, Risse PA, Sage E, Advenier C, Devillier P. (2010) Expression

and function of human hemokinin-1 in human and guinea pig airways. Respir Res. 11: 139.

93. Gray DW, Marshall I. (1992) Human alpha-calcitonin gene-related peptide stimulates adenylate cyclase

and guanylate cyclase and relaxes rat thoracic aorta by releasing nitric oxide. Br J Pharmacol. 107: 691–

696.

94. Greiner R, Pálinkás Z, Bäsell K, Becher D, Antelmann H, Nagy P, Dick TP. (2013) Polysulfides link H2S

to protein thiol oxidation. Antioxid Redox Signal. 19: 1749-65.

95. Gross JL, de Azevedo MJ, Silveiro SP, Canani LH, Caramori ML, Zelmanovitz T. (2005) Diabetic

nephropathy: diagnosis, prevention, and treatment. Diabetes Care. 28: 164-176.

96. Gunthorpe MJ, Benham CD, Randall A, Davis JB. (2002) The diversity in the vanilloid (TRPV) receptor

family of ion channels. Trends Pharmacol Sci. 23: 183-191.

104

97. Guo W, Cheng ZY, Zhu YZ. (2013) Hydrogen sulfide and translational medicine. Acta Pharmacol. Sin.

34: 1284-1291.

98. Haas M. (1997) Urine collection in the freely moving rat: reliability for measurement of short-term renal

effects. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods, 38, 47-51.

99. Haddad EB, Birrell M, McCluskie K, Ling A, Webber SE, Foster ML, Belvisi MG. (2001) Role of p38

MAP kinase in LPS-induced airway inflammation in the rat. Br J Pharmacol. 132: 1715-24.

100. Hatakeyama Y, Takahashi K, Tominaga M, Kimura H, Ohta T. (2015) Polysulfide evokes acute pain

through the activation of nociceptive TRPA1 in mouse sensory neurons. Mol Pain. 11: 24.

101. Havel PJ, Hahn TM, Sindelar DK, Baskin DG, Dallman MF, Weigle DS, Schwartz MW. (2000). Effects

of streptozotocin-induced diabetes and insulin treatment on the hypothalamic melanocortin system and

muscle uncoupling protein 3 expression in rats. Diabetes. 49: 244-252.

102. Hay DL, Poyner DR, Smith DM. (2003) Desensitisation of adrenomedullin and CGRP receptors. Regul

Pept. 112: 139 –145.

103. Helyes Z, Elekes K, Németh J, Pozsgai G, Sándor K, Kereskai L, Börzsei R, Pintér E, Szabó A, Szolcsányi

J. (2007) Role of transient receptor potential vanilloid 1 receptors in endotoxin-induced airway

inflammation in the mouse. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292: L1173-81.

104. Helyes Z, Elekes K, Sándor K, Szitter I, Kereskai L, Pintér E, Kemény A, Szolcsányi J, McLaughlin L,

Vasiliou S, Kipar A, Zimmer A, Hunt SP, Stewart JP, Quinn JP. (2010) Involvement of preprotachykinin

A gene-encoded peptides and the neurokinin 1 receptor in endotoxin-induced murine airway

inflammation. Neuropeptides. 44: 399–406.

105. Helyes Z, Hajna Z. (2012) Endotoxin-induced airway inflammation and asthma models. In: Szallasi A,

Bíró T, editors. TRP channels in drug discovery. Methods in pharmacology and toxicology, vol. 1., pp.

301–42. ISBN 978-1-62703-077-9 (online)

106. Helyes Z, Pintér E, Sándor K, Elekes K, Bánvölgyi A, Keszthelyi D, Szoke E, Tóth DM, Sándor Z,

Kereskai L, Pozsgai G, Allen JP, Emson PC, Markovics A, Szolcsányi J. (2009) Impaired defense

mechanism against inflammation, hyperalgesia, and airway hyperreactivity in somatostatin 4 receptor

gene-deleted mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 13088–93.

107. Helyes Z, Szabó A, Németh J, Jakab B, Pintér E, Bánvölgyi A, Kereskai L, Kéri G, Szolcsányi J. (2004)

Antiinflammatory and analgesic effects of somatostatin released from capsaicin-sensitive sensory nerve

terminals in a Freund's adjuvant-induced chronic arthritis model in the rat. Arthritis Rheum. 50: 1677-85.

108. Hinman A, Chuang HH, Bautista DM, Julius D. (2006) TRP channel activation by reversible covalent

modification. Proc Natl Acad Sci U S A. 103: 19564-8.

109. Hirsch S, Corradini L, Just S, Arndt K, Doods H. (2013) The CGRP receptor antagonist BIBN4096BS

peripherally alleviates inflammatory pain in rats. Pain. 154: 700-7.

110. Ho WZ, Lai JP, Zhu XH, Uvaydova M, Douglas SD. (1997) Human monocytes and macrophages express

substance P and neurokinin-1 receptor. J Immunol. 159: 5654-60.

111. Holzer P. (1988) Local effector functions of capsaicin-sensitive sensory nerve endings: involvement of

tachykinins, calcitonin gene-related peptide and other neuropeptides. Neuroscience. 24: 739-768.

112. Holzer P. (1991) Capsaicin: cellular targets, mechanisms of action, and selectivity for thin sensory

neurons. Pharmacol. Rev. 43: 143-201.

105

113. Ilatovskaya DV, Levchenko V, Lowing A, Shuyskiy LS, Palygin O, Staruschenko A. (2015) Podocyte

injury in diabetic nephropathy: implications of angiotensin II-dependent activation of TRPC channels.

Sci Rep. 5: 17637.

114. Islam MS. (2013) Animal models of diabetic neuropathy: progress since 1960s. Journal of Diabetes

Research. 2013: 149452.

115. Jancsó G, Kiraly E, Jancsó-Gábor A. (1977) Pharmacologically induced selective degeneration of

chemosensitive primary sensory neurones. Nature. 270: 741-743.

116. Jaquemar D, Schenker T, Trueb B. (1999) An ankyrin-like protein with transmembrane domains is

specifically lost after oncogenic transformation of human fibroblasts. J Biol Chem. 274: 7325-33.

117. Jha A, Sharma P, Anaparti V, Ryu MH, Halayko AJ. (2015) A role for transient receptor potential ankyrin

1 cation channel (TRPA1) in airway hyper-responsiveness? Can J Physiol Pharmacol. 93: 171-6.

118. Jiang Y, Liang X, Li X, Tao Y, Wang K. (2009) Analysis of the clinical efficacy of intravitreal

bevacizumab in the treatment of iris neovascularization caused by proliferative diabetic retinopathy. Acta

Ophthalmologica 87: 736-40.

119. Jo DH, Cho CS, Kim JH, Jun HO, Kim JH. (2013). Animal models of diabetic retinopathy: doors to

investigate pathogenesis and potential therapeutics. J Biomed Sci. 20: 38.

120. Jordt SE, Bautista DM, Chuang HH, McKemy DD, Zygmunt PM, Högestätt ED, Meng ID, Julius D.

(2004) Mustard oils and cannabinoids excite sensory nerve fibres through the TRP channel ANKTM1.

Nature. 427: 260-265.

121. Julius D. (2013) TRP channels and pain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29: 355-84.

122. Kamei J, Zushida K, Morita K, Sasaki M, Tanaka S. (2001) Role of vanilloid VR1 receptor in thermal

allodynia and hyperalgesia in diabetic mice. Eur J Pharmacol. 422: 83-6.

123. Karashima Y, Talavera K, Everaerts W, Janssens A, Kwan KY, Vennekens R, Nilius B, Voets T. (2009)

TRPA1 acts as a cold sensor in vitro and in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 106: 1273-8.

124. Kemény Á, Csekő K, Szitter I, Varga ZV, Bencsik P, Kiss K, Halmosi R, Deres L, Erős K, Perkecz A,

Kereskai L, Kiss T, Ferdinándy P, Helyes Z. Chronic cigarette smoke-induced pulmonary and cardiac co-

morbidities in a COPD mouse model. (közlésre beküldve)

125. Kern TS, Barber AJ. (2008) Retinal ganglion cells in diabetes. J Physiol. 586: 4401-4408.

126. Khan GM, Chen SR, Pan HL. (2002) Role of primary afferent nerves in allodynia caused by diabetic

neuropathy in rats. Neuroscience. 114: 291-9.

127. Kielland A, Blom T, Nandakumar KS, Holmdahl R, Blomhoff R, Carlsen H. (2009) In vivo imaging of

reactive oxygen and nitrogen species in inflammation using the luminescent probe L-012. Free Radic Biol

Med. 47: 760–6.

128. Kilkenny C, Browne WJ, Cuthill IC, Emerson M, Altman DG. (2010) Improving bioscience research

reporting: the ARRIVE guidelines for reporting animal research. PLoS Biol. 8: e1000412.

129. Kimura H. (2014) The physiological role of hydrogen sulfide and beyond. Nitric Oxide. 41: 4-10.

130. Kimura Y, Mikami Y, Osumi K, Tsugane M, Oka J, Kimura H. (2013) Polysulfides are possible H2S-

derived signaling molecules in rat brain. FASEB J. 27: 2451-7.

131. Kimura H. (2011) Hydrogen sulfide: its production, release and functions. Amino Acids. 41, 113-121.

106

132. Kips JC, Anderson GP, Fredberg JJ, Herz U, Inman MD, Jordana M, Kemeny DM, Lötvall J, Pauwels

RA, Plopper CG, Schmidt D, Sterk PJ, Van Oosterhout AJ, Vargaftig BB, Chung KF. (2003) Murine

models of asthma. Eur Respir J. 22: 374–82.

133. Kiss L, Deitch EA, Szabó C. (2008) Hydrogen sulfide decreases adenosine triphosphate levels in aortic

rings and leads to vasorelaxation via metabolic inhibition. Life Sci. 83:589-594.

134. Klaassen I, Van Noorden CJ, Schlingemann, RO. (2013) Molecular basis of the inner blood-retinal barrier

and its breakdown in diabetic macular edema and other pathological conditions. Prog Retin Eye Res. 34:

19-48.

135. Klassert TE, Sánchez JJ, Almeida TA, Candenas L, Pinto F, Acosta O, Hernández M. (2010) Common

variants of the neuropeptide expressing tachykinin genes and susceptibility to asthma: a case–control

study. J Neuroimmunol. 227: 202–7.

136. Knowlton WM, Bifolck-Fisher A, Bautista DM, McKemy DD. (2010) TRPM8, but not TRPA1, is

required for neural and behavioral responses to acute noxious cold temperatures and cold-mimetics in

vivo. Pain. 150: 340-50.

137. Kobayashi K, Fukuoka T, Obata K, Yamanaka H, Dai Y, Tokunaga A, Noguchi K. (2005) Distinct

expression of TRPM8, TRPA1, and TRPV1 mRNAs in rat primary afferent neurons with adelta/c-fibers

and colocalization with trk receptors. J Comp Neurol. 493: 596-606.

138. Koh WS, Yoon SY, Kwon BM, Jeong TC, Nam KS, Han MY (1998) Cinnamaldehyde inhibits

lymphocyte proliferation and modulates T-cell differentiation. Int J Immunopharmacol. 20: 643–660.

139. Koivisto A, Hukkanen M, Saarnilehto M, Chapman H, Kuokkanen K, Wei H, Viisanen H, Akerman KE,

Lindstedt K, Pertovaara A. (2012) Inhibiting TRPA1 ion channel reduces loss of cutaneous nerve fiber

function in diabetic animals: sustained activation of the TRPA1 channel contributes to the pathogenesis

of peripheral diabetic neuropathy. Pharmacol Res. 65: 149-58.

140. Kong LL, Wu H, Cui WP, Zhou WH, Luo P, Sun J, Yuan H, Miao LN. (2013). Advances in murine

models of diabetic nephropathy. Journal of Diabetes Research. 2013: 797548.

141. Kotani H, Hoshimaru M, Nawa H, Nakanishi S. (1986) Structure and gene organization of bovine

neuromedin K precursor. Proc Natl Acad Sci U S A. 83: 7074-7078.

142. Krassas GE, Tzotzas T, Papazisis K, Pazaitou-Panayiotou K, Boboridis K. (2007) The efficacy of

somatostatin analogues in the treatment of diabetic retinopathy and thyroid eye disease. Clin Ophthalmol.

1: 209-15.

143. Kun J, Perkecz A, Knie L, Sétáló G Jr, Tornóczki T, Pintér E, Bán Á. (2017) TRPA1 receptor is

upregulated in human oral lichen planus. Oral Dis. 23: 189-198.

144. Kunkler PE, Ballard CJ, Oxford GS, Hurley JH. (2011) TRPA1 receptors mediate environmental irritant-

induced meningeal vasodilatation. Pain. 152: 38-44.

145. Kurtz MM, Wang R, Clements MK, Cascieri MA, Austin CP, Cunningham BR, Chicchi GG, Liu Q.

(2002) Identification, localization and receptor characterization of novel mammalian substance P-like

peptides. Gene. 296: 205–12.

146. Kwan KY, Allchorne AJ, Vollrath MA, Christensen AP, Zhang DS, Woolf CJ, Corey DP. (2006) TRPA1

contributes to cold, mechanical, and chemical nociception but is not essential for hair-cell transduction.

Neuron. 50: 277-89.

107

147. Lai JP, Douglas SD, Ho WZ. (1998) Human lymphocytes express substance P and its receptor. J

Neuroimmunol. 86: 80-6.

148. Laird JM, Olivar T, Roza C, De Felipe C, Hunt SP, Cervero F. (2000) Deficits in visceral pain and

hyperalgesia of mice with a disruption of the tachykinin NK1 receptor gene. Neuroscience. 98: 345-52.

149. Latremoliere A, Woolf CJ. (2009) Central sensitization: a generator of pain hypersensitivity by central

neural plasticity. J Pain. 10: 895-926.

150. Lau AH, Chow SS, Ng YS. (2001) Immunologically induced histamine release from rat peritoneal mast

cells is enhanced by low levels of substance P. Eur J Pharmacol. 414: 295-303.

151. Lee LY, Hsu CC, Lin YJ, Lin RL, Khosravi M. (2015) Interaction between TRPA1 and TRPV1: Synergy

on pulmonary sensory nerves. Pulm Pharmacol Ther. 35: 87-93.

152. Lefort J, Motreff L, Vargaftig BB. (2001) Airway administration of Escherichia coli endotoxin to mice

induces glucocorticosteroid-resistant bronchoconstriction and vasopermeation. Am. J. Respir. Cell Mol.

Biol. 24: 345–351.

153. Li L, Rose P, Moore PK. (2011) Hydrogen sulfide and cell signaling. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol.

51: 169-187.

154. Liang GH, Adebiyi A, Leo MD, McNally EM, Leffler CW, Jaggar JH. (2011) Hydrogen sulfide dilates

cerebral arterioles by activating smooth muscle cell plasma membrane KATP channels. Am. J. Physiol.

Heart Circ. Physiol. 300: H2088-H2095.

155. Liu JY, Hu JH, Zhu QG, Li FQ, Sun HJ. (2006) Substance P receptor expression in human skin

keratinocytes and fibroblasts. Br J Dermatol. 155: 657– 662.

156. Liu X, Mameza MG, Lee YS, Eseonu CI, Yu CR, Kang Derwent JJ, Egwuagu CE. (2008) Suppressors

of cytokine-signaling proteins induce insulin resistance in the retina and promote survival of retinal cells.

Diabetes. 57: 1651-1658.

157. Liu YH, Lu M, Hu LF, Wong PT, Webb GD, Bian JS. (2012) Hydrogen sulfide in the mammalian

cardiovascular system. Antioxid Redox Signal 17: 141-85.

158. Lundberg JM. (1995) Tachykinins, sensory nerves, and asthma-an overview. Can. J. Physiol. Pharmacol.

73: 908-914.

159. Lundberg JM. (1996) Pharmacology of cotransmission in the autonomic nervous system: integrative

aspects on amines, neuropeptides, adenosine triphosphate, amino acids and nitric oxide. Pharmacol Rev.

48: 113-178.

160. Ma W, Cui W, Lin Q. (2001) Improved immnunophenotyping of lymphocytes in bronchoalveolar lavage

fluid (BALF) by flow cytometry. Clin Chim Acta. 313: 133-8.

161. Macpherson LJ, Geierstanger BH, Viswanath V, Bandell M, Eid SR, Hwang S, Patapoutian A. (2005) The

pungency of garlic: activation of TRPA1 and TRPV1 in response to allicin. Curr Biol. 15: 929-34.

162. Macpherson LJ, Hwang SW, Miyamoto T, Dubin AE, Patapoutian A, Story GM. (2006) More than cool:

promiscuous relationships of menthol and other sensory compounds. Mol Cell Neurosci. 32: 335-43.

163. Macpherson LJ, Dubin AE, Evans MJ, Marr F, Schultz PG, Cravatt BF, Patapoutian A. (2007) Noxious

compounds activate TRPA1 ion channels through covalent modification of cysteines. Nature. 445: 541-

5.

108

164. Maggi CA, Giuliani S, Santicioli P, Brading AF. (1996) Role of intracellular Ca2+ in the K channel opener

action of CGRP in the guinea-pig ureter. Br J Pharmacol 118: 1493-503.

165. Maggi CA, Meli A. (1988) The sensory-efferent function of capsaicin-sensitive sensory neurons. Gen

Pharmacol. 19: 1-43.

166. Maggi CA. (1995) Tachykinins and calcitonin gene-related peptide (CGRP) as cotransmitters released

from peripheral endings of sensory nerves. Prog Neurobiol. 45: 1–98.

167. Malcangio M, Tomlinson DR. (1998) A pharmacologic analysis of mechanical hyperalgesia in

streptozotocin/diabetic rats. Pain. 76: 151-157.

168. Marasco WA, Phan SH, Krutzsch H, Showell HJ, Feltner DE, Nairn R, Becker EL, Ward PA. (1984)

Purification and identification of formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine as the major peptide neutrophil

chemotactic factor produced by Escherichia coli. J Biol Chem. 259: 5430–9.

169. Martin TR. (2000) Recognition of bacterial endotoxin in the lungs. Am J Respir Cell Mol Biol. 23: 128–

32.

170. McGrath JC, Drummond GB, McLachlan EM, Kilkenny C, Wainwright CL. (2010) Guidelines for

reporting experiments involving animals: the ARRIVE guidelines. Br J Pharmacol. 160: 1573-6.

171. McLean S, Ganong A, Seymour PA, Snider RM, Desai MC, Rosen T, Bryce DK, Longo KP, Reynolds

LS, Robinson G, Schmidt AW, Siok C, Heym J. (1993) Pharmacology of CP-99,994; a nonpeptide

antagonist of the tachykinin neurokinin-1 receptor. J Pharmacol Exp Ther. 267: 472-9.

172. Mendes SJ, Sousa FI, Pereira DM, Ferro TA, Pereira IC, Silva BL, Pinheiro AJ, Mouchrek AQ, Monteiro-

Neto V, Costa SK, Nascimento JL, Grisotto MA, da Costa R, Fernandes ES. (2016) Cinnamaldehyde

modulates LPS-induced systemic inflammatory response syndrome through TRPA1-dependent and

independent mechanisms. Int Immunopharmacol. 34: 60-70.

173. Menten P, Wuyts A, Van Damme J. (2002) Macrophage inflammatory protein-1. Cytokine Growth Factor

Rev. 13: 455–81.

174. Meseguer V, Alpizar YA, Luis E, Tajada S, Denlinger B, Fajardo O, Manenschijn JA, Fernández-Peña

C, Talavera A, Kichko T, Navia B, Sánchez A, Señarís R, Reeh P, Pérez-García MT, López-López JR,

Voets T, Belmonte C, Talavera K, Viana F. (2014) TRPA1 channels mediate acute neurogenic

inflammation and pain produced by bacterial endotoxins. Nat Commun. 5: 3125.

175. Metwali A, Blum AM, Elliott DE, Setiawan T, Weinstock JV. (2004) Cutting edge: hemokinin has

substance P-like function and expression in inflammation. J Immunol. 172: 6528–32.

176. Michel O. (2000) Systemic and local airways inflammatory response to endotoxin. Toxicology. 152: 25–

30.

177. Milner P, Bodin P, Guiducci S, Del Rosso A, Kahaleh MB, Matucci-Cerinic M, Burnstock G. (2004)

Regulation of substance P mRNA expression in human dermal microvascular endothelial cells. Clin Exp

Rheumatol. 22 (Suppl 33): S24–27.

178. Miyamoto R, Otsuguro K, Ito S. (2011) Time- and concentration-dependent activation of TRPA1 by

hydrogen sulfide in rat DRG neurons. Neurosci. Lett. 499: 137-142.

179. Mizushima T, Obata K, Katsura H, Yamanaka H, Kobayashi K, Dai Y, Fukuoka T, Tokunaga A,

Mashimo T, Noguchi K. (2006) Noxious cold stimulation induces mitogen-activated protein kinase

109

activation in transient receptor potential (TRP) channels TRPA1- and TRPM8-containing small sensory

neurons. Neuroscience. 140: 1337-48.

180. Moriyama T, Higashi T, Togashi K, Iida T, Segi E, Sugimoto Y, Tominaga T, Narumiya S, Tominaga M.

(2005). Sensitization of TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of

prostaglandins. Mol. Pain. 1: 3.

181. Mustafa AK, Gadalla MM, Sen N, Kim S, Mu W, Gazi SK, Barrow RK, Yang G, Wang R, Snyder SH.

(2009) H2S signals through protein S-sulfhydration. Sci. Signal. 2: ra72.

182. Nassenstein C, Kwong K, Taylor-Clark T, Kollarik M, Macglashan DM, Braun A, Undem BJ. (2008)

Expression and function of the ion channel TRPA1 in vagal afferent nerves innervating mouse lungs. J

Physiol. 586: 1595-604.

183. Nassini R, Materazzi S, De Siena G, De Cesaris F, Geppetti P. (2010) Transient receptor potential

channels as novel drug targets in respiratory diseases. Curr Opin Investig Drugs. 11: 535-42.

184. Nassini R, Pedretti P, Moretto N, Fusi C, Carnini C, Facchinetti F, Viscomi AR, Pisano AR, Stokesberry

S, Brunmark C, Svitacheva N, McGarvey L, Patacchini R, Damholt AB, Geppetti P, Materazzi S. (2012)

Transient receptor potential ankyrin 1 channel localized to non-neuronal airway cells promotes non-

neurogenic inflammation. PLoS ONE. 7: e42454.

185. Nawa H, Hirose T, Takashima H, Inayama S, Nakanishi S. (1983) Nucleotide sequenses of cloned cDNAs

for two types of bovine brain substance P precursor. Nature. 306: 32-36.

186. Nelson MT, Huang Y, Brayden JE, Hescheler J, Standen NB. (1990) Arterial dilations in response to

calcitonin gene-related peptide involve activation of K+ channels. Nature. 344: 770–773.

187. Németh J, Reglődi D, Pozsgai G, Szabó Á, Elekes K, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z. (2006) Effect of

pituitary adenylate cyclase activating polypeptide-38 on sensory neuropeptide release and neurogenic

inflammation in rats and mice. Neuroscience. 143: 223–230.

188. Nichols BA, Bainton DF. (1973) Differentiation of human monocytes in bone mar- row and blood.

Sequential formation of two granule populations. Lab Invest. 29: 27–40.

189. Nie Y, Huang C, Zhong S, Wortley MA, Luo Y, Luo W, Xie Y, Lai K, Zhong N. (2016) Cigarette smoke

extract (CSE) induces transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) expression via activation of

HIF1αin A549 cells. Free Radic Biol Med. 99: 498-507.

190. Nilius B, Szallasi A. (2014) Transient receptor potential channels as drug targets: from the science of

basic research to the art of medicine. Pharmacol Rev. 66: 676-814.

191. Nishimura C, Kuriyama K. (1985) Alterations in the retinal dopaminergic neuronal system in rats with

streptozotocin-induced diabetes. J Neurochem. 45: 448-455.

192. Nishinaka Y, Aramaki Y, Yoshida H, Masuya H, Sugawara T, Ichimori Y. (1993) A new sensitive

chemiluminescence probe, L-012, for measuring the production of superoxide anion by cells. Biochem

Biophys Res Commun. 193: 554–9.

193. Obata K, Katsura H, Mizushima T, Yamanaka H, Kobayashi K, Dai Y, Fukuoka T, Tokunaga A, Tominaga

M, Noguchi K. (2005) TRPA1 induced in sensory neurons contributes to cold hyperalgesia after

inflammation and nerve injury. J Clin Invest. 115: 2393-401.

194. Obrosova IG, Drel VR, Kumagai AK, Szabo C, Pacher P, Stevens MJ. (2006) Early diabetes-induced

biochemical changes in the retina: comparison of rat and mouse models. Diabetologia. 49: 2525-2533.

110

195. Osborne NN, Casson RJ, Wood JP, Chidlow G, Graham M, Melena J. (2004) Retinal ischemia:

mechanisms of damage and potential therapeutic strategies. Prog Retin Eye Res. 23: 91-147.

196. Otmishi P, Gordon J, El-Oshar S, Li H, Guardiola J, Saad M, Proctor M, Yu J. (2008) Neuroimmune

interaction in inflammatory diseases. Clin Med Circ Respirat Pulm Med. 2: 35-44.

197. Pabbidi RM, Cao DS, Parihar A, Pauza ME, Premkumar LS. (2008) Direct role of streptozotocin in

inducing thermal hyperalgesia by enhanced expression of transient receptor potential vanilloid 1 in

sensory neurons. Mol Pharmacol. 73: 995-1004.

198. Page NM. (2004) Hemokinins and endokinins. Cell Mol Life Sci. 61: 1652-1663.

199. Page NM. (2005) New challenges in the study of the mammalian tachykinins. Peptides. 26: 1356–68.

200. Page NM. (2006) Characterization of the gene structures, precursor processing and pharmacology of the

endokinin peptides. Vasc Pharmacol. 45: 200–8.

201. Page NM, Bell NJ, Gardiner SM, Manyonda IT, Brayley KJ, Strange PG, Lowry PJ. (2003)

Characterization of the endokinins: human tachykinins with cardiovascular activity. Proc Natl Acad Sci

U S A. 100: 6245-6250.

202. Page NM, Woods RJ, Gardiner SM, Lomthaisong K, Gladwell RT, Butlin DJ, Manyonda IT, Lowry PJ.

(2000) Excessive placental secretion of neurokinin B during the third trimester causes pre-eclampsia.

Nature. 405: 797–800.

203. Patacchini R, Santicioli P, Giuliani S, Maggi CA. (2004) Hydrogen sulfide (H2S) stimulates capsaicin-

sensitive primary afferent neurons in the rat urinary bladder. Br J Pharmacol. 142: 31-4.

204. Pingle SC, Matta JA, Ahern GP. (2007) Capsaicin receptor: TRPV1 a promiscuous TRP channel. Handb

Exp Pharmacol. 179: 155-171.

205. Pintér E, Helyes Z, Szolcsányi J. (2006) Inhibitory effect of somatostatin on inflammation and

nociception. Pharmacol Ther 112: 440-56.

206. Pintér E, Pozsgai G, Hajna Z, Helyes Z, Szolcsányi J. (2014) Neuropeptide receptors as potential drug

targets in the treatment of inflammatory conditions. Br J Clin Pharmacol. 77: 5-20.

207. Pintér E, Brown B, Hoult JR, Brain SD. (1999) Lack of evidence for tachykinin NK1 receptor-mediated

neutrophil accumulation in the rat cutaneous microvasculature by thermal injury. Eur. J. Pharmacol. 369:

91-98.

208. Poltorak A, He X, Smirnova I, Liu MY, Van Huffel C, Du X, Birdwell D, Alejos E, Silva M, Galanos C,

Freudenberg M, Ricciardi-Castagnoli P, Layton B, Beutler B. (1998) Defective LPS signaling in

C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene. Science. 282: 2085-8.

209. Poyner DR, Sexton PM, Marshall I, Smith DM, Quirion R, Born W, Muff R, Fischer JA, Foord SM.

(2002) International Union of Pharmacology. XXXII. The mammalian calcitonin gene-related peptides,

adrenomedullin, amylin, and calcitonin receptors. Pharmacol Rev. 54: 233-246.

210. Pozsgai G, Bodkin JV, Graepel R, Bevan S, Andersson DA, Brain SD. (2010) Evidence for the

pathophysiological relevance of TRPA1 receptors in the cardiovascular system in vivo. Cardiovasc. Res.

87: 760-8.

211. Pozsgai G, Payrits M, Sághy É, Sebestyén-Bátai R, Steen E, Szőke É, Sándor Z, Solymár M, Garami A,

Orvos P, Tálosi L, Helyes Z, Pintér E. Analgesic effect of dimethyl trisulfide in mice is mediated by

111

TRPA1 and sst4 receptors. Nitric Oxide. 2017 Jan 27. pii: S1089-8603(16)30174-4. doi:

10.1016/j.niox.2017.01.012. [Epub ahead of print]

212. Prior M, Green F, Lopez A, Balu A, De Sanctis GT, Fick G. (1990) Capsaicin pretreatment modifies

hydrogen sulphide-induced pulmonary injury in rats. Toxicol Pathol. 18: 279-88.

213. Qian X, Francis M, Solodushko V, Earley S, Taylor MS. (2013) Recruitment of dynamic endothelial Ca2+

signals by the TRPA1 channel activator AITC in rat cerebral arteries. Microcirculation. 20: 138-48.

214. Regoli D, Boudon A, Fauchére JL. (1994) Receptors and antagonists for substance P and related peptides.

Pharmacol Rev. 46: 551-99.

215. Reutens AT, Atkins RC. (2011) Epidemiology of diabetic nephropathy. Contrib Nephrol 170: 1-7.

216. Rietschel ET, Kirikae T, Schade FU, Mamat U, Schmidt G, Loppnow H, Ulmer AJ, Zähringer U, Seydel

U, Di Padova F, Schreier M, Brade H. (2000) Bacterial endotoxin: molecular relationships of structure to

activity and function. FASEB J. 8: 217-25.

217. Ritchie S, Waugh D. (1957) The pathology of Armanni-Ebstein diabetic nephropathy. Am J Pathol. 33:

1035-1057.

218. Robinson R, Barathi VA, Chaurasia SS, Wong TY, Kern TS. (2012) Update on animal models of diabetic

retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5: 444-456.

219. Rodrigues MR, Rodriguez D, Russo M, Campa A. (2002) Macrophage activation includes high

intracellular myeloperoxidase activity. Biochem Biophys Res Commun. 292: 869–73.

220. Rupniak NM, Webb JK, Williams AR, Carlson E, Boyce S, Hill RG. (1995) Antinociceptive activity of

the tachykinin NK1 receptor antagonist, CP-99,994, in conscious gerbils. Br J Pharmacol. 116: 1937–

1943.

221. Russell FA, King R, Smillie SJ, Kodji X, Brain SD. (2014) Calcitonin gene-related peptide: physiology

and pathophysiology. Physiol Rev. 94: 1099-142.

222. Sakai A, Takasu K, Sawada M, Suzuki H. (2012) Hemokinin-1 gene expression is upregulated in

microglia activated by lipopolysaccharide through NF- B and p38 MAPK signaling pathways. PLoS

ONE. 7: e32268.

223. Salmon AM, Damaj I, Sekine S, Picciotto MR, Marubio L, Changeux JP. (1999) Modulation of morphine

analgesia in alphaCGRP mutant mice. Neuroreport 10: 849-54.

224. Sanger GJ, Tuladhar BR, Bueno L, Furness JB. (2006) Defensive and pathological functions of the

gastrointestinal NK3 receptor. Vascul Pharmacol. 45: 215–20.

225. Santicioli P, Maggi CA. (1994) Inhibitory transmitter action of calcitonin gene-related peptide in guinea-

pig ureter via activation of glibenclamide-sensitive K channels. Br J Pharmacol. 113: 588-92.

226. Savov JD, Gavett SH, Brass DM, Costa DL, Schwartz DA. (2002) Neutrophils play a critical role in

development of LPS-induced airway disease. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 283: 952–62.

227. Schleifenbaum J, Köhn C, Voblova N, Dubrovska G, Zavarirskaya O, Gloe T, Crean CS, Luft FC, Huang

Y, Schubert R, Gollasch M. (2010) Systemic peripheral artery relaxation by KCNQ channel openers and

hydrogen sulfide. J. Hypertens. 28: 1875-1882.

228. Shimizu Y, Matsuyama H, Shiina T, Takewaki T, Furness JB. (2008) Tachykinins and their functions in

the gastrointestinal tract. Cell Mol Life Sci. 65: 295–311.

229. Shirao Y, Kawasaki K. (1998) Electrical responses from diabetic retina. Prog Retin Eye Res. 17: 59-76.

112

230. Silva CR, Oliveira SM, Rossato MF, Dalmolin GD, Guerra GP, Prudente Ada S, Cabrini DA, Otuki MF,

André E, Ferreira J. (2011) The involvement of TRPA1 channel activation in the inflammatory response

evoked by topical application of cinnamaldehyde to mice. Life Sci. 88: 1077-1087.

231. Simon SA, Liedtke W. (2008) How irritating: the role of TRPA1 in sensing cigarette smoke and aerogenic

oxidants in the airways. J Clin Invest. 118: 2383-6.

232. Skarf B. (2002) Retinal nerve fibre layer loss in diabetes mellitus without retinopathy. Br J Ophthalmol.

86: 709.

233. Smillie SJ, King R, Kodji X, Outzen E, Pozsgai G, Fernandes E, Marshall N, de Winter P, Heads RJ,

Dessapt-Baradez C, Gnudi L, Sams A, Shah AM, Siow RC, Brain SD. (2014) An ongoing role of α-

calcitonin gene-related peptide as part of a protective network against hypertension, vascular hypertrophy,

and oxidative stress. Hypertension. 63: 1056-62.

234. Starr A, Graepel R, Keeble J, Schmidhuber S, Clark N, Grant A, Shah AM, Brain SD. (2008) A reactive

oxygen species-mediated component in neurogenic vasodilatation. Cardiovasc Res. 78: 139-47.

235. Staruschenko A, Jeske NA, Akopian AN. (2010) Contribution of TRPV1-TRPA1 interaction to the single

channel properties of the TRPA1 channel. J. Biol. Chem. 285: 15167-15177.

236. Steinhoff MS, von Mentzer B, Geppetti P, Pothoulakis C, Bunnett NW. (2014) Tachykinins and their

receptors: contributions to physiological control and the mechanisms of disease. Physiol Rev. 94: 265-

301.

237. Stipanuk MH, Ueki I. (2011) Dealing with methionine/homocysteine sulfur: cysteine metabolism to

taurine and inorganic sulfur. J Inherit Metab Dis. 34: 17-32.

238. Story GM, Peier AM, Reeve AJ, Eid SR, Mosbacher J, Hricik TR, Earley TJ, Hergarden AC, Andersson

DA, Hwang SW, McIntyre P, Jegla T, Bevan S, Patapoutian A. (2003) ANKTM1, a TRP-like channel

expressed in nociceptive neurons, is activated by cold temperatures. Cell. 112: 819-829.

239. Streng T, Axelsson HE, Hedlund P, Andersson DA, Jordt SE, Bevan S, Andersson KE, Högestätt ED,

Zygmunt PM. (2008) Distribution and function of the hydrogen sulfide-sensitive TRPA1 ion channel in

rat urinary bladder. Eur. Urol. 53: 391-399.

240. Stokes A, Wakano C, Kloban-Huberson M, Adra CN, Fleig A, Turner H. (2006) TRPA1 is a substrate

for de-ubiquitination by the tumor suppressor CYLD. Cell Signal. 18: 1584 −1594.

241. Sugimoto K, Murakawa Y, Sima AA. (2002) Expression and localization of insulin receptor in rat dorsal

root ganglion and spinal cord. J Peripher Nerv Syst. 7: 44-53.

242. Sugimoto M, Sasoh M., Ido M, Narushima C, Uji Y. (2010) Retinal nerve fiber layer decrease during

glycemic control in type 2 diabetes. J Ophthalmol. 2010: pii: 569215.

243. Sun W, Miao B, Wang XC, Duan JH, Ye X, Han WJ, Wang WT, Luo C, Hu SJ. (2012). Gastrodin inhibits

allodynia and hyperalgesia in painful diabetic neuropathy rats by decreasing excitability of nociceptive

primary sensory neurons. PLoS One. 7: e39647.

244. Sunakawa N, Naono R, Ikeda T, Matsushima O, Sakoda S, Nishimori T. (2010) The amino-terminal

region of hemokinin-1 regulates the induction of thermal hyperalgesia in rats. Neuropeptides. 44: 273–8.

245. SuperPain Database, http://bioinformatics.charite.de

113

246. Surowy CS, Kym PR, Reilly RM. (2010) Biochemical pharmacology of TRPV1: Molecular integrator of

pain signals. In: Gomtsyan A, Faltynek CR, editors. Vanilloid receptor TRPV1 in drug discovery.

Targeting pain and other pathological disorders. pp. 101-133. ISBN: 978-0-470-17557-6

247. Szabadfi K, Atlasz T, Kiss P, Reglődi D, Szabó A, Kovács K, Szalontai B, Sétáló G Jr, Bánki E, Csanaky

K, Tamás A, Gábriel R. (2012) Protective effects of the neuropeptide PACAP in diabetic retinopathy.

Cell Tissue Res. 348: 37-46.

248. Szabadfi K, Pintér E, Reglődi D, Gábriel R. (2014) Neuropeptides, trophic factors and other substances

providing morphofunctional and metabolic protection in experimental models of diabetic retinopathy. Int

Rev Cell Mol Biol. 311: 1-121.

249. Szabadfi K, Szabó A, Kiss P, Reglődi D, Sétáló G Jr, Kovács K, Tamas A, Toth G, Gabriel R. (2014)

PACAP promotes neuron survival in early experimental diabetic retinopathy. Neurochem Int. 64: 84-91.

250. Szabó C, Papapetropoulos A. (2011) Hydrogen sulphide and angiogenesis: mechanisms and applications.

Br J Pharmacol. 164: 853-65.

251. Szallasi A, Cortright DN, Blum CA, Eid SR. (2007) The vanilloid receptor TRPV1: 10 years from channel

cloning to antagonist proof-of-concept. Nat. Rev. Drug Discov. 6: 357-72.

252. Szkudelski T. (2001) The mechanism of alloxan and streptozotocin action in B cells of the rat pancreas.

Physiol Res. 50: 537-546.

253. Szolcsányi J. (1988) Antidromic vasodilatation and neurogenic inflammation. Agents Actions. 23: 4-11.

254. Szolcsányi J, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J, Pintér E. (1998a) Release of somatostatin and its role in the

mediation of the anti-inflammatory effect induced by antidromic stimulation of sensory fibres of rat

sciatic nerve. Br J Pharmacol. 123: 936-942.

255. Szolcsányi J, Jancsó-Gábor A. (1975). Sensory effects of capsaicin congeners I: Relationship between

chemical structure and pain-producing potency of pungent agents. Arzneimittelforschung. 25: 1877-1881.

256. Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Zs, Oroszi G, Németh J. (1998b) Systemic antiinfammatory effect induced

by counter-irritation through a local release of somatostatin from nociceptors. Br J Pharmacol. 125: 916-

922.

257. Szolcsanyi J, Szallasi A, Szallasi Z, Joo F, Blumberg PM. (1990) Resiniferatoxin: an ultrapotent selective

modulator of capsaicin-sensitive primary afferent neurons. J Pharmacol Exp Ther. 255: 923–8.

258. Szolcsányi J. (1996) Capsaicin-sensitive sensory nerve terminals with local and systemic efferent

functions: facts and scopes of an unorthodox neuroregulatory mechanism. Prog Brain Res. 113: 343-359.

259. Szolcsányi J, Barthó L. (1982) Capsaicin-sensitive non-cholinergic excitatory innervation of the guinea-

pig tracheobronchial smooth muscle. Neurosci. Lett. 34: 247-251.

260. Takahashi H, Chihara E. (2008) Impact of diabetic retinopathy on quantitative retinal nerve fiber layer

measurement and glaucoma screening. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49: 687-92.

261. Takeda M, Miyake M, Muto T, Kamijima M, Sakamoto T. (2011) Proliferation of sensory C-fibers and

subsequent neurogenic inflammation in rat airway induced by inhaled lipopolysaccharide.

Neurotoxicology. 32: 954–62.

262. Talavera K, Gees M, Karashima Y, Meseguer VM, Vanoirbeek JA, Damann N, Everaerts W, Benoit M,

Janssens A, Vennekens R, Viana F, Nemery B, Nilius B, Voets T. (2009) Nicotine activates the

chemosensory cation channel TRPA1. Nat Neurosci. 12: 1293-9.

114

263. Taylor-Clark TE, McAlexander MA, Nassenstein C, Sheardown SA, Wilson S, Thornton J, Carr MJ,

Undem BJ. (2008) Relative contributions of TRPA1 and TRPV1 channels in the activation of vagal

bronchopulmonary C-fibres by the endogenous autacoid 4-oxononenal. J. Physiol. 586: 3447-3459.

264. Tékus V, Horváth Á, Hajna Z, Borbély É, Bölcskei K, Boros M, Pintér E, Helyes Z, Pethő G, Szolcsányi

J. (2016) Noxious heat threshold temperature and pronociceptive effects of allyl isothiocyanate (mustard

oil) in TRPV1 or TRPA1 gene-deleted mice. Life Sci. 154: 66-74.

265. Togbe D, Schnyder-Candrian S, Schnyder B, Doz E, Noulin N, Janot L, Secher T, Gasse P, Lima C,

Coelho FR, Vasseur V, Erard F, Ryffel B, Couillin I, Moser R. (2007) Toll-like receptor and tumour

necrosis factor dependent endotoxin-induced acute lung injury. Int. J. Exp. Path. 88: 387–391.

266. Tominaga M, Caterina MJ, Malmberg AB, Rosen TA, Gilbert H, Skinner K, Raumann BE, Basbaum AI,

Julius D. (1998) The cloned capsaicin receptor integrates multiple pain-producing stimuli. Neuron. 21:

531 -543.

267. Trevisani M, Patacchini R, Nicoletti P, Gatti R, Gazzieri D, Lissi N, Zagli G, Creminon C, Geppetti P,

Harrison S. (2005) Hydrogen sulfide causes vanilloid receptor 1-mediated neurogenic inflammation in

the airways. Br J Pharmacol. 145: 1123–1131.

268. Trevisani M, Siemens J, Materazzi S, Bautista DM, Nassini R, Campi B, Imamachi N, Andrè E,

Patacchini R, Cottrell GS, Gatti R, Basbaum AI, Bunnett NW, Julius D, Geppetti P. (2007) 4-

Hydroxynonenal, an endogenous aldehyde, causes pain and neurogenic inflammation through activation

of the irritant receptor TRPA1. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104: 13519-13524.

269. Ulich TR, Watson LR, Yin SM, Guo KZ, Wang P, Thang H, del Castillo J. (1991) The intratracheal

administration of endotoxin and cytokines. I. Characterization of LPS-induced IL-1 and TNF mRNA

expression and the LPS-, IL-1-, and TNF-induced inflammatory infiltrate. Am J Pathol. 138: 1485-96.

270. Ulich TR, Yin S, Guo K, Yi ES, Remick D, del Castillo J. (1991) Intratracheal injection of endotoxin and

cytokines. II. Interleukin-6 and transforming growth factor beta inhibit acute inflammation. Am J Pathol.

138: 1097-101.

271. Varecza Z, Elekes K, László T, Perkecz A, Pintér E, Sándor Z, Szolcsányi J, Keszthelyi D, Szabó A,

Sándor K, Molnár TF, Szántó Z, Pongrácz JE, Helyes Z. (2009) Expression of the somatostatin receptor

subtype 4 in intact and inflamed pulmonary tissues. J Histochem Cytochem. 57: 1127-37.

272. Vilceanu D, Stucky CL. (2010) TRPA1 mediates mechanical currents in the plasma membrane of mouse

sensory neurons. PloS One 5: e12177.

273. von Euler US, Gaddum JH. (1931) An unidentified depressor substance in certain tissue extracts. J

Physiol. 72: 74–87.

274. Wang L, Cvetkov TL, Chance MR, Moiseenkova-Bell VY. (2012) Identification of in vivo disulfide

conformation of TRPA1 ion channel. J Biol Chem. 287: 6169-76.

275. Wang R. (2012) Physiological implications of hydrogen sulfide: a whiff exploration that blossomed.

Physiol Rev. 92: 791-896.

276. Wang W, Li Q, Zhang J, Wu H, Yin Y, Ge Q, Zhang Y. (2010) Hemokinin-1 activates the MAPK pathway

and enhances B cell proliferation and antibody production. J Immunol 184: 3590–7.

115

277. Ward WK, Castle JR, El Youssef J. (2011) Safe glycemic management during closed-loop treatment of

type 1 diabetes: the role of glucagon, use of multiple sensors, and compensation for stress hyperglycemia.

J Diabetes Sci Technol. 5: 1373-1380.

278. Watanabe C, Mizoguchi H, Yonezawa A, Sakurada S. (2010) Characterization of intrathecally

administered hemokinin-1-induced nociceptive behaviors in mice. Peptides. 31: 1613–6.

279. Watanabe N, Horie S, Michael GJ, Spina D, Page CP, Priestley JV. (2005) Immunohistochemical

localization of vanilloid receptor subtype 1 (TRPV1) in the guinea pig respiratory system. Pulm.

Pharmacol. Ther. 18: 187-197.

280. White BJ, Smith PA, Dunn WR. (2013) Hydrogen sulphide-mediated vasodilatation involves the release

of neurotransmitters from sensory nerves in pressurized mesenteric small arteries isolated from rats. Br J

Pharmacol. 168: 785-93.

281. Whiteman M, Moore PK. (2009) Hydrogen sulfide and the vasculature: a novel vasculoprotective entity

and regulator of nitric oxide bioavailability? J Cell Mol Med. 13: 488-507.

282. Whiteman M, Le Trionnaire S, Chopra M, Fox B, Whatmore J. (2011) Emerging role of hydrogen sulfide

in health and disease: critical appraisal of biomarkers and pharmacological tools. Clin Sci (Lond). 121:

459-88.

283. Wild V, Messlinger K, Fischer MJ. (2015) Hydrogen sulfide determines HNO-induced stimulation of

trigeminal afferents. Neurosci Lett. 602: 104-9.

284. Yang H, Li S. (2016) Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) channel and neurogenic

inflammation in pathogenesis of asthma. Med Sci Monit. 22: 2917-23.

285. Yang JH, Guo Z, Zhang T, Meng XX, Xie LS. (2013a) Restoration of endogenous substance P is

associated with inhibition of apoptosis of retinal cells in diabetic rats. Regul Pept. 187: 12-6.

286. Yang JH, Guo Z, Zhang T, Meng XX, Sun T, Wu J. (2013b) STZ treatment induced apoptosis of retinal

cells and effect of up-regulation of calcitonin gene related peptide in rats. J Diabetes Complications. 27:

531-7.

287. Yau JW, Rogers SL, Kawasaki R, Lamoureux EL, Kowalski JW, Bek T, Chen SJ, Dekker JM, Fletcher

A, Grauslund J, Haffner S, Hamman RF, Ikram MK, Kayama T, Klein BE, Klein R, Krishnaiah S,

Mayurasakorn K, O'Hare JP, Orchard TJ, Porta M, Rema M, Roy MS, Sharma T, Shaw J, Taylor H,

Tielsch JM, Varma R, Wang JJ, Wang N, West S, Xu L, Yasuda M, Zhang X, Mitchell P, Wong TY;

Meta-Analysis for Eye Disease (META-EYE) Study Group. (2012) Global prevalence and major risk

factors of diabetic retinopathy. Diabetes Care. 35: 556-564.

288. Yoo S, Lim JY, Hwang SW. (2014) Sensory TRP channel interactions with endogenous lipids and their

biological outcomes. Molecules. 19: 4708-44.

289. Yu Y, Chen H, Su SB. (2015) Neuroinflammatory responses in diabetic retinopathy. J

Neuroinflammation. 12: 141.

290. Zeldin DC, Wohlford-Lenane C, Chulada P, Bradbury JA, Scarborough PE, Roggli V, Langenbach R,

Schwartz DA. (2001) Airway inflammation and responsiveness in prostaglandin H synthase- deficient

mice exposed to bacterial lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol. 25: 457–65.

291. Zeng XX, Ng YK, Ling EA. (2000) Neuronal and microglial response in the retina of streptozotocin-

induced diabetic rats. Vis Neurosci. 17: 463-471.

116

292. Zhang D, Freedman BI, Flekac M, Santos E, Hicks PJ, Bowden DW, Efendic S, Brismar K, Gu HF.

(2009) Evaluation of genetic association and expression reduction of TRPC1 in the development of

diabetic nephropathy. Am J Nephrol. 29: 244-51.

293. Zhang Y, Lu L, Furlonger C, Wu GE, Paige CJ. (2000) Hemokinin is a hematopoietic- specific tachykinin

that regulates B lymphopoiesis. Nat Immunol. 1: 392–7.

294. Zhao W, Zhang J, Lu Y, Wang R. (2001) The vasorelaxant effect of H2S as a novel endogenous gaseous

K(ATP) channel opener. EMBO J. 20: 6008-6016.

295. Zhou C, Yool AJ, Nolan J, Byard RV. (2013). Armanni-Ebstein lesions: a need for clarification. J

Forensic Sci. 58 (Suppl. 1): S94-98.

296. Zubrzycka M, Janecka A. (2000) Substance P: transmitter of nociception (Minireview). Endocr Regul.

34: 195-201.

117

AZ ÉRTEKEZÉS ALAPJÁT KÉPEZŐ PUBLIKÁCIÓK

Hajna Z, Sághy É, Payrits M, Aubdool AA, Szőke É, Pozsgai G, Bátai IZ, Nagy L, Filotás D,

Helyes Z, Brain SD, Pintér E. Capsaicin-sensitive sensory nerves mediate the cellular and

microvascular effects of H2S via TRPA1 receptor activation and neuropeptide release.

J Mol Neurosci. 60: 157-70. (2016) IF: 2.376*

(A közlemény fele részben alapja a jelen munkának.)

Hajna Z, Szabadfi K, Balla Z, Biró Z, Degrell P, Molnár GA, Kőszegi T, Tékus V, Helyes Z,

Dobos A, Farkas S, Szűcs G, Gábriel R, Pintér E. Modeling long-term diabetes and related

complications in rats.

J Pharmacol Toxicol Methods. 78: 1-12. (2016) IF: 2.171*

Hajna Z, Borbély É, Kemény Á, Botz B, Kereskai L, Szolcsányi J, Pintér E, Paige CJ, Berger

A, Helyes Z. Hemokinin-1 is an important mediator of endotoxin-induced acute airway

inflammation in the mouse.

Peptides. 64: 1-7. (2015) IF: 2.535

Pozsgai G, Hajna Z, Bagoly T, Boros M, Kemény Á, Materazzi S, Nassini R, Helyes Z,

Szolcsányi J, Pintér E. The role of transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptor

activation in hydrogen-sulphide-induced CGRP-release and vasodilation.

Eur J Pharmacol. 689: 56-64. (2012) IF: 2.592, megosztott első szerző

Helyes Z, Hajna Z. Endotoxin-induced airway inflammation and asthma models.

(könyvfejezet)

In: Arpad Szallasi, Tamás Bíró: TRP channels in drug discovery. Methods in Pharmacology

and Toxicology. Vol.1, pp. 301-342. (2012) online ISBN: 978-1-62703-077-9

(*5-year impact factor)

Impakt faktor: 9.674

Hivatkozások száma: 28

Független hivatkozások száma: 23

118

EGYÉB EREDETI KÖZLEMÉNYEK

Borbély É, Hajna Z, Nabi L, Scheich B, Tékus V, László K, Ollmann T, Kormos V, Gaszner

B, Karádi Z, Lénárd L, Paige CJ, Quinn JP, Szolcsányi J, Pintér E, Keeble J, Berger A, Helyes

Z. Hemokinin-1 mediates anxiolytic and anti-depressant-like actions in mice.

Brain Behav Immun. 59: 219-232. (2017) IF: 6.020*, megosztott első szerző

Tékus V, Horváth Á, Hajna Z, Borbély É, Bölcskei K, Boros M, Pintér E, Helyes Z, Pethő G,

Szolcsányi J. Noxious heat threshold temperature and pronociceptive effects of allyl

isothiocyanate (mustard oil) in TRPV1 or TRPA1 gene-deleted mice.

Life Sci. 154: 66-74. (2016) IF: 2.627*

Scheich B, Gaszner B, Kormos V, László K, Ádori C, Borbély É, Hajna Z, Tékus V, Bölcskei

K, Ábrahám I, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z. Somatostatin receptor subtype 4 activation is

involved in anxiety and depression-like behavior in mouse models.

Neuropharmacology. 101: 204-15. (2016) IF: 4.709*

Bánki E, Hajna Z, Kemény Á, Botz B, Nagy P, Bölcskei K, Tóth G, Reglődi D, Helyes Z. The

selective PAC1 receptor agonist maxadilan inhibits neurogenic vasodilation and edema

formation in the mouse skin.

Neuropharmacology. 85: 538-47. (2014) IF: 5.106

Tékus V, Hajna Z, Borbély É, Markovics A, Bagoly T, Szolcsányi J, Thompson V, Kemény

Á, Helyes Z, Goebel A. A CRPS-IgG-Transfer-Trauma Model Reproducing Inflammatory and

Positive Sensory Signs associated with Complex Regional Pain Syndrome.

Pain. 155: 299-308. (2014) IF: 5.213, megosztott első szerző

Pintér E, Pozsgai G, Hajna Z, Helyes Z, Szolcsányi J: Neuropeptide receptors as potential drug

targets in the treatment of inflammatory conditions.

Br J Clin Pharmacol. 77: 5-20. (2014) IF: 3.878

119

Borbély É, Hajna Z, Sándor K, Kereskai L, Tóth I, Pintér E, Nagy P, Szolcsányi J, Quinn J,

Zimmer A, Stewart J, Paige C, Berger A, Helyes Z. Role of tachykinin 1 and 4 gene-derived

neuropeptides and the neurokinin 1 receptor in adjuvant-induced chronic arthritis of the mouse.

PLoS One. 8: e61684. (2013) IF: 3.534

(*5-year impact factor)

Impakt faktor: 31.087

Hivatkozások száma: 54

Független hivatkozások száma: 36

Az összes közlemény kumulatív impakt faktora: 40.761

Az összes közleményre történő hivatkozás: 82

Az összes közleményre történő független hivatkozás: 59

120

IDÉZHETŐ ABSZTRAKTOK

Borbély É, Tékus V, Hajna Z, Hunyady Á, Berger A, Paige CJ, Szolcsányi J, Pintér E, Helyes

Z. Nociceptive role of hemokinin-1, the newest member of the tachykinin family, in chronic

traumatic neuropathy model of the mouse. Digestive Diseases and Sciences, 59: 1649. (2014)

Kemény Á, Hajna Z, Szitter I, Kun J, Pintér E, Helyes Z. Role of TRPV1 and TRPA1 ion

channels in cigarette smoke-induced chronic airway inflammation model of the mouse. J Mol

Neurosci. 53 (Suppl 1): S174. (2014)

Reglődi D, Bánki E, Hajna Z, Kemény Á, Nagy P, Bölcskei K, Tóth G, Helyes Z. Receptorial

mechanisms of the inhibitory action of PACAP on the vascular changes in neurogenic

inflammation. J Mol Neurosci. 53 (Suppl 1): S181. (2014)

Kun J, Feller D, Szitter I, Hajna Z, Kemény Á, Perkecz A, Csöngei V, Ernszt D, Kovács T,

Pongrácz J, Helyes Z. Cigarette smoke-induced upregulation of the Transient Receptor

Potential Ankyrin 1 ion channel in the mouse lung and in a human pulmonary tissue 3-

dimensional model. Acta Physiol. 211 (Suppl. 697): 107. (2014)

Pintér E, Hajna Z, Pozsgai G, Bagoly T, Helyes Z, Szolcsányi J. Characterization of TRPA1-

mediated and TRPA1-independent microcirculatory responses to hydrogen sulfide in mice.

Nitric Oxide, 31 (Suppl 2): S29-S30. (2013)

Szabadfi K, Hajna ZR, Gábriel R, Pintér E. Comparative histological investigation of the retina

in wild type and somatostatin 4 receptor knockout mice. J Neurochem, 125 (Suppl 1): 272.

(2013)

Helyes Z, Scheich B, Kormos V, Tékus V, Hajna Z, Gaszner B, Pintér E, Szolcsányi J.

Activation of somatostatin receptor subtype 4 (sst4) inhibits anxiety and depression-like

behaviours in mouse models. J Neurochem, 125 (Suppl 1): 230. (2013)

121

Borbély É, Hajna Z, Nabi L, Tékus V, László K, Ollmann T, Karádi Z, Lénárd L, Quinn JP,

Berger A, Paige CJ, Keeble J, Szolcsányi J, Pintér E, Helyes Z. Role of hemokinin-1 and NK1

receptors in anxiety, stress and depression-like behaviour in mice. In: Csillag András (szerk.)

XIV. Conference of the Hungarian Neuroscience Society. p. 282. (ISBN: 978-963-88224-2-0)

(2013)

Borbély É, Hajna Z, Berger A, Sándor K, Tóth I, Kereskai L, Pintér E, Szolcsányi J, Paige CJ,

Quinn JP, Zimmer A, Helyes Z. Hemokinin-1 plays an important role in adjuvant-induced joint

and lung inflammation of the mouse. Eur J Clin Invest. 42 (Suppl 1): 66. (2012)

Hajna Z, Pozsgai G, Boros M, Kemény Á, Helyes Z, Szolcsányi J, Pintér E. Transient receptor

potential ankyrin 1 (TRPA1) receptors play a role in hydrogen sulphide-induced vasodilation

of the mouse ear. Clinical Neuroscience, 65:1 p. 26. (2012)

Tékus V, Hajna Z, Horváth Á, Kun J, Bölcskei K, Szolcsányi J, Helyes Z. Role of the Transient

Receptor Potential Vanilloid 1 and Ankyrin 1 (TRPV1 and TRPA1) ion channels in

thermonociception in mice. Clinical Neuroscience, 65:1 p. 68. (2012)

Scheich B, Kormos V, Tékus V, Hajna Z, Gaszner B, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z.

Somatostatin receptor subtype 4 (sst4) plays an inhibitory role in anxiety and depression-like

behaviours of mice. Clinical Neuroscience, 65:1 p. 57. (2012)

Szabadfi K, Hajna Z, Gábriel R, Pintér E. Analysis of retinal histology in wild type and

somatostatin 4 receptor deficient mice. J Mol Neurosci. 48 (Suppl 1): S191. (2012)

Kemény Á, Boros M, Borbély É, Hajna Z, Sétáló G, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z. Cytokine

profiling of inflamed mouse tissues obtained from different in vivo models. J Mol Neurosci. 48

(Suppl 1): S199. (2012)

Hajna Z, Móricz A, Elekes K, Kemény Á, Kereskai L, Berger A, Paige C J, Szolcsányi J, Pintér

E, Helyes Zs: Role of Hemokinin-1 in a mouse model of acute airway inlammation. Acta

Physiol. 202 (Suppl. 684): 39. (2011)

122

Kemény Á, Boros M, Borbély É, Hajna Z, Sétáló G, Pintér E, Szolcsányi J, Helyes Z. Cytokine

profiling in different inflammatory in vivo mice models. Acta Physiol. 202 (Suppl. 684): 53-

54. (2011)

Pozsgai G, Bagoly T, Hajna Z, Boros M, Helyes Z, Szolcsányi J, Pintér E. Role of transient

receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptors in hydrogen sulphide-evoked calcitonin gene-

related peptide (CGRP) release from isolated rat tracheae. Acta Physiol. 202 (Suppl. 684): 98-

99. (2011)

Hajna Z, Borbély É, Quinn JP, Zimmer A, Pintér E, Szolcsányi J and Helyes Z. Role of

preprotachykinin A (TAC1) gene-derived peptides and the neurokinin 1 (NK1) receptor in acute

nocifensive behaviours and hyperalgesia. Front. Neurosci. Conference Abstract: 13th

Conference of the Hungarian Neuroscience Society (MITT). doi:

10.3389/conf.fnins.2011.84.00131 (2011)

Borbély É, Hajna Z, Simon G, Berger A, Paige C, Quinn J, Pintér E, Szolcsányi J and Helyes

Z Investigation of the role of preprotachykinin A and C (TAC1 and TAC4) gene-derived

peptides in anxiety, stress and depression-like behaviour in mice. Front. Neurosci. Conference

Abstract: 13th Conference of the Hungarian Neuroscience Society (MITT). doi:

10.3389/conf.fnins.2011.84.00099 (2011)

Pozsgai G, Bagoly T, Hajna Z, Boros M, Helyes Z, Szolcsányi J and Pintér E. The role of

transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptors in the H2S-evoked calcitonin gene-

related peptide (CGRP) release from isolated rat trachea. Front. Neurosci. Conference Abstract:

13th Conference of the Hungarian Neuroscience Society (MITT). doi:

10.3389/conf.fnins.2011.84.00022 (2011)

Összes citáció: 3

Összes független citáció: 2

123

KONGRESSZUSI SZÓBELI ELŐADÁSOK JEGYZÉKE

Dr. Hajna Zsófia: Mikrocirkuláció vizsgálatára alkalmas képalkotó módszerek a

gyulladáscsökkentő és fájdalomcsillapító gyógyszerek fejlesztésében.

Gyógyszerésztudományok Fóruma, Pécs, 2014

Dr. Helyes Zsuzsanna, Dr. Hajna Zsófia, Dr. Botz Bálint: Kisállat-képalkotó módszerek

jelentősége és alkalmazási lehetőségei a gyulladás- és fájdalomkutatásban.

IX. Szentágothai Szeminárium, Pécs, 2014

Zs Hajna, G Pozsgai, T Bagoly, L Boros, Á Kemény, Zs Helyes, J Szolcsányi, E Pintér:

Transient Receptor Potential Ankyrin 1 receptors mediate hydrogen-sulphide-induced

calcitonin-gene-related-peptide-release and cutaneous vasodilatation.

37th International Congress of Physiological Sciences (IUPS 2013), Birmingham, UK, 2013

Helyes Zs, Borbély É, Botz B, Tékus V, Hajna Zs, Sándor K, Markovics A, Szolcsányi J,

Quinn JP, Berger A and McDougall JJ: Role of capsaicin-sensitive afferents and sensory-

immune interactions in arthritis.

Neuroinflammation – A satellite symposium to the FENS Featured Regional Meeting, Prague,

Czech Republic, 2013

Erika Pintér, Zsófia Hajna, Gábor Pozsgai, Teréz Bagoly, Zsuzsanna Helyes, János

Szolcsányi: Characterization of TRPA1-mediated and TRPA1-independent microcirculatory

responses to hydrogen sulfide in mice.

2nd European Conference on the Biology of Hydrogen Sulfide, Exeter, UK, 2013

Pintér E., Hajna Z., Pozsgai G., Bagoly T., Helyes Zs., Szolcsányi J. The role of CGRP in the

TRPA1 receptor mediated effects.

10th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide

Conference, Gdynia, Poland, 2013

124

Pintér Erika, Hajna Zsófia, Szabadfi Krisztina, Gábriel Róbert, Balla Zsolt, Biró Zsolt, Degrell

Péter, Kőszegi Tamás, Tékus Valéria, Helyes Zsuzsanna, Dobos András, Farkas Sándor, Szűcs

Gyula: Az 1-es típusú diabetes mellitus modellezése diabeteses neuropathia, nephropathia és

szemelváltozások vizsgálatára patkányban.

Magyar Élettani, Farmakológiai és Mikrocirkulációs Társaságok 2013. évi közös tudományos

Kongresszusa, Budapest, 2013

Zs Hajna, G Pozsgai, T Bagoly, L Boros, Á Kemény, Zs Helyes, J Szolcsányi, E Pintér:

Hydrogen-sulphide (H2S)-induced CGRP-release and cutaneous vasodilatation are mediated

by Transient Receptor Potential Ankyrin 1 (TRPA1) receptors.

I. International Doctoral Workshop of Natural Sciences, Pécs, 2012 (III. helyezés)

E Pinter, Zs Hajna, G Pozsgai, T Bagoly, M Boros, A Kemeny, Zs Helyes, J Szolcsanyi: The

role of transient receptor potential ankyrin 1 (TRPA1) receptor activation in hydrogen-sulphide-

induced CGRP-release and vasodilation.

6th European Congress of Pharmacology, Granada, Spain, 2012

Zsuzsanna Helyes, István Szitter, Zsófia Hajna, Krisztián Elekes, Ágnes Kemény, László

Kereskai, John Quinn, Katalin Sándor, Erika Pintér, János Szolcsányi: Role of the TRPV1 ion

channel and sensory neuropeptides in cigarette-smoke-induced chronic airway inflammation

model of the mouse.

9th Joint Meeting of the European Neuropeptide Club and the Summer Neuropeptide

Conference, London, UK, 2012

Helyes Zsuzsanna, Dezső-Tékus Valéria, Hajna Zsófia, Borbély Éva, Kormos Viktória, Botz

Bálint, Gaszner Balázs, Nagy Péter, Bölcskei Kata, Szolcsányi János: Neuropátiás állapotok

állatkísérletes modellezése szenzoros, motoros és vaszkuláris működések vizsgálati

lehetőségei.

A Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság

és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen,

2012

125

Pozsgai Gábor, Hajna Zsófia, Bagoly Teréz, Szolcsányi János, Helyes Zsuzsanna, Pintér

Erika: A tranziens receptor potenciál ankyrin 1 receptor szerepe a hidrogén-szulfiddal kiváltott

vazodilatációban.

A Magyar Élettani Társaság, a Magyar Anatómusok Társasága, a Magyar Biofizikai Társaság

és a Magyar Mikrocirkulációs és Vaszkuláris Biológiai Társaság Kongresszusa, Debrecen,

2012

É. Borbély, Z. Hajna, A. Berger, K. Sándor, I. Tóth, L. Kereskai, E. Pintér, J. Szolcsányi, C.J.

Paige, J.P. Quinn, A. Zimmer & Z. Helyes: Hemokinin-1 plays an important role in adjuvant-

induced joint and lung inflammation of the mouse.

46th Annual Scientific Meeting of the European Society for Clinical Investigation, Budapest,

2012

Hajna Zsófia: Endotoxinnal kiváltott légúti gyulladás és hiperreaktivitás preprotachykinin C

(TAC4) génhiányos egerekben.

XVI. Korányi Frigyes Tudományos Fórum, Budapest, 2011

126

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Ezúton szeretném köszönetemet kifejezni témavezetőmnek, Dr. Pintér Erika professzor

asszonynak, aki lehetőséget biztosított számomra a kutatócsoporthoz való csatlakozásra, és

azóta szakmailag és emberileg is mindig mellettem áll. Hálásan köszönöm neki, hogy kiváló

útmutatásai révén megismerhettem a farmakológia tudományának szépségét, hogy

elsajátíthattam a precíz és szisztematikus kutatómunkához szükséges tulajdonságokat, valamint

hogy nagyszerű szervezőkészségének köszönhetően új perspektívák nyíltak számomra ezen a

területen.

Köszönettel tartozom Prof. Dr. Biró Zsolt témavezetőmnek, hogy medikus korom óta támogatta

munkámat, és mindvégig példát mutatott az orvostudomány iránti tiszteletből és alázatból.

Hálával tartozom „tiszteletbeli témavezetőmnek”, Prof. Dr. Helyes Zsuzsannának, akihez

mindig bátran fordulhattam, és akinek szakmai tanácsaira mindig számíthattam. Köszönöm

neki, hogy páratlan lelkesedésével, valamint a kutatómunka iránti szenvedélyes és állhatatos

elkötelezettségével mindig új lendületet és hatékony segítséget tudott adni.

Köszönetemet szeretném kifejezni Dr. Barthó Loránd és Dr. Pethő Gábor professzor uraknak,

akik biztosították számomra annak lehetőségét, hogy az Intézet oktatójaként dolgozhassam,

valamint Prof. Dr. Szolcsányi Jánosnak, kutatócsoportunk megalapítójának, akinek a szakma

iránti elhivatottsága példaértékű mindannyiunk számára.

Szeretnék köszönetet mondani Dr. Borbély Évának és Dr. Tékus Valériának azért a rengeteg

segítségért, tanácsért, türelemért és jókedvért, amellyel támogatták munkámat. Mindenek előtt

pedig hálás vagyok nekik őszinte barátságukért, amellyel nem csak a szakmai, de a mindennapi

életben is mindig segíthettük egymást.

Hálásan köszönöm Dr. Kemény Ágnesnek, Dr. Pozsgai Gábornak, Dr. Szőke Évának és Dr.

Bölcskei Katának a kutatás során nyújtott nélkülözhetetlen munkájukat és magas színvonalú

szakmai tanácsaikat. Köszönettel tartozom Dr. Botz Bálintnak, Dr. Sághy Évának, Payrits

Majának, Dr. Scheich Bálintnak, Dr. Csekő Katának, Dr. Szitter Istvánnak és Dr. Kun Józsefnek

mindazért a sok segítségért, amelyet a kísérletek elvégzése során nyújtottak, valamint

diákköröseimnek, Gubányi Tímeának és Móricz Andrásnak a lelkes és szorgalmas

munkájukért.

Szeretnék köszönetet mondani Hírné Perkecz Anikónak a kiváló szövettani metszetek

elkészítéséért, valamint Ömböli Gyulánénak (Dórának), Fábián Ildikónak, Szentes Nikolettnek,

Olasz Istvánnénak (Csillának) és Gógl Csabánénak (Katinak) az in vivo, Bagoly Teréznek pedig

az in vitro kísérletekben nyújtott szakszerű és precíz munkájukért.

127

Ezúton szeretném megköszönni az Intézet valamennyi volt és jelenlegi munkatársának, hogy

egy olyan közösségben dolgozhatom, amelyhez jó érzés tartozni.

Köszönetemet szeretném kifejezni azoknak az Intézetünkön kívül dolgozó kollégáknak is,

akikkel a tudományos munkám során együtt dolgozhattam. Nagy hálával tartozom a tragikusan

fiatalon elhunyt Dr. Szabadfi Krisztinának (PTE TTK Biológiai Intézet), akinek a szakma iránti

szeretete és a kutatómunkához való lelkiismeretes hozzáállása örök példa marad számomra.

Ezúton szeretném neki és Dr. Gábriel Róbert professzor úrnak (PTE TTK Biológiai Intézet) is

megköszönni a retina hisztológiai vizsgálatai során végzett professzionális munkájukat.

Köszönettel tartozom Dr. Kereskai Lászlónak (PTE ÁOK Patológiai Intézet) és Prof. Dr.

Degrell Péternek (PTE KK II. sz. Belgyógyászati Klinika és Nephrológiai Centrum) a

szövettani metszetek értékeléséért, valamint köszönöm Dr. Bánki Eszternek (PTE ÁOK

Anatómiai Intézet), Dr. Balla Zsoltnak (PTE KK Szemészeti Klinika), Dr. Kőszegi Tamásnak

(PTE ÁOK Laboratóriumi Medicina Intézet), Dr. Farkas Sándornak (Richter Gedeon Zrt.) és

Dr. Dobos Andrásnak (Szentes) a közösen végzett kísérletek során nyújtott együttműködésüket.

Külföldi kollaborációs partnereinknek is köszönettel tartozom a kutatómunkánk során nyújtott

segítségükért. Köszönöm Prof. Pierangelo Geppettinek (Firenze), Prof. John Quinn-nek

(Liverpool), Alexandra Bergernek (Toronto), Prof. Susan D. Brain-nek, Aisah Aubdool-nak és

Fiona Russell-nek (London), hogy a génhiányos egerek heterozigóta tenyészpárjait

rendelkezésünkre bocsátották, valamint hogy a kísérletek végzése és a közlemények írása során

is segítették munkánkat.

Végezetül szeretnék köszönetet mondani Családomnak, akikre mindig számíthattam

tanulmányaim és kutatói pályám során is, és akik nélkül ez a dolgozat nem jöhetett volna létre.

Különösen is hálás vagyok Férjemnek az odaadó szeretetéért és végtelen türelméért, amivel

mindig mellettem áll, illetve Édesanyámnak az áldozatkész segítségéért, amellyel mindvégig

támogatott.