UNIVERSIDAD AUTONOMA DE NUEVO LEON

FACULTAD DE MEDICINA

“Empleo de polidioxanona, polipropileno o seda como

materiales de sutura en anastomosis termino-terminal

en arterias musculares, elásticas y venas”

Por

M.C.P. Rodrigo E Elizondo Omaña

COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO

DE DOCTOR EN CIENCIAS CON ORIENTACIÓN

TERMINAL EN MORFOLOGÍA.

Diciembre, 2007

Empleo de polidioxanona, polipropileno o seda como

materiales de sutura en anastomosis termino-terminal

en arterias musculares, elásticas y venas.

Aprobación de la Tesis:

______________________________________________________________________

Dr. med. Santos Guzmán López

Director de Tesis

______________________________________________________________________

Dr. PhD. Julio Sepúlveda Saavedra.

Co-Director de Tesis

______________________________________________________________________

Dra. C. Raquel Ballesteros Elizondo

Comisión de Tesis

______________________________________________________________________

Dr. med. Oscar de la Garza Castro

Comisión de Tesis

______________________________________________________________________

Dr. med. Norberto López Serna

Comisión de Tesis

______________________________________________________________________

Dr. Dionisio Galarza Delgado

Subdirector de Estudios de Posgrado

Empleo de polidioxanona, polipropileno o seda como

materiales de sutura en anastomosis termino-terminal

en arterias musculares, elásticas y venas.

Presentado por

Med. Rodrigo E. Elizondo Omaña

Este trabajo se realizó en el Departamento de Anatomía e Histología de la Facultad de

Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León. Bajo la dirección del Dr. med.

Santos Guzmán López y la Co-dirección del Ph. D. Julio Sepúlveda Saavedra.

Firmas

Director de Tesis Co-Director de Tesis

Dr. med. Santos Guzmán López M.C.P. y Ph.D. Julio Sepúlveda Saavedra

DEDICATORIA

A mis padres:

A mis Padres Lulú y José Juan por su apoyo y motivación.

A mi esposa:

A mi esposa Ángeles por ser la razón y la sinrazón de mi pensamiento y mi alma.

AGRADECIMIENTOS.

A mi padre José Juan Elizondo Elizondo por fomentarme la dedicación y persistencia en

el estudio.

A mi madre Maria de Lourdes Omaña Garza por ser siempre un apoyo y heredarme el

gusto por la docencia.

A mi esposa María de los Ángeles García Rodríguez por su crítica objetiva y siempre

encaminada a lograr un mejor resultado final.

Al Dr. Santos Guzmán López por todo su apoyo, muchas gracias. Por su ejemplo de

superación, ayuda y solidaridad con todas las personas.

Al Dr. Julio Sepúlveda Saavedra por todos sus comentarios y tener siempre la

disposición de escuchar. Por haber sido mí maestro.

A la Dra. Raquel Ballesteros Elizondo por su valioso tiempo que invirtió en mi

capacitación.

Al Dr. Oscar de la Garza Castro por su instrucción y guía en este trabajo.

Al Dr. Norberto López Serna por ser un ejemplo de honestidad.

Al Dr. Roberto Montes de Oca Luna por su ejemplo como gran investigador, ser

humano y amigo.

A Adolfo Soto y Luis Botello por su ayuda.

A mis compañeros y amigos.

Al CONACYT por la beca.

TABLA DE CONTENIDO.

Abreviaturas ………………………………………………………………………

Lista de Tablas ……………………………………………………………………

Lista de Figuras …………………………………………………………………...

Capítulo 1. INTRODUCCIÓN. ………………………………………………… 2

Arteria torácica interna …………………………………………………….. 3

Vena safena mayor …………………………………………………………. 4

Arteria radial ……………………………………………………………….. 5

Arteria gastroepiploica derecha …………………………………………….. 5

Arterias intercostales ……………………………………………………….. 6

Arteria esplénica …………………………………………………………… 6

Arteria epigastrica inferior ………………………………………………… 6

Antecedentes ………………………………………………………………. 7

JUSTIFICACION ………………………………………………………………. 11

OBJETIVO GENERAL ………………………………………………………... 13

OBJETIVOS ESPECIFICOS ………………………………………………….. 13

Capítulo 2. MATERIAL y METODOS ……………………………………….. 14

2.1 MATERIAL …………………………………………………………… 14

2.1.1 Material biológico ……………………………………………………. 14

2.1.2 Grupos Experimentales ………………………………………………. 14

2.1.3 Reactivos……………………………………………………………… 14

2.1.4 Equipo utilizado………………………………………………………. 15

2.2 ESTRATEGIA EXPERIMENTAL…………………………………….. 15

2.3 METODOS…………………………………………………………….. 16

2.3.1 Acto quirúrgico……………………………………………………….. 16

2.3.2 Obtención de la muestra………………………………………………. 19

2.3.3 Procesamiento de la muestra………………………………………….. 19

2.3.4 Análisis histológico…………………………………………………... 19

2.3.4.1 Microscopía de luz………………………………………………….. 19

2.3.4.2 Morfometría........................................................................................ 19

2.3.4.3 Análisis estadístico………………………………………………… 19

2.3.4.4 Inmunohistoquímica ……………………………………………..... 20

Capítulo 3. RESULTADOS……………………………………………………... 21

3.1 Análisis morfológico……………………………………………………. 21

3.1.1 Arteria elástica………………………………………………………... 21

3.1.1.1 Arteria elástica y polidioxanona……………………………………. 21

3.1.1.2 Arteria elástica y polipropileno……………………………………... 22

3.1.1.3 Arteria elástica y seda………………………………………………. 24

3.1.2 Arteria muscular………………………………………………………. 24

3.1.2.1 Arteria muscular y polidioxanona…………………………………... 24

3.1.2.2 Arteria muscular y polipropileno…………………………………… 26

3.1.2.3 Arteria muscular y seda…………………………………………….. 27

3.1.3 Vena…………………………………………………………………... 27

3.1.3.1 Vena y polidioxanona………………………………………………. 27

3.1.3.2 Vena y polipropileno……………………………………………….. 27

3.1.3.3 Vena y seda…………………………………………………………. 28

3.2 Análisis inmunohistoquímico…………………………………………... 30

3.2.1 Arteria elástica………………………………………………………... 30

3.2.2 Arteria muscular………………………………………………………. 30

3.2.3 Vena ………………………………………………………………….. 30

3.3 Resumen de resultados………………………………………………….. 32

Capítulo 4. DISCUSION………………………………………………………… 34

Capítulo 5. CONCLUSION y PERSPECTIVAS……………………………… 37

5.1 Conclusiones……………………………………………………………. 37

5.2 Perspectivas……………………………………………………………... 37

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS………………………………………..... 38

APENDICE A……………………………………………………………………. 48

APENDICE B……………………………………………………………………. 51

NOMENCLATURA. % Porcentaje

* Diferencia estadísticamente significativa

~ Aproximadamente

µm Micrómetros

c/u Cada uno

Ca2+ Calcio

cols. Colaboradores

D.E. Desviación Estándar

DAB Diaminobencidina

DNA Ácido Desoxirribonucleico

dNTP´s Dinucleótidotrifosfato

DPA Difenilamina

dUTP Diuracil Trifosfato

EDTA Ácido Etilendiaminotetracético

ej. Ejemplo

fig. Figura

g Gravedades

grs Gramos

H y E Hematoxilina y Eosina

H2O2 Peróxido de Hidrogeno

hrs Horas

i.p. Intraperitoneal

Kg Kilogramos

L Litros

mg Miligramos

Mg2+ Magnesio

min Minuto

mL Mililitro

N Normalidad

nm Nanómetros

oC Centígrados

pb Pares de bases

PBS Solución amortiguadora de fosfatos

pH Potencial de hidrogeno

Seg Segundos

Strep Estreptavidina

TBE Amortiguador Tris- Borato-EDTA

TDT Deoxinucleotidil Transferasa Terminal

TE Tris-EDTA

μg Microgramos

μL Microlitro

ATI Arteria torácica interna

VS Vena safena

AR Arteria radial

AGED Arteria gastroepiploica derecha

AIs Arterias intercostales

AE Arteria esplénica

AEI Arteria epigastrica inferior

PDS Polidioxanona

LISTA DE FIGURAS.

Figura 1 Estrategia experimental general ………………………………………

15

Figura 2 Anastomosis termino-terminal ……………………………………….

18

Figura 3 Arteria elástica ………………………………………………………..

22

Figura 4 Arteria muscular ……………………………………………………...

24

Figura 5 Vena …………………………………………………………………..

28

Figura 6 TUNEL. Túnicas de la pared vascular ………………………………..

31

Figura 7 TUNEL. Endotelio ……………………………………………………

32

LISTA DE TABLAS.

Tabla 1 Estudios en diferentes materiales de sutura ……………………...

9

Tabla 2 Estudios con diferentes materiales de sutura en vasos sanguíneos

35

LISTA DE GRAFICOS.

Gráfico 1 Micrometrías de arteria elástica con los diferentes materiales de

sutura ………………………………………………………………

23

Gráfico 2 Micrometrías de arteria muscular con los diferentes materiales de

sutura ………………………………………………………………

26

Gráfico 3 Micrometrías de vena con diferentes materiales de sutura ………..

29

RESUMEN AUTOBIOGRÁFICO.

Rodrigo Enrique Elizondo Omaña.

Monterrey, N.L., 23 de mayo de 1980.

Curse mis estudios de primaria, secundaria y preparatoria en escuelas públicas donde

siempre mostré interés y dedicación al estudio. Posteriormente ingrese a la Facultad de

Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León donde obtuve el 3er Lugar de

Generación y Mención Honorífica en el examen profesional.

Durante la carrera universitaria me desempeñe como becario del Departamento de

Anatomía Humana, donde me involucre en proyectos de investigación llegando a

publicar algunos en revistas de divulgación. Participe en el programa de intercambio

académico en hospitales de Valladolid y Guadalajara en España y Messina en Italia.

Posteriormente me desempeñe como Coordinador General de Becarios donde una mis

principales aportaciones fue la creación el Grupo de Investigación en Anatomía (GIA)

que tiene como fin promover, fomentar y desarrollar la investigación en anatomía y sus

ciencias afines. Además, se logró la publicación de artículos científicos en revistas

indexadas y reconocidas por el JCR. Al terminar la carrera decidí ingresar al programa

de Doctorado en Ciencias con Orientación Terminal en Morfología. En este tiempo

realicé una estancia de investigación en el Departamento de Anatomía Humana de la

Universidad de Graz en Austria con el Prof. Andreas Weiglein. Ingresé al Sistema

Nacional de Investigadores como candidato y he publicado artículos relacionados con

esta tesis. He participado en congresos nacionales e internacionales de anatomía y

educación médica.

Otro de mis intereses principales es la docencia en la que he tomando cursos de

capacitación en pedagogía impartidos dentro y fuera de la universidad. El primer

contacto con un grupo ocurrió mientras fui becario del Departamento y desde entonces

he tenido la oportunidad de hacerlo.

PUBLICACIONES.

I. Libros.

1. Participación en la elaboración de “Manual de Disecciones”. Guzmán

López S, Tijerina de la Garza O, Hernández León I. Editorial: McGraw-

Hill. 2002.

2. “Manual de disecciones anatomo-clínicas” No. Registro: 03-2004-

092014201800-01 Guzmán López Santos, Elizondo-Omaña RE, y cols.

Imprenta Universitaria. Agosto 2004.

3. Guzmán López S, Tijerina de la Garza, Hernández León I, Elizondo

Omaña RE. Manual de disecciones. 2da edición. McGraw-Hill. 2006.

II. Revistas Científicas.

1. Elizondo-Omaña RE, Herrera Correa JA, Leal Lira EM, Guzmán

López S, y cols. Comparación anatómica de la arteria torácica interna

con la arteria radial. Medicina Universitaria. 5 (19); 89 - 92, 2003.

2. Elizondo-Omaña RE, Morales-Gómez JA, Guzmán López S, et al. 2004.

Traditional teaching supported by computer assited learning for

macroscopic anatomy. Anatomical Record (B); 278(2); 18-22, 2004.

3. Elizondo-Omaña RE, Guzmán López S, García Rodríguez MA. 2005.

Dissection as a teaching tool: past, present and future. Anat Rec.

285B:11-15.

4. Elizondo-Omaña RE, García Rodriguez MA, Guzmán López S y cols.

2005. Conductos vasculares utilizados en la operación de

revascularización miocárdica. Medicina Universitaria. 7(29):222-5.

5. Elizondo-Omaña RE, García Rodriguez MA, Guzmán López S y cols.

2006. El arte de la disección a través del tiempo. Medicina Universitaria.

8(33):217-21.

6. Elizondo-Omaña RE, Guzmán López S, García Rodríguez MA. 2006.

The influence of histology and embriology courses on student

achievement in gross human anatomy courses. Medical teacher. 28;1.

7. Maldonado-Zimbron VE, Elizondo-Omaña RE, Guzman López S, et al.

2006 An interactive tool for the human anatomy laboratory. Int. J.

Morphol. 24(3):377-382.

8. Elizondo-Omaña RE, García Rodríguez MA, Guzmán López S, et al.

2006. Study Pace as a Factor that influences achievement in a human

anatomy course. Anat Rec. 289B:134-138.

9. Elizondo-Omaña RE, García Rodríguez MA, Guzmán López S, y cols.

2006. El arte de la disección a través del tiempo. Medicina Universitaria

2006;8(33): 254-258.

10. Elizondo-Omaña RE, García Rodríguez MA, Guzmán López S, y cols.

2007. Estudio Anatómico de los arcos arteriales palmares: diámetro y

presentación. Int. J. Morphol. 25(1):55-60.

Publicaciones relacionadas a la tesis.

11. Elizondo-Omaña RE, Herrera Correa JA, Leal Lira EM, Guzmán

López S, y cols. Comparación anatómica de la arteria torácica interna

con la arteria radial. Medicina Universitaria. 5 (19); 89 - 92, 2003.

12. Elizondo-Omaña RE, García Rodriguez MA, Guzmán López S y cols.

2005. Conductos vasculares utilizados en la operación de

revascularización miocárdica. Medicina Universitaria. 7(29):222-5.

13. Elizondo-Omaña RE, García Rodríguez MA, Guzmán López S, y cols.

2007. Estudio Anatómico de los arcos arteriales palmares: diámetro y

presentación. Int. J. Morphol. 25(1):55-60.

1

RESUMEN.

Rodrigo Enrique Elizondo Omaña Fecha de graduación: Diciembre de 2007

Universidad Autónoma de Nuevo León

Facultad de Medicina

Titulo del Estudio: Empleo de polidioxanona, polipropileno o

seda como materiales de sutura en

anastomosis termino-terminal de arteria

elástica, muscular o vena.

Número de páginas: 55

Área de estudio: Morfología. Candidato a grado de Doctor en Ciencias

con Orientación Terminal en Morfología.

Propósito y método del estudio. Hasta hoy se han evaluado los efectos del material de sutura solo

en arteria muscular y entre las suturas más estudiadas se encuentran: nylon, poliglactina,

polipropileno y polidioxanona. No se ha estudiado la respuesta a la sutura en el resto de los

conductos (es decir, arteria elástica y vena). En este trabajo se caracterizaron los efectos de las

suturas en diferentes tipos de vasos sanguíneos. Se realizaron microanastomosis vasculares termino-

terminal en aortas (elástica), arterias femorales (muscular) y venas cavas de ratas Wistar con

polidioxanona, polipropileno y seda como materiales de sutura. Se encontró que la arteria elástica

presenta un engrosamiento transitorio de la túnica media cuando se emplea cualquiera de los

materiales de sutura. En la arteria muscular se observo un engrosamiento transitorio de la túnica

media solo cuando se utilizo seda como material de sutura. En la vena no se encontraron cambios

con ninguno de los materiales de sutura.

Contribuciones y conclusiones. Los resultados del presente estudio nos permiten descartar a estos

materiales de sutura como un factor que pudiera estar involucrado en complicaciones tales como

trombosis, restenosis o formación de placas ateromatosas. Inferimos que el material de sutura no

esta involucrado en las complicaciones (trombosis, restenosis y placas ateromatosas) de la cirugía

de revascularización, por lo que se deben estudiar otros factores como los cambios de presión y el

microambiente que pudieran explicar las variaciones en la evolución clínica.

FIRMA DEL DIRECTOR: _______________________________

Dr. med. Santos Guzmán López

2

Capítulo 1.

Introducción.

Durante la década de los años 30 existió un gran interés por parte de los cirujanos para

proveer un flujo arterial adecuado al corazón isquémico. La cirugía de revascularización al

tejido miocárdico fue desarrollada por Gordon Murray en 1937, pero fue Vineberg en 1946,

el primero en describir tres técnicas experimentales para realizar esta cirugía utilizando la

arteria torácica interna. El objetivo de la cirugía de revascularización miocárdica es proveer

un conducto que al ser colocado en las arterias coronarias tenga una larga permeabilidad y

adecuada perfusión al tejido miocárdico, con la consecuente mejoría clínica del paciente

(Canaver, 1995).

Existen una multitud de factores que intervienen en la elección de un hemoducto para la

cirugía de revascularización. Estos factores podrían dividirse en 3 grupos: relacionados al

paciente, a las características de los hemoductos y a la complejidad del acto quirúrgico.

Entre los factores relacionados al paciente, el más importante es la sobrevida, la edad, las

condiciones clínicas y la disponibilidad de los hemoductos. Las características de los

hemoductos que influyen en la elección son su disponibilidad, la localización anatómica, la

predisposición a cambios histopatológicos (trombosis, hiperplasia de la íntima, ateromas).

La complejidad del acto quirúrgico en sí mismo y la experiencia del cirujano en la

utilización de determinado hemoducto son factores que también pueden influir.

Las diferencias morfológicas existentes entre los conductos podrían explicar la superioridad

de alguno de ellos (Del Campo C, 2003). Los hemoconductos que se han empleado en la

cirugía de revascularización en la actualidad son (en orden por su frecuencia de

3

utilización): arteria torácica interna (ATI), vena safena mayor (VS), arteria radial (AR),

arteria gastroepiploica derecha (AGED). También se han utilizado las arterias intercostales

(AI), esplénica (AE), epigástrica inferior (AEI), cubital (AC) y la vena safena menor

(VSm).

Arteria Torácica Interna (ATI).

La ATI se origina de la primera porción de la arteria subclavia y tiene una trayectoria

descendente, profundamente a la pared anterior del tórax hasta llegar al sexto espacio

intercostal donde se divide en sus ramas terminales: musculofrénica y epigástrica superior

(Moore, 2003). La ATI tiene una trayectoria paraesternal y es acompañada por un par de

venas y el nervio frénico, se encuentra superficialmente al músculo transverso del tórax que

la separa de la pleura. Esta arteria puede emitir algunos ramos a estructuras mediastínicas

(para el timo) y la rama pericardicofrénica que acompaña al nervio frénico. La ATI es

principalmente elástica y tiene un área de sección transversal (intraluminal) promedio de

1.9 mm2 en su parte proximal (Van Son JAM et al., 1993).

Su uso en la cirugía de revascularización fue introducido por Effler (1965), quien demostró

que el flujo de sangre hacia el miocardio mejoraba al utilizar implantes de ATI. En Febrero

de 1968 se realizó por primera vez en Estados Unidos una anastomosis ITA-LAD

(descendente anterior izquierda).

El estudio clásico del grupo CASS (Coronary Artery Surgery Study) se desarrolló para

evaluar el beneficio clínico del uso de la ATI en la cirugía de revascularización. El

seguimiento de los pacientes en este estudio multicéntrico tuvo una media de 16.8 años. Se

4

concluye que el uso de la ATI es un predictor favorable en el pronóstico y sobrevida del

paciente.

La arteria torácica interna es hasta hoy el mejor injerto para revascularización miocárdica,

debido a su alta resistencia a la aterosclerosis (Del Campo C, 2003).

Vena Safena Mayor (VS).

La vena safena mayor, de mediano calibre, se origina por delante del maleolo interno de la

tibia como una continuación del plexo venoso dorsal. Sigue la cara interna de la tibia hasta

la rodilla donde cruza por detrás del cóndilo medial del fémur e ingresa al muslo donde

termina atravesando la fascia cribiforme para drenar en la vena femoral. La vena safena

menor recibe tributarias de la pierna y del muslo, comunica libremente con la vena safena

menor.

En junio de 1968, Rene Favaloro utilizó por primera vez la vena safena en combinación con

la ATI para una anastomosis con la arteria descendente anterior. Al año siguiente la vena

safena ya era utilizada como injerto coronario en numerosos centros.

La vena safena constituye mas del 70% de los conductos empleados como injertos

coronarios debido a su disponibilidad y facilidad técnica para su extracción (Golbasi I,

2005).

5

Arteria Radial (AR).

La AR es una rama de la arteria braquial que tiene un trayecto distal hacia la mano, en su

extremo proximal es cubierta por el músculo braquiorradial (supinador largo) y en su

extremo distal es superficial hasta llegar a la muñeca donde cambia de dirección hacia la

cara posterior de la muñeca (Moore, 2003). Es una arteria muscular, con una anchura de las

túnicas intima y media de 529 μm (σ=52) (Van Son JAM, et al. 1990). En 1973, Alain

Carpentier introdujo el uso de la arteria radial.

Arteria gastroepiploica derecha (AGED).

La AGED es una rama de la arteria gastroduodenal que se localiza en la curvatura mayor

del estómago entre las hojas del omento mayor y termina anastomosandose con la arteria

gastroepiploica izquierda, rama de la arteria esplénica (Moore, 2003). La AGED emite

ramos para el píloro, el antro y cuerpo del estómago, así como para el omento mayor.

La AGED es principalmente muscular y el grosor de las túnicas intima y media es de 291

(σ=109) μm en el segmento proximal (Tavilla G, et al., 1992).

John Pym fue el primero en describir el uso de la arteria gastroepiploica derecha en la

cirugía de revascularización al anastomosarla con la porción distal de la arteria coronaria

derecha.

6

Arterias intercostales (AIs).

Las AIs se originan de la aorta torácica y siguen un curso paralelo a los espacios

intercostales. Se han encontrado combinaciones de los tres patrones histológicos:

elastomuscular, muscular, elástico.

Arteria esplénica (AE).

La AE es la rama de mayor calibre del tronco celiaco, se dirige hacia la izquierda en el

borde superior del páncreas hasta aproximarse al bazo donde se divide en sus ramos

terminales. No existen reportes histológicos de su estructura. En 1973, Sterling Edwards

utilizó la arteria esplénica para realizar un triple bypass.

Arteria epigástrica inferior (AEI).

La AEI se origina como una rama de la arteria iliaca externa, tiene un trayecto ascendente,

se introducirse en la vaina del recto abdominal y termina anastomosándose con la arteria

epigástrica superior, rama de la ATI (Moore, 2003). Es una arteria muscular con escasas

fibras elásticas, la anchura de las túnicas intima y media es de 249 μm (σ=87) (Van Son

JAM, et al., 1990).

La elección de un conducto es la decisión más importante que influye en la sobrevida de un

paciente. Debido a la falta de estudios clínicos prospectivos que comparen la utilización de

cada uno de los diferentes hemoductos con la sobrevida de los pacientes, es necesario

recurrir a los estudios morfológicos que podrían predecir el desarrollo de cambios

histopatológicos que condicionan la permeabilidad y latencia de los hemoductos.

7

Antecedentes.

El sistema vascular forma una serie de conductos cerrados que llevan la sangre bombeada

por el corazón hacia los tejidos y de regreso (Tortora GJ, 2000). Los componentes del

sistema vascular son: arterias, capilares y venas. Estos vasos sanguíneos comparten algunas

características, pero poseen otras que los hacen diferentes y que permiten clasificar los

vasos sanguíneos en grupos identificables. Las características compartidas son la presencia

de tres túnicas: íntima, media y adventicia. La túnica intima esta compuesta por un

endotelio (epitelio escamoso simple) y tejido conectivo subendotelial. La túnica media,

puede variar en sus componentes y grosor, dependiendo del tipo de vaso sanguíneo. La

túnica adventicia es la capa más externa y se confunde con el tejido conectivo circundante.

Las características de la túnica media permiten clasificar los vasos sanguíneos en base a sus

componentes, de tal forma que existen arterias elásticas, musculares, arteriolas, capilares y

venas de diferente calibre (Gartner LP, 2002).

Los vasos sanguíneos sufren cambios como parte del proceso de envejecimiento (Cook JJ,

1989) y también debido a ciertas patologías. Los cambios estructurales debidos al

envejecimiento se observan predominantemente en la túnica media: 1) desorientación,

fragmentación y degeneración de las fibras elásticas, 2) depósito de colágena y

proteoglicanos en las paredes y 3) calcificación. Como resultado de esto las arterias se

endurecen, cambio que se observa de forma principal en las arterias elásticas (Oskvig RM,

1999).

La aterosclerosis es la patología que mas frecuentemente causa la enfermedad arterial

oclusiva. Los síntomas clínicos aparecen por estenosis progresiva, calcificación,

8

hemorragia en el interior de la placa, embolización distal y trombosis luminal (Tierney LM,

2005). La aterosclerosis se caracteriza por infiltraciones de material lípido blando, no

celular en las paredes de la intima (Gartner LP, 2002).

El tratamiento quirúrgico de la enfermedad arterial oclusiva crónica debe encaminarse, por

un lado hacia la corrección de factores de riesgo, y por otro se debe valorar al paciente de

acuerdo al sitio de la lesión, su magnitud y condiciones del lecho distal para considerar el

tratamiento quirúrgico. El procedimiento quirúrgico habitual implica la anastomosis de un

segmento arterial proximal a la oclusión con uno distal a la misma, sea a través de injertos

sintéticos o autólogos (Aguirre Rivero R, 2003). El objetivo de la cirugía de

revascularización es proveer un conducto que al ser colocado en otra parte del sistema

vascular pueda ser una vía adecuada para la irrigación de los tejidos isquémicos. Un avance

en la cirugía vascular es la llamada cirugía endovascular (cateterismo) que puede utilizarse

para la colocación de Stents, endoprotesis, etc.

En la realización de cirugías de revascularización se utilizan diversos materiales de sutura

para realizar las anastomosis. La sutura ideal debe ser fuerte, de fácil manejo, identificable

y debe producir una reacción tisular mínima. Existen estudios que comparan los efectos de

la utilización de diferentes tipos de sutura en tejido muscular, cavidad abdominal, útero,

vasos sanguíneos. Las suturas estudiadas en el sistema vascular son nylon, poliglactina,

polipropileno (prolene), polidioxanona (PDS) y menos frecuentemente la seda. El

polipropileno es la sutura no absorbible sintética mas utilizada en el sistema vascular. La

polidioxanona (PDS) un material absorbible que se ha utilizado en otros tejidos como

ligamentos, tendones, utero e intestino (tabla 1) (O´Brion ES, 1993). La seda es un material

9

no absorbible natural que se utiliza muy poco en cirugía vascular. Se han estudiado

diferentes aspectos del empleo de materiales de sutura como la tensión, el manejo y

cambios morfológicos. Hasta hoy se han descrito los cambios morfológicos observados

secundarios al empleo de materiales de sutura solamente en arterias musculares y se

caracterizaron por un infiltrado de células inflamatorias en los días 1 y 3, así como la túnica

intima completamente reendotelizada a los 7 días y no se reportó hiperplasia de la íntima

(Chen LE, 1993). Sin embargo, falta evaluar la presencia de proliferación y muerte celular.

Autor Modelo Tejido Material de

sutura

Resultados

Wada A, y cols.

Perros Tendón Polidioxanona

y poliester

Proliferación celular (ambos).

Se restablece la continuidad del

tendón (ambos).

O´Broin ES, y cols.

Conejos Tendón Polidioxanona y

polipropileno

Mínima reacción de cuerpo

extraño. No se encontró

diferencia significativa en la

fuerza tensil.

Quesada G, y cols.

Ratas Útero Polidioxanona y

polipropileno

Al usar polidioxanona se

encontró una proliferación

anormal del endotelio en 10%.

El polipropileno desencadenó

una reacción de cuerpo extraño.

Andersen E, y cols.

Ratas Intestino Polidioxanona y

poliglactina

No hay diferencia en

complicaciones y reacción

tisular entre ambos materiales.

Tabla 1. Estudios en de diferentes materiales de sutura en algunos tejidos.

En la actualidad el uso de los conductos vasculares con fines diagnósticos o terapéuticos es

muy frecuente (Sanmartin M, 2004). Para cualquiera que sea el fin del empleo de los

conductos vasculares, estos pueden sufrir cambios en su morfología por factores internos y

externos. Los factores internos que pueden producir cambios son la tensión en la pared, así

como los niveles de saturación de oxígeno. Entre los factores externos se encuentran el

material de sutura, la repetición de los procedimientos en un mismo vaso y la colocación de

Stents. Además hay que considerar los diferentes tipos de vasos sanguíneos (arteria elástica,

muscular, vena) y las características morfológicas que los distinguen. Por lo anterior

10

creemos que los cambios que puedan experimentar secundarios a los factores externos estén

determinados por su estructura. Por lo que es necesario evaluar los efectos de cada factor de

forma independiente sobre los diferentes tipos de vasos sanguíneos, para de esta manera

establecer los cambios que son producidos por ellos. Esto permitirá proporcionar una base

morfológica para su elección en la realización de procedimientos clínico-quirúrgicos.

11

Justificación.

El presente trabajo forma parte de una línea de investigación general en la que se busca

establecer criterios morfológicos para la elección de algún tipo de vasos sanguíneos (arteria

muscular, elástica o vena) para la realización de procedimientos clínicos y quirúrgicos. En

los procedimientos clínicos más comunes como la cateterización es necesario conocer los

cambios morfológicos de un tipo determinado de vaso sanguíneo, así como las

consecuencias estructurales de su uso repetitivo. El empleo de suturas en las cirugías de

revascularización es un elemento que puede interferir en la viabilidad y sobrevida del

injerto, por lo que su adecuada selección es importante. La colocación de Stents en los

vasos sanguíneos y procedimientos quirúrgicos mas complejos como la cirugía de

revascularización miocárdica requieren el conocimiento no solo de las reacciones ante estas

condiciones, si no también los cambios debidos a los cambios en el ambiente, como la

tensión y saturación de oxigeno. Por lo que para poder establecer un criterio en la

realización de estos procedimientos es necesario establecer los cambios que son

secundarios a cada uno de ellos. El primer punto que se desea estudiar es el efecto del

material de sutura sobre la pared de los diferentes tipos de vasos sanguíneos.

Hasta hoy se han evaluado los efectos del material de sutura solo en arteria muscular y

entre las suturas más estudiadas se encuentran: nylon, poliglactina, polipropileno y

polidioxanona. No se ha estudiado la respuesta a la sutura en el resto de los conductos (es

decir, arteria elástica y vena).

Puesto que existen variaciones importantes en la evolución clínica cuando se emplea un

determinado tipo de vaso sanguíneo, nosotros suponemos que el material de sutura podría

12

influir en la evolución clínica por lo que es importante establecer los cambios morfológicos

observados al emplear PDS, polipropileno o seda en anastomosis de arterias musculares,

elásticas y venas ya que podrían relacionarse con la mejor o peor respuesta al tratamiento

de revascularización.

13

Objetivo General.

Proporcionar una base morfológica para la elección del material de sutura en los diferentes

tipos de vasos sanguíneos.

Objetivos Específicos.

1. Valorar la continuidad del endotelio secundario al empleo de PDS, polipropileno o

seda como materiales de sutura en arterias musculares, elásticas y vena de mediano

calibre.

2. Evaluar la presencia de alteraciones morfólogicas en la pared vascular secundaria al

empleo de PDS, polipropileno o seda como materiales de sutura en arterias

musculares, elásticas y vena de mediano calibre.

3. Evaluar la presencia de apoptosis en la pared vascular secundaria al empleo de PDS,

polipropileno o seda como materiales de sutura en arterias musculares, elásticas y

vena de mediano calibre.

14

Capítulo 2.

Material y métodos.

El presente estudio se llevó a cabo en el laboratorio de microcirugía del Departamento de

Anatomía Humana y en los laboratorios del Departamento de Histología de la Facultad de

Medicina de la Universidad Autónoma de Nuevo León.

2.1. Material.

2.1.1. Material Biológico.

Para la realización de este proyecto se empleó un modelo animal: ratas Wistar de ambos

sexos, con un peso entre 250 y 300 gramos (jóvenes). Las ratas fueron mantenidas con dieta

estándar de laboratorio, las cuales 8 hrs previas a la realización del acto quirúrgico se

mantuvieron en ayuno.

2.1.2 Grupos Experimentales.

Las ratas Wistar se dividieron al azar en tres grupos experimentales en los que se utilizó

cada sutura (PDS, polipropileno, seda). Cada grupo se dividió en 3 subgrupos de acuerdo al

tipo de vaso sanguíneo utilizado para la realización de la anastomosis termino-terminal. De

cada subgrupo se obtuvo una muestra de 1 cm (considerando la sutura como punto medio)

al tiempo 0, días 3, 7, 10, 14, 30 para su posterior procesamiento.

2.1.3 Reactivos.

Los reactivos utilizados en el estudio son de alta calidad analítica. Paraformaldehído, ácido

bórico, glicerol y alcohol de Sigma Chemical Company (USA). Acido clorhídrico, acido

acético glacial, eosina amarillenta, hematoxilina anhidra, acido fosfomolíbdico y

fosfotúgnstico, metanol de Analytica Tecnología Industrial Química (México). Escarlata de

15

Biebrich de HYCEL de México, Fascina ácida de MCB Manufacturing Chemical, ácido

pícrico de B&A Speciality Chemical Divisions.

2.1.4 Equipo Utilizado.

Microscopio Quirúrgico Carl Zeiss OpMi 6S

Instrumental microquirúrgico (Dewimed).

Foto Microscopio Nikon Eclipse 50i (sotware Nis Elements)

Microscopio estereoscópico American Optimal

Ultramicrotomo RMC modelo MTX

Balanza analítica Mettler

Centro de inclusión Tissue Tek

2.2 Estrategia Experimental.

La estrategia experimental empleada se muestra en la figura 1.

Figura 1. Estrategia experimental general. Se forman 3 grupos experimentales de acuerdo al tipo de

material de sutura empleado. Estos grupos se subdividen en tres subgrupos en base al tipo de vaso

sanguíneo en el que se realiza la cirugía. Se obtienen las muestras en diferentes tiempos

16

considerados a partir del momento de la cirugía, para su posterior procesamiento y análisis

histológico.

2.3 Métodos.

2.3.1 Acto Quirúrgico.

Cada animal se anestesió con pentobarbital sódico por vía intraperitoneal (40mg/kg). Previa

asepsia y rasurado de la región abdominal o inguinal, se procedió a realizar disección de la

aorta abdominal, arteria o vena cava bajo microscopio quirúrgico (zeiss OpMi 6S).

Para disecar la aorta se realizó un corte longitudinal medio en la cara anterior del abdomen.

Se lateralizaron las vísceras hacia la izquierda y se mantuvieron húmedas al irrigar con

suero fisiológico a 37 grados centígrados. Se colocaron los microclamps en los segmentos

proximal y distal del área disecada y se procede a la sección transversal de la arteria (figura

2). Se procedió a la sección transversal de la aorta y se realizó la anastomosis termino-

terminal (Chen YX y cols 2001.) con un material de sutura (el cual depende del grupo). Se

comprobó la permeabilidad al vaciar el vaso en sentido proximal y liberar para observar el

flujo y latido en la porción distal a la anastomosis. Después de la anastomosis la herida en

piel se suturó con seda 6-0.

Para disecar la arteria femoral se realizó un corte longitudinal que sigue la dirección del eje

mayor del miembro inferior. Las arterias femorales se disecaron una longitud aproximada

de 2 cm. Se colocaron los microclamps en los segmentos proximal y distal del área

disecada y se procedió a la sección transversal de la arteria a la mitad de la distancia entre

la rama muscular profunda y el origen de la arteria epigástrica superficial. Una vez que se

realizó la sección se irriga con solución salina heparinizada y si fue necesario se dilató un

poco con las pinzas. Se realizó la anastomosis termino-terminal (Chen YX y cols. 2001)

17

entre los extremos seccionados, utilizando diferentes materiales como PDS (10-0),

polipropileno (10-0) o seda (10-0) (dependiendo el grupo). Una vez hecho esto se evaluó la

permeabilidad de la anastomosis vaciando el vaso en sentido proximal y liberando para

observar llenado capilar en la extremidad inferior. Después de la anastomosis la herida en

piel será suturada por seda 6-0.

18

Figura 2. Se muestra la forma en que se realiza la anastomosis termino-terminal en los conductos

vasculares.

19

2.3.2 Obtención de la muestra.

Las ratas Wistar fueron sacrificadas por dislocación cervical a los tiempos 0,3,7,10,14,30

días posterior a realizar la cirugía donde se practicó una anastomosis termino-terminal de

los diferentes vasos sanguíneos (aorta, femoral, cava). También se obtuvieron muestras de

controles sanos (sin cirugía). Solo se incluyeron las muestras de las anastomosis que fueron

técnicamente satisfactorias.

2.3.3 Procesamiento de la muestra.

Después del sacrificio, se irrigó con formalina y se secciona el vaso sanguíneo

considerando como centro el punto anastomótico. Estas muestras se procesaron por la

técnica de inclusión en parafina para realizar tinciones con Hematoxilina y Eosina (H y E),

Tricrómico de Masson, Orceína y TUNEL.

2.3.4 Análisis Histológico.

2.3.4.1 Evaluación mediante Microscopía de Luz.

Se realizaron cortes histológicos de 5 μm y se tiñeron con H y E, Tricrómico de Masson y

Orceína. Estas técnicas se describen en el Apéndice A.

2.3.4.2 Morfometrías.

En los cortes teñidos con tricrómico de Masson ser realizaron las mediciones de las túnica

media de los conductos vasculares. Esta técnica permitió identificar las tres túnicas de

forma clara, considerando las láminas elásticas interna y externa en las arterias, mientras en

la vena se consideró el grosor total de la pared vascular.

20

2.3.4.3 Análisis estadístico.

Las mediciones realizadas en las túnicas se comparan entre grupos e intragrupos con la

prueba de ANOVA.

2.3.5 Inmunohistoquímica para el análisis de la fragmentación de la cromatina

utilizando TUNEL.

La valoración de apoptosis por el método de marcaje in situ del DNA fragmentado o

técnica TUNEL (Tdt-mediated dUTP-biotin Nick-End Labeling) tiene su fundamento en la

detección de la rotura del DNA internucleosomal (típica de la apoptosis) en secciones de

tejido embebidas en parafina. Presenta como ventaja la detección en estadios más

tempranos que la hematoxilina y eosina.

Se pone de manifiesto los extremos 3´-OH libres que se generan en la fragmentación de

DNA, incorporando nucleótidos marcados (dUTPs) a dichos extremos mediante la enzima

deoxinucleotidil transferasa terminal (TdT). Estos nucleótidos serán reconocidos por un

anticuerpo antidigoxigenina unido a peroxidasa, la positividad se identifica con H2O2

diaminobencidina observando una coloración marrón oscuro en los núcleos positivos o bien

verde claro (tinción de contraste) en los núcleos negativos para ésta técnica. (Se describe

ampliamente en el apéndice A).

Para realizar la técnica de TUNEL se empleo el kit de Trevigen para muestras fijadas con

formaldehído al 4%, embebidas en parafina y cortes de 6 μm.

21

Capítulo 3.

Resultados.

3.1 Análisis histológico.

Se realizaron un total de 216 (N=216) procedimientos microquirúrgicos en los que se

práctico una anastomosis termino-terminal de los siguientes conductos: aorta (n=72), arteria

femoral (n=72) y vena cava (n=72); en cada conducto se probaron de forma independiente

los 3 materiales de sutura: polipropileno (n=24), polidioxanona (n=24) y seda (n=24).

Además, los efectos del material de sutura fueron evaluados en los tiempos 0, días 3, 7, 10,

14, 30 (para cada tiempo, n=4). Las muestras fueron procesadas por la técnica histológica

para su evaluación morfológica utilizando las siguientes tinciones: hematoxilina y eosina,

tricrómico de Masson y orceína, y otras fueron procesadas con la técnica TUNEL. Se

realizaron micrometrías de las túnica media de los vasos sanguíneos.

Primero se muestran los resultados del estudio morfológico con las diferentes técnicas de

tinción utilizadas y las micrometrías. Luego se reportan los resultados del análisis por la

técnica TUNEL.

3.1.1 Arteria elástica (aorta).

Se realizaron un total de 72 procedimientos quirúrgicos en este conducto en el que se

probaron los tres materiales de sutura y se evaluaron a los tiempos antes señalados (n=4,

por tiempo y condición).

3.1.1.1 Arteria elástica (aorta) y polidioxanona.

Al realizar las anastomosis termino-terminal de arteria elástica (aorta) con polidioxanona

como material de sutura se encontró (figura 3) que en todos los tiempos de evaluación

existió continuidad del endotelio, así como un discreto engrosamiento transitorio de la

túnica media en los días 3,7 y10 (grafico 1) con una recuperación en el día 14 y 30. No se

observaron signos de necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

22

Figura 3. Arteria Elástica. Cortes transversales de aorta de rata. (a) Fotomicrografía de una muestra

control, teñida con HyE en la que se observan las tres túnicas con su morfología normal. (b) Corte

representativo de todo el grupo, que fue teñida con tricrómico de Masson en el que se aprecia la

conservación de la continuidad del endotelio en todas las muestras. (c) Muestra en la que se utilizó

seda como material de sutura que fue teñida con orceína y ocurrió una desorganización de las fibras

elásticas y un aumento en el grosor de la túnica media en todos los tiempos. (d) Muestra del día 30

en la que se utilizó seda como material de sutura que fue teñida con tricrómico de Masson, en la que

observa la reversión de los cambios antes mencionados.

3.1.1.2 Arteria elástica (aorta) y polipropileno.

Al igual que lo ocurrido en el caso de polidioxanona, al emplear polipropileno como

material de sutura en este mismo tipo de vaso sanguíneo se encontró (figura 3) que en todos

los tiempos existió continuidad del endotelio, además de un engrosamiento transitorio de la

túnica media en los días 3,7 y 10 (gráfico 1) con una recuperación en el día 14 y 30. No se

observaron signos de necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

23

Gráfico 1. Micrometrías de arteria elástica con los diferentes materiales de sutura. (a) Se utilizó la

tinción con tricrómico de Masson para realizar las mediciones considerando la túnica media

delimitada entre la lámina elástica interna y externa. Se reporta la media del grosor de la túnica

media (n=4, por condición) para cada conducto y material de sutura. (b) Con Polipropileno se

observa un engrosamiento de la túnica media en los días 3-10 con una recuperación hacia el día 14-

30. (c) Con Polidioxanona se aprecia un engrosamiento de la túnica media (al igual que en el

polipropileno) en los días 3-10 con una recuperación hacia el día 14-30. (d) A diferencia de lo

anterior al emplear seda se observa un engrosamiento desde el tiempo 0 que se mantiene hasta antes

del día 14 con recuperación hacia el día 30.

24

3.1.1.3 Arteria elástica y seda

Al diferencia de lo que sucedió en el caso de polidioxanona y polipropileno como

materiales de sutura, al emplear seda se observó (figura 3) un engrosamiento mas

prolongado de la túnica media en los días 3-14 (grafico 1) con una recuperación en el día

30. La continuidad del endotelio se conservó en todos los tiempos. No se observaron signos

de necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

3.1.2 Arteria muscular (arteria femoral).

Se realizaron un total de 72 procedimientos quirúrgicos en este conducto en el que se

probaron los tres materiales de sutura y se evaluaron a los tiempos 0, días 3,7,10,14 y 30

(n=4, por tiempo y condición).

3.1.2.1 Arteria muscular y polidioxanona.

Al realizar las anastomosis termino-terminal de arteria muscular (arteria femoral) con

polidioxanona como material de sutura se encontraron (figura 4) características

morfológicas normales en las tres túnicas. La continuidad del endotelio fue una

característica común en todos los tiempos de evaluación. No se encontró (grafico 2)

engrosamiento de la túnica media en ningún tiempo y tampoco se observaron signos de

necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

25

Figura 4. Arteria muscular. Cortes transversales de arteria femoral de rata. (a) Fotomicrografía de

una muestra control (no suturada), que fue teñida con HyE en la que se identifican las tres túnicas

con su morfología normal. (b) Corte representativo de todo el grupo, que fue teñida con tricrómico

de Masson en la que se observa el endotelio de forma continuo preservado después de la sutura. (c)

Muestra en la que se utilizó seda como material de sutura que fue teñida con HyE en la que ocurrió

un engrosamiento de la túnica media. (d) Corte representativo teñido con tricrómico de Masson en

la que no se observan alteraciones morfológicas al emplear polipropileno o polidioxanona como

material de sutura.

26

Gráfico 2. Micrometrías de arteria muscular con los diferentes materiales de sutura. (a) Se utilizó la

tinción con tricrómico de Masson para realizar las mediciones considerando las laminas elásticas

interna y externa para delimitar la túnica media. (b) Con Polipropileno se observó que existen

ligeras variaciones en el grosor de la túnica media a lo largo del tiempo pero no hay diferencia

significativa. (c) Con Polidioxanona se apreció una ligera variación en los grosores de las túnicas

medias pero sin ser importantes. (d) Con Seda se observó una aumento en el grosor de la túnica

media en el tiempo 0-10 y luego una recuperación.

27

3.1.2.2 Arteria muscular y polipropileno.

Al realizar las anastomosis termino-terminal de arteria muscular (arteria femoral) con

polipropileno como material de sutura se encontraron (figura 4), al igual que con la

polidioxanona, características morfológicas normales en las tres túnicas. La continuidad del

endotelio fue una característica común en todos los tiempos de evaluación. No se encontró

(grafico 2) engrosamiento de la túnica media en ningún tiempo y tampoco se observaron

signos de necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

3.1.2.3 Arteria muscular y seda

Al diferencia de lo que sucedió en el caso de polidioxanona y polipropileno como

materiales de sutura, al emplear seda se observó (figura 4) un engrosamiento transitorio de

la pared en los días 0-3 (grafico 2) con una recuperación del día 7 en adelante. La

continuidad del endotelio se conservó en todos los tiempos. No se observaron signos de

necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

3.1.3 Vena cava.

Se realizaron un total de 72 procedimientos quirúrgicos en este conducto en el que se

probaron los tres materiales de sutura y se evaluaron a los tiempos 0, días 3,7,10,14 y 30

(n=4, por tiempo y condición).

3.1.3.1 Vena (cava) y polidioxanona.

Al realizar las anastomosis termino-terminal de vena (cava) con polidioxanona como

material de sutura se encontró (figura 5) una morfología normal en las tres túnicas. La

continuidad del endotelio fue una característica común en todos los tiempos de evaluación.

No se encontró (grafico 3) engrosamiento de la pared en ningún tiempo y tampoco se

observaron signos de necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

3.1.3.2 Vena (cava) y Polipropileno.

Al realizar las anastomosis termino-terminal de vena (cava) con polidioxanona como

material de sutura se encontró (figura 5) una morfología normal en las tres túnicas. La

continuidad del endotelio fue una característica común en todos los tiempos de evaluación.

28

No se encontró (grafico 3) engrosamiento de la pared en ningún tiempo y tampoco se

observaron signos de necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

Figura 5. Vena. Cortes transversales de vena cava de rata. (a) Fotomicrografía de una muestra

control (no suturada), teñida con HyE en la que se identifican las tres túnicas con su morfología

normal. (b) Corte representativo de todo el grupo, teñida con tricrómico de Masson en la que se

observa la continuidad del endotelio. (c) y (d) Muestras en representativa de cuando se empleó

polipropileno, polidioxanona o seda como material de sutura en la que no se observan alteraciones.

3.1.3.3 Cava Seda

Al realizar las anastomosis termino-terminal de vena (cava) con seda como material de

sutura se encontró (figura 5) una morfología normal en las tres túnicas. La continuidad del

29

endotelio fue una característica común en todos los tiempos de evaluación. No se encontró

(grafico 3) engrosamiento de la pared en ningún tiempo y tampoco se observaron signos de

necrosis y fibrosis en ninguna de las túnicas.

Grafico 3. Micrometrías de vena con diferentes materiales de sutura. (a) Se utilizó la tinción de

tricrómico de Masson para realizar las mediciones de la pared vascular. (b), (c) y (d) Con

polipropileno, Polidioxanona y Seda (respectivamente) se observa una ligera variación en el grosor

de la pared a lo largo del tiempo, en la que siempre existió superposición de los rangos y

desviaciones estándares.

30

3.2 Análisis Inmunohistoquímico.

Se realizó la técnica TUNEL para la detección de apoptosis en los diferentes conductos

(arterias elástica y muscular, y vena) en los diferentes tiempos. Se utilizó como control

positivo una sección de hígado que fue tratada con una nucleasa para inducir la

fragmentación del ADN.

3.2.1 Arteria elástica.

Se procesaron las muestras de arteria elástica con los diversos materiales de sutura y en

ninguna de las condiciones y tiempos no se encontró positividad a la técnica (figuras 6 y 7).

Así mismo, no se encontraron signos de apoptosis en los cortes procesados con la técnica

histológica y teñidos con tricrómico de Masson.

3.2.2 Femoral.

Se procesaron las muestras de arteria muscular con los 3 materiales de sutura en los

diferentes tiempos y no se encontró positividad a la técnica (figuras 6 y 7). Así mismo, no

se encontraron signos de apoptosis en los cortes procesados con la técnica histológica y

teñidos con tricrómico de Masson.

3.2.3 Cava

Se procesaron las muestras de cava con los 3 materiales de sutura en los diferentes tiempos

y no se encontró positividad a la técnica (figuras 6 y 7). Así mismo, no se encontraron

signos de apoptosis en los cortes procesados con la técnica histológica y teñidos con

tricrómico de Masson.

31

Figura 6. TUNEL. Cortes representativos de cada grupo. (a) Fotomicrografía de hígado que fue el

control positivo procesado con la técnica TUNEL. La positividad consiste en la coloración café

parduzca de los núcleos de los hepatocitos. Corte representativo de los grupos en que se utilizó

arteria elástica (b), arteria muscular (c) y vena (d) en el que se observa negatividad para la técnica

en cualquiera de las túnicas de la pared vascular.

32

Figura 7. TUNEL. Endotelio. (a) Control, fotomicrografia de hígado en el que se observa una vena

central y se identifican las células endoteliales positivas para apoptosis. (b), (c) y (d) Arteria

elástica, muscular y vena (respectivamente) en el que se observa como las células endoteliales son

negativas para la técnica.

3.3 Resumen de resultados.

Al evaluar la reacción de la arteria elástica a los 3 materiales de sutura se encontró que el

polipropileno y la polidioxanona se comportan igual en cuanto no se observó una reacción

de cuerpo extraño y producen un engrosamiento transitorio de la túnica media en el periodo

entre los 3-10 días. Al emplear seda, en cambio, se identificó el engrosamiento por todo el

periodo de evaluación.

33

Al evaluar la reacción de la arteria muscular a los 3 materiales de sutura se encontró que

solo al utilizar la seda se observó un engrosamiento de la túnica media, mientras el

polipropileno y la polidioxanona se comportan de igual forma al no observarse cambios en

las paredes y tampoco reacción de cuerpo extraño.

Al evaluar la reacción de la vena a los 3 materiales de sutura se encontró que con ninguno

se observó un incremento significativo en el grosor total de la pared vascular.

En la literatura existen solo estudios con la arteria muscular. En los que al igual que en

nuestro estudio encuentran un engrosamiento de pared vascular y ausencia de reacción

inflamatoria. No se observó fibrosis ni muerte celular en ninguna de las túnicas vasculares

al emplear alguno de estos materiales de sutura.

34

Capítulo 4.

Discusión.

Se evaluó la histología de las arterias elásticas y musculares, así como de la vena tras la

utilización de tres materiales de sutura (polidioxanona, polipropileno o seda). En la

actualidad solo existen estudios de los materiales de sutura en arterias musculares en

diferentes modelos animales, pero no hay reportes en arterias elásticas y venas. Si bien, los

reportes incluyen suturas absorbibles y no absorbibles, se han utilizado mas las suturas

sintéticas. En este estudio se agrega un material no absorbible natural como es la seda, la

cual es una de las más utilizadas en las diferentes especialidades medias (Uff CR, 1995).

Al estudiar la polidioxanona como material de sutura en arteria elástica y muscular se

observa un comportamiento similar caracterizado por un engrosamiento transitorio de la

túnica media que ocurre en tiempos tempranos. A diferencia de loa anterior, este material

no produce cambios al ser utilizado en conductos venosos. Esto coincide con los hallazgos

de Thompson (1995), que probó este material en arterias musculares y observo un

engrosamiento de la pared vascular y necrosis de la túnica media. Aarnio y cols. (1988)

reportan que la polidioxanona produce un engrosamiento de la pared vascular con

hiperplasia de la túnica intima (tabla 2).

Al evaluar el polipropileno como material de sutura en arteria elástica se observo un

aumento de grosor de la túnica media. A diferencia de cuando se utiliza en arteria muscular

y vena en los que se comporta de igual forma y se caracteriza por no producir

modificaciones significativas en el grosor de la túnica media y continuidad del endotelio.

Estos hallazgos coinciden con lo reportado por Chen (ano) en arterias musculares en las que

no existen cambios en el grosor de las túnicas. Sin embargo, en un estudio similar realizado

por Aarnio y colaboradores (1988) reportaron un engrosamiento de la pared vascular al

utilizar este material de sutura.

Al emplear seda como material de sutura en arterias elásticas, musculares se observo un

incremento en el grosor de la túnica media mayor al observado por los otros materiales de

sutura. Al utilizar seda no se observaron cambios en las paredes vasculares del conducto

35

venoso. Hasta hoy, no existen reportes en la literatura de los cambias en la morfología en

este conducto vascular.

Los resultados de este estudio muestran que el conducto venoso no sufre modificaciones

morfológicas cuando se utiliza polidioxanona, polipropileno o seda como materiales de

sutura en anastomosis termino-terminal. No hay estudios que evalúen las suturas en

conductos venosos. Sin embargo, esto es muy importante porque en cirugías de

revascularización miocárdica la vena safena es la primera elección y es el conducto mas

utilizado (Willman VL, 1996).

Autor Conducto

vascular

Modelo Tipo de

sutura

Principales hallazgos

Claude O y cols. Arteria

femoral

Rata Nylon

Poliglactina

No hay diferencia entre las suturas

absorbibles (poliglactina) y no

absorbibles (nylon).

Hiperplasia de la íntima.

Respuesta inflamatoria.

Thomson SR y

cols.

Arterias

femorales

Ratas Nylon

Polidioxanona

Necrosis en la media.

Engrosamiento de la adventicia

Chen LE y cols.

Arterias

femorales

Ratas Nylon y

polipropileno

No reacción inflamatoria en

tiempos tempranos (hrs) pero si a

partir del día 3.

No se observó hiperplasia de la

túnica íntima.

Chen LE y cols. Arterias

femorales

Ratas Nylon y

polipropileno

No reacción inflamatoria en

tiempos tempranos (hrs) pero si a

partir del día 3.

No se observó hiperplasia de la

túnica íntima.

Aarnio P y cols. Arterias

femorales

perro Polidioxanona y

polipropileno

Polipropileno – Reacción de

cuerpo extraño.

Polidioxanona es superior.

En ambos se observo un

engrosamiento de la túnica íntima.

Tabla 2. Materiales de sutura utilizados en vasos sanguíneos.

Los resultados del presente estudio nos permiten descartar a estos materiales de sutura

como un factor que pudiera estar involucrado en complicaciones tales como la trombosis,

restenosis o formación de placas ateromatosas. En este trabajo se caracterizaron los efectos

de las suturas en diferentes tipos de vasos sanguíneos, por lo que es posible iniciar la

segunda etapa de la línea de investigación que consistirá en realizar estudios dirigidos a

36

determinar el efecto de factores como los cambios de presión y microambiente que

pudieran participar en las complicaciones posteriores a la cirugía de revascularización.

37

Capítulo 5.

Conclusiones y Perspectivas.

5.1 Conclusiones.

1. La vena es conducto vascular donde se observaron las menores alteraciones

morfológicas, independientemente del tipo de sutura.

2. El uso de polidioxanona y el polipropileno como material de sutura en anastomosis

termino-terminal de arterias elásticas y musculares, y venas no produce alteraciones

morfológicas permanentes.

3. Inferimos que el material de sutura no parece estar involucrado en las

complicaciones (trombosis, restenosis y placas ateromatosas) de la cirugía de

revascularización, por lo que se deben estudiar otros factores como los cambios de

presión y el microambiente que pudieran explicar las variaciones en la evolución

clínica.

4. No se observa fibrosis ni muerte celular en ninguna de las túnicas de las paredes de

los vasos sanguíneos estudiados. El endotelio conserva su integridad tras el empleo

de cualquiera de los tipos de sutura.

5.2 Perspectivas.

1. Realizar cirugías de derivación utilizando injertos venosos con estos materiales de

sutura (PDS, polipropileno o seda) y analizar otros factores como los cambios de

presión y el microambiente que pudieran estar involucrados en las complicaciones

de este tipo de cirugía en la clínica.

2. Realizar estudios de medición la fuerza tensil de las suturas en cirugía vascular a

través del tiempo, con el objetivo de proporcionar una base mas amplia para la

selección mas adecuada del material de sutura en cirugía vascular.

38

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS.

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internal mammary artery graft anastomoses. JThorac Cardiovasc Surg. 96:741-5.

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48

APENDICE A

A.1 Técnica Histológica para muestras embebidas en parafina.

1. Obtención de la muestra.

2. Fijación con formaldehído al 4%.

3. Lavado en agua corriente.

4. Deshidratación en alcoholes graduales 60 – 100%

5. Aclaración con xilol.

6. Preinclusión (impregnación en parafina).

7. Inclusión definitiva para la formación del bloque.

8. Microtomía.

9. Adhesión de los cortes en baño de flotación.

10. Desparafinar e hidratar.

11. Coloración o tinción.

12. Deshidratación y aclaración.

13. Montaje con resina sintética.

A.2 Tinción con Hematoxilina y eosina (H y E).

1. Desparafinar con xilol 5 min.

2. Etanol-Xilol 5 min.

3. Etanol absoluto 2 min.

4. Alcohol etílico 96º 2 min.

5. Agua destilada, enjuague lento.

6. Hematoxilina de Gill, 2 min.

7. Agua de la llave (2 lavados), enjuague lento.

8. Alcohol Acido, 1 inmersión rápida.

9. Agua de la llave (2 lavados), enjuague lento.

10. Agua amoniacal 2 inmersiones rápidas.

11. Agua de la llave (2 lavados), enjuague lento.

12. Agua destilada, enjuague lento.

13. Eosina 6 inmersiones.

14. Alcohol etílico 96º enjuague breve.

15. Alcohol etílico 96º 1 min.

16. Etanol absoluto (2 cambios) 2 min.

17. Etanol-Xilol 3 min.

18. Xilol 2 min.

19. Xilol 3 min.

20. Montaje con resina sintética o Entellan.

A.3 Orceína.

1. Desparafinar los cortes de la manera habitual y rehidratar (pasos 1-5 de HyE).

2. Enjuagar en agua destilada 1 min.

3. Teñir en solución de orceína 30 min.

49

4. Enjuagar en etanol del 70%

5. Enjuagar en agua destilada

6. Enjuagar en agua destilada

7. 2 x etanol del 95% (mover en

8. la solución)

9. 2 x etanol del 100 %

10. aclarar en xileno y montar con

11. Montaje con resina sintética o Entellan.

A.4 Tricrómico de Massón.

Fijación.- Formaldehído al 4%.

Inclusión.- En parafina y cortes de 5 µm de espesor.

1. Desparafinar con xilol e hidratar pasando por alcohol y agua destilada.

2. Usar como “mordente” el fijador de Bouin por 30 – 60 min. a 56º C, o toda la

noche a temperatura ambiente.

3. Lavar en agua corriente hasta que el color amarillo desaparezca.

4. Enjuagar los cortes en agua destilada.

5. Pasar los cortes a la hematoxilina férrica de Weigert durante 10 min.

6. Lavar n agua corriente, 5 min. o hacer 3 cambios de 15 seg.

7. Enjuagar en agua destilada.

8. Teñir con la solución de Fucsina-Escarlata por 5 seg. (el tiempo depende de la

calidad y/o concentración y tiempo de uso o de preparación del colorante.

9. Lavar varias veces en agua destilada hasta que esta deje de teñirse.

10. Pasar los cortes a la solución de ácidos Fosofomolíbdico-Fosfotúngstico durante 10

min. Enjuagar brevemente con agua destilada.

11. Colorear con la solución de Azul de Anilina durante 15 seg. (el tiempo depende de

la calidad y/o concentración y tiempo de uso del reactivo).

12. Lavar con agua destilada varias veces hasta eliminar el exceso del colorante.

13. Pasar al acético acuoso por 1 – min.

14. Deshidratar en alcohol de 96º por unos seg. (cuidar que no se decolore).

15. Continuar con el alcohol absoluto hasta acabar en xilol y montar en resina.

A.5 Método inmunohistoquímico para detectar la fragmentación de la cromatina

utilizando tunel.

Para cortes fijados con formaldehído al 4% y embebidos en parafina y cortes de 6 µm.

I. Desparafinar

1. Colocar los cortes en estufa a 57º C, 5 min.

2. Pasar cortes a 2 cambos de xilol 5 min. c/u.

3. Hidratar en alcoholes graduales 100%, 95% y 70%, 5 min. c/u.

4. Sumergir n PBS 1 X, 2 cambios 5 min. c/u.

NO PERMITA QUE LOS CORTES SE SEQUEN.

II. Protocolo del Kit.

50

1. Sumergir las muestras n PBS 1 X 10 min. a temperatura ambiente (TA). *

Secar cuidadosamente alrededor de la muestra.

2. Cubrir con 50 µl/muestra de solución de proteinasa K, incubar de 15 a 30

min. a 37º C.

3. Lavar 2 veces en agua desionizada 2 min. c/u.

4. Sumergir las muestras en solución bloqueadora por 5 min. (NO mas) a TA.

5. Lavar las muestras en PBS 1 X, 1 min.

6. Sumergir en Buffer TdT 1 X, 5 min.

7. Cubrir la muestra con 50 µl de mezcla de reacción de marcaje e incubar de

30 a 60 min. a 37º C en cámara húmeda.

8. Sumergir en Buffer Stop TdT 1 X, 5 min. a temperatura ambiente.

9. Lavar 2 veces en PBS 1 X, 2 min. c/u.

10. Cubrir la muestra con 50 µl de solución Strep-HRP e incubar 10 min. a 37º

C

11. Lavar 2 veces en PBS 1X 2 min. c/u.

12. Sumergir en solución DAB de 2 a 7 min.

13. Lavar en varios cambios de agua desionizada 2 min. c/u.

III. Contratinción

1. Sumergir las muestras en agua desionizada por 2 min.

2. Sumergir las muestras de 5 seg. a 5 min. en verde de metilo.

3. Lavar las muestras subsecuentemente sumergiéndolas 10 veces n cada uno:

a. Agua desionizada.

b.Etanol 70%, 2 cambios.

c. Etanol 95%, 2 cambios.

d.Etanol 100%, 2 cambios.

e. Xilol 2 cambios.

4. Limpie el exceso de xilol.

5. Montar y almacenar en oscuridad.

51

APENDICE B

Soluciones

B.1 ANÁLISIS MORFOLÓGICO

B.1.1 Formaldehído 4%

*Calentar a 60º C. por 30 minutos

PBS 10X 50 ml

Ajustar pH a 7.2

Almacenar a 4º C.

B.1.2 PBS 10 X

NaCl 8 grs.

KCl 0.2 grs.

Na2HPO4 1.44 grs.

KH2PO4 0.24 grs.

B.1.3 Hematoxilina de Gill

Agua destilada 730 ml

Etilenglicol 250 ml

Hematoxilina anhidra (polvo)

* Si esta en cristales pesar

2.0 grs.

2.36 grs.

Yodato de sodio 0.2 grs

Sulfato de aluminio 17.6 grs.

Acido acético glacial 2.0 ml.

* Para la preparación se debe seguir el orden, en agitación, a temperatura ambiente por 1

hora, filtrar antes de usar por primera vez.

B.1.4 Eosina

Solución stock (concentrada)

Eosina amarillenta 1.0 grs.

*Para preparar 500 ml

Paraformaldehído 20 grs.

Agua destilada 450 ml.

52

Agua destilada 20 ml.

Alcohol del 96º 80 ml

Solución de trabajo

Tomar una parte de la solución stock y agregarla en tres partes de alcohol de 80º. Antes de

usar agregar 0.5 mL. de ácido acético glacial, por cada 100 mL. de colorante preparado y

agitar.

B.1.5 Solución de Alcohol-Acido (Diferenciador o decolorante)

Alcohol de 70ª 99 mL.

Acido clorhídrico (HCl) 1 mL.

B.1.6 Solución de Agua amoniacal (Virador)

Agua destilada 99 mL.

Hidróxido de amonio 1 mL.

B.1.7 Hematoxilina Férrica de Weigert

Solución A

Hematoxilina (anhidra) 1 gr.

Alcohol 96º 100 mL.

Solución B

Cloruro férrico acuoso al 29% 4 mL.

Água destilada 95 mL.

Acido clorhídrico conc. 1 mL.

Solución de trabajo

Mezclar partes iguales de las soluciones A y B. (Debe renovarse periódicamente

dependiendo del uso y de consistencia, con el tiempo suele precipitarse).

* Solución acuosa de cloruro férrico

Cloruro férrico 14.5 grs.

Agua destilada 50 mL.

B.1.8 Solución de Fucsina ácida y Escarlata de Biebrich.

Escarlata de Biebrich acuosa al 1% 90 mL.

Fucsina ácida acuosa al 1% 10 mL.

Ácido acético glacial 1 mL.

* Solución acuosa de escarlata de Biebrich

Escarlata de Biebrich 1 gr.

53

Agua destilada 100 mL.

* Solución acuosa de Fucsina ácida

Fucsina ácida 1 gr.

Agua destilada 100 mL.

B.1.9 Solución de Ácidos Fosfomolíbdico y Fosfotúngstico

Ácido fosfomolíbdico 5 grs.

Ácido fosfotúngstico 5 grs.

Agua destilada 200 mL.

B.1.10 Solución de Azul de Anilina

Azul de anilina 2.5 grs.

Agua destilada 100 mL.

Ácido acético glacial 2 mL.

B.1.11 Solución acuosa de Ácido acético al 1%

Ácido acético glacial 1 mL.

Agua destilada 99 mL.

B.1.12 Solución fijadora de Bouin

Solución acuosa saturada de ácido pícrico 75 mL.

Formaldehído (36-38%) 25 mL.

Ácido acético glacial 5 mL.

B.2 INMUNOHISTOQUÍMICA (TUNEL)

La técnica de TUNEL se determinó utilizando l kit de Trevigen®, las soluciones marcadas

con * se deben preparar no mas de 30 minutos antes de usarse.

*B.2.1 Solución de proteinasa K.

2 muestras 4 muestras 10 muestras

Agua desionizada 100 µL. 200 µL. 500 µL.

Proteinasa K 2 µL. 4 µL. 10 µL.

*B.2.2 Solución bloqueadora

Metanol 45 mL.

Peróxido de hidrógeno 30% 5 mL.

54

B.2.3 Solución de Buffer de marcaje TdT 1X

- Diluir el buffer TdT 10X utilizando agua destilada.

- Use 50 mL. de buffer TdT 1X para procesar de 1 a 10 muestras.

- Separe una alícuota de 50 µL. por muestra para preparar la mezcla de reacción de

marcaje (paso 7), y almacenar en hielo.

*B.2.4 Mezcla de reacción de marcaje.

- Descongele la mezcla de TdT y dNTP a TA, colóquela en hielo.

- Para mantener la actividad óptima de la enzima saque del refrigerador l tubo de la

enzima solo el tiempo necesario para tomar el volumen.

- Mantenga la mezcla en hielo.

- Prepare 50 µL. por muestra de la manera siguiente:

2 muestras 4 muestras 10 muestras

Mezcla de TdT dNTP 2 µL. 4 µL. 10 µL.

Stock cationica 50X 2 µL. 4 µL. 10 µL.

Enzima TdT 2 µL. 4 µL. 10 µL.

Buffer de marcaje TdT 1 X 100 µL. 200 µL. 500 µL.

B.2.5 Buffer Stop TdT 1X

- Diluir el buffer stop TdT 10X utilizando agua destilada, almacenar a temperatura

ambiente.

- Use 50 mL. de buffer stop TdT 1X para procesar de 1 a 10 muestras.

Buffer stop TdT 1X 5 mL.

Agua desionizada 45 mL.

*B.2.6 Solución Strep-HRP.

- Use 50 µL. solución Strep-HRP por muestra.

- Almacene la solución a temperatura ambiente.

- Para preparar añada:

2 muestras 4 muestras 10 muestras

PBS 1X 100 µL. 200 µL. 500 µL.

Strep-HRP 2 µL. 4 µL. 10 µL.

*B.2.7 Solución de DAB.

- Descongele DAB a 37º C. almacene a temperatura ambiente NO en hielo, precipita la

solución DAB.

- Prepare la solución no más de 30 minutos antes de usarla.

- Use 50 mL. de solución DAB para procesar de 1 a 10 muestras.

- Para preparar añada:

PBS 1X 50 mL.

DAB 250 µL.

H2O2 30% 50 µL.

55

B.2.6 Verde de metilo 1%.

- Esta listo para usarse, puede re-usarse, almacene en recipiente cerrado, si precipita

filtre.

B.2.9 Control positivo.

TACS-Nucleasa y Buffer

Buffer de marcaje TdT 1X 50 µL.

Mezcla de TdT dNTP 1 µL.

Stock Catiónica 50X 1 µL.

Enzima TdT 2 µL.

TACS-Nucleasa 1 µL.

B.2.10 Control negativo.

- Sustituir la enzima TdT de la mezcla por agua milliq.