What is Analytical Method

Validation ?

엘컴 사이언스

의약품 분석팀 최은정

Analytical Method validation 란 ?

• USP 13(1996 년 ) - 의약품 품질을 보증하기 위해 시행되는 각종 시험에는 각각의

적절한 분석법이 사용되는데 분석법에는 신뢰성이 있는 결과를 주는 것이 기대되며 분석법의 신뢰성을 예상하는 작업 , 확인하는 작업이 분석법 검증 .

• JP(1996 년 ) - 분석법 검증이란 의약품 분석에 사용하는 분석법이 분석법을

사용하는 의도에 합치된다는 것 .

- 즉 , 분석법의 오차가 원인이 되어 생기는 시험판정의 잘못의 확률이 허용되는 정도 ( 程度 ) 라는 것을 과학적으로 입증하는 것이다 .

기준 및 시험법이 필요한 때

• 분석법이 필요한 때

o 분석법의 일상적인 사용 전

o 분석법이 검증된 조건과 변화될 때

o 분석법이 변화되고 그 변화가 분석법의 원래의 범위를 벗어날 때

Development

Optimization

Pre-validation

Validation

Implementation

기준 및 시험법 체계도

Method Validation Process

Validation

Development Optimization

▶ 정상 (Normal) 및 역상 (Reversed Phased) 크로마토그래피

정상 역상

정지상의 극성 극성 비극성

이동상의 극성 비극성 극성

시료가 유출되는 순서 비극성 시료 먼저 분리

극성 시료먼저 분리

이동상의 극성을 증가시키면 용리시간 감소 용리시간 증가

Separation Principles in LC

O Si

CH3

CH3

(CH2)17CH3

O Si

CH3

CH3

(CH2)7CH3

► 높은 극성 물질이나 ion-pairing 물질을 가지고 있는 샘플의 분석에 사용 ► 주로 제초제 , 약물 , 아미노산 유사물질의 분리에 자주 사용 .

Octyl ( C8 H17)2

► silica 지지체에 탄소 18 개 체인으로 구성된 이 결합상은 주로 비극성 또는 약한 극성을 가지는 물질의 분리에 사용되며 , 천연 , 합성 peptides 의 분리에 사용 . ► 수명이 길고 , loading ability 가 높다 .

ODS (Octadecylsilane, C18)1

설 명Bonded-Phase 의 종류

Column 종류

C18 or C8 Cyano Phenyl

일반적으로 컬럼 종류의 변화는 이동상의 변화보다 용이하지 못하므로 컬럼종류의 변화는 용매세기 , 용매선택으로 화합물이 분리가 되지 않을 때실행하는 것이 좋다

Column type selectivity

DA CB20% MeOH

20% AcCN

20% THF

Solvent type selectivity (RPC)-1

Solute polarity- A > B > C > D

Particle size of packing material (theoretical plate)

10 μm 5 μm (x2) 3 μm (x4)

Performance doubled

천연물 분석에 사용되는 HPLC 용 Column 은 일반적으로 C18 의 Particle size 5um, 길이는 15~25cm, 내경은 4.6mm 사용 .

Column type selectivity (RPC)

Column oven selectivity

당 물질과 같이 고온에서 분석해야 하는 시료가 아닌 경우 컬럼 오븐은 선택사항이다 .

산수유의 HPLC condition

-1000

0

1000

2000

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 25.0

mAU

min

4

3

2

1

WVL:260 nmGallic acid

Morroniside Loganin

• System : Dionex ChromelonTM Chromatography Data System with P680 pump and UVD 340U detector

• Column : Shiseido CAPCELL PAK C18 MG 5 m (4.6 x 150 mm),

• Mobile Phase : Acetonitrile – MeOH- 0.1% acetic acid (10:5:85)

• Flow rate : 0.5 ml/min

• Column Heater : 20℃

• Wavelength : 220, 250, 260, 280 nm

• Chromatographic Run Time: 25.0 min

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 25.0-20

0

25

50

75

100 BCT #47 [modified by 1] BCT-30-1(1mg/ml)-50%MeOḨ̉-0.1%formic acid UV_VIS_3mAU

min

1 - 14.937

2 - 15.269

3 - 16.001

WVL:280 nm

진피 (hesperidin)

황련 (berberine)

• System : Dionex ChromelonTM Chromatography Data System with P680 pump and UVD 340U detector

• Column : Gemini C18, 4.6 x 150 mm, 5 m

• Mobile Phase Solvent A; Acetonitrile, Solvent B; 0.1% formic acid

0 → 10 min A/B = 10/90 → 20/80 10 → 20 min A/B = 20/80 → 40/60 20 → 25 min A/B = 40/60 → 10/90

• Flow rate : 1.0 ml/min, back pressure: ~ 1300 psi

• Wavelength : 230, 250, 280, 320 nm

• Chromatographic Run Time: 25 min

HMCO5 의 HPLC condition-1

0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0 16.3 17.5 18.8 20.0 21.3 22.5 23.8 25.0-100

0

100

200

300

400

500

600

1 - BCT-0906( ) #62 [modif ied by 1]새로운 조건 BCT1 UV_VIS_32 - BCT-0906( ) #65 [modif ied by 1]새로운 조건 BCT-1 UV_VIS_33 - BCT-0906( ) #66 [modif ied by 1]새로운 조건 0.2 UV_VIS_3mAU

min

3

2

1

1 - 9.772

2 - 15.537

3 - 16.357

4 - 16.854

WVL:280 nm

Hesperidin

Berberine

PalmatinCoptisine

HMCO5-2HMCO5-1Standard

•System: Dionex ChromelonTM Chromatography Data System with P680 pump and UVD 340UV detector         •Column: Gemini RP18, 5m (4.6mm I.D.×150mm)        •Mobile phase: Solvent A : Acetonitrile, Solvent B : 20mM(1350ul H3PO4,1150ulHAc, 1.236g H3BO3 in 1000ml H2O)+5mM Sodium Heptyl Sulfate•0→ 10 min : A/B = 10/90 →35/65•10→ 20min : A/B = 35/65 → 55/45•20 → 30 min : A/B = 55/45→ 10/90

•Flow rate: 1ml/min , Detection: 280 nm   

•Chromatographic Run Time: 25 min

HMCO5 의 HPLC condition-2

•System : Dionex ChromelonTM Chromatography Data System with P680 pump and UVD 340U detector•Column : Shiseido, 4.6 x 250 mm, 5 m UG•Mobile Phase : Solvent A ; AcCN50%+0.01M NaH2PO4 50% +0.01%triethylamine Solvent B ; 0.01M NaH2PO4 0→ 10 min : A/B = 15/85 → 15/85

10→ 20min : A/B = 15/85 → 25/75 20 → 30 min : A/B = 25/75→ 15/85

•Flow rate : 1.0 ml/min,•Wavelength : 215, 230, 250, 280 nm

•Chromatographic Run Time: 30.0 min

0.0 1.3 2.5 3.8 5.0 6.3 7.5 8.8 10.0 11.3 12.5 13.8 15.0 16.3 17.5 18.8 20.0 21.3 22.5 23.8 25.0 26.3 27.5 28.8 30.0-200

500

1,000

1,500

1,800 #65 [modif ied by 1]빈랑자 1s (in MeOH) UV_VIS_1mAU

min

1 - 4.899

WVL:215 nm

N

CH3

COOCH3

Peak #1 100% at 4.69 min

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

200 250 300 350 400 450 500 550 595

%

nm

211.8

50% at 4.58 min: 999.99 -50% at 4.84 min: 1000.00

빈랑자 지표성분 chromatogram

Arecoline

Analytical Method Validation 목적

• Identification of Sources and Quantitation of Potential errors

• Determination if Method is Acceptable for Intended Use

• Establish Proof that a Method Can be Used for Decision Making

• Satisfy FDA Requirements

선정된 시험법이 재현성이 있고 의도한 목적에 부합되는 신뢰성이 있는 결과를 얻는다는 것을 보증하는데 있다 .

What are the Benefits of Analytical Method

Validation?

• Regulatory Compliance

• Assurance that Test data from

Methods are Reliable

• Establishment that Test Data are

Reproducible, Accurate, Specificity….

GMP Validation Parameters

• Accuracy

• Specificity

• Sensitivity

• Reproducibility

21 CFR 211.165 (e)

FDA Validation Parameters

• Accuracy

• Precision

• Linearity

(& Range)

• Specificity

(& Determination Limit)

• Recovery

• Ruggedness

1987 FDA Guidelines

ICH/USP Validation Requirements & Parameters

• Specificity

• Linearity

• Range

• Accuracy

• Precision o Repeatabilityo Intermediate

Precisiono Reproducibility

• Limit of Detection

• Limit of Quantitation

ICHUSP

• Specificity

• Linearity

• Accuracy

• Precision

• Limit of Detection

• Limit of Quantitation

• Ruggedness

• Robustness

Guideline for Method Validation

• USP Chapter <1225>

o Validation of Compendial Methods

• ICH Guidelines

o Q2A, Text on Validation of Analytical procedures

(March 1995)

o Q2B, Validation of Analytical Procedures:

Methodology (May 1997)

ICH Guidelines(International Conference on Harmornization) 으로

의약품 전반의 guideline 입니다

Validation Parameter• Linearity

• Precision o Repeatabilityo Intermediate Precisiono Reproducibility

• Accuracy

• Specificity

• Sensitivity

• Range

• Limit of Detection

• Limit of Quantitation

• Ruggedness

• Robustness

각 시험 방법의 목적에 맞는 Validation Parameter 을 선정 , 평가

Linearity

• 시험법에 있어서의 직선성 이란 ? 검체 중에 함유되어있는 분석대상물 ( 지표성분 ) 의 양

또는 농도에 대하여 직선적인 비례관계를 나타내는 것

• A minimum of 5 concentrations nomally be used . -ICH

• R2 > 0.99 for chromatographic method

※ R2 (coefficient of determination) ?

- 상관계수의 제곱 혹은 결정계수

- 통계적으로는 종속변수의 전체 변동 중에서 회귀모형에 의하여 설명된 변동의 비율

- 즉 , R2 이 0.99 라면 농도와 면적 값으로 얻어지는 실험결과를 통해 만들어진 회귀모형 ( 직선식 ) 이 99% 정확함 .

• 균일한 시료로부터 다수의 검체를 시험했을 때 시험결과간 일치( 재현성 ) 정도 .

⇒ 시험법의 정밀성 : 표준편차 (SD) 또는 상대적 표준편차 (STDEV) 로 표시

► 3 concentrations 각각 3 번씩 시행 .

► RSD (Relative Standard Deviation) < 2% RSD= ( 표준편차 /측정된 값 ) ｘ 100

☞ Intermediate Precision: 동일시료에 대해 다른 날짜 , 다른 시험자 , 다른 설비 등의 실험실 변동이 미치는 변화를 확인하는 것 . ( 표준편차가 2% 이내이면 적합 )

☞ Reproducibility expresses the precision between laboratories (collaborative studies, usually applied to standardization of methodology)- USP 에 따르면 Ruggedness 와 같다고 한다 .

Precision

• 기지량 ( 旣知量 ) 을 첨가한 검체의 분석에 의한 회수율로 시험법의 정확도를 재는 척도 .

☞ 제제 중에는 목적성분을 정량 할 때 공존하는 성분에 의해 방해를 받을 수 있습니다 .

☞ 확인방법 : 정량의 목적성 분을 추가하여 정량 할 때 추가된 양이 정확하게 회수되는지로 입증합니다 .

• 검체 3 개 지표성분 3 개를 첨가 후 각각 3 번씩 실험 시행 → 회수율 (Recovery) -90~110%

• RSD (Relative Standard Deviation) < 2%

Accuracy

• Specificity 공존이 예측되는 불순물 , 분해물 , 배합성분들이 서로

영향을 받지 않고 특이적으로 측정할 수 있는 능력 .

• Sensitivity 농도의 미소변화를 기록할 수 있는 시험법의 성능을

의미하며 calivration curve 의 경사에 해당된다 .

• Range 적절한 정밀성과 정확성 또는 직선성을 가지고 측정된다는 것이 증명된 분석 대상물의 최고농도와 최저농도 또는 양의 사이 ( 간격 ).

Specificity / Sensitivity/ Range

• 검출한계란 ?

시료에 포함되는 분석대상물의 검출이 가능한 최소량 또는 최저농도를 말하며 검출한계에서는 정량을 할 수 없는 경우도 있다 .

o Based on Signal-to-Noise• Acceptance criteria = 3:1

o LOD = 3.3X(SD/Slope) • S = slope of calibration curve• SD : standard deviation of the respons

LOD (Limit of detection)

• 정량한계란 ? ☞ 검체 중에 포함되어있는 분석대상물의 정량이 가능한 최소량 또는 최저농도

☞ 정량한계의 측정법 기지량의 분석대상물의 농도를 점진적으로 감소시킨 검체를

측정하여 허용되는 진도와 정도를 가지고 측정할 수 있는 최저의 양 또는 농도를 정량한계로 한다 .

o Based on Signal-to-Noise• Acceptance criteria = 10:1

o LOD = 10X(SD/Slope) • S = slope of calibration curve• SD : standard deviation of the respons

LOQ (Limit of quantitation)

Robustness & Ruggedness• Robustness - 분석조건의 약간의 변화에 의해서 영향을 받는 정도를 말하며 분석법에 대한 신뢰성의 지표 .

Examples of typical variations in LCo Influence of variations of pH in a mobile phaseo Influence of variations in mobile phase compositiono Different columns (different lots and/or suppliers)o Temperatureo Flow rate

• Ruggedness - 정상적인 시험조건 ( 시험실 , 시험자 , 시험기기 , 시약로트 , 분석

소요시간 , 분석온도 , 분석날짜등 ) 의 변화 하에서 동일한 시료를 분석하여 얻어지는 시험결과의 재현성 .

- 시험법이 시험변수 및 환경변수의 영향을 받는 정도 .

Today’s Validation Requirements

ICH/USP

GMPs(legal) FDA

Selection of method validation parameter

ICH Q2B guidelineLOQ

3.3X(s/S)LOD

CriteriaMain

reason for selection

Analytical Task

r2 ≥0.99Linearity

Inter day,Intra day

RSD(%)≤ 2%Precision-repeatability

Recovery test

(90~110%)

ICH Q2B guideline

Accuracy USP,ICH guideline

10X(s/S)

USP,ICH guideline

HPLC 를 이용한 동시분석법의 확립• 동시분석법 validation - 직선성 : 지표성분을 6 개 이상의 농도에 대한 검량선 확립

- 정밀성 (Precision) intra-day variability : 동일한 날에 3 가지 농도에 대하여 3 회 이상 측정

inter-day variability : 시험일자를 달리하여 3 가지 농도에 대하여 3 회 이상 측정

- 정확성 (Accuracy) 탕제에 지표성분을 가한 후 지표성분의 함량을 측정

• 탕제 중 지표성분의 함량 분석 : 탕제를 3 가지 농도로 희석하여 함량 측정

• 개별분석법과의 비교 : 확립된 동시분석법과 기존의 개별분석법으로 각각 지표성분의 함량을 측정비교

생약 학명 지표성분(K.P.)

각량 (g)

감초 Glycyrrhiza uralensis

glycirrhizin 2.0

당귀 Angelica gigas - 6.0

황금 Scutellaria baicalensis

baicalin 3.0

승마 Cimicifuga heracleifola

- 1.0

시호 Bupleurum falcatum

- 5.0

대황 Rheum palmatum

- 0.5

총량 (g) 17.5

O

H

H

COOH

O

HGlcAGlcA

 glycyrrhizin   

  baicalin

O

OOH

HO

GlcO

< 조성 > < 지표성분 >

을 자 탕을 자 탕

HPLC conditions

• System : Dionex ChromelonTM Chromatography Data System with P680 pump and UVD 340U detector

• Column : Waters Xterra RP18, 4.6 x 150 mm, 5 m

• Mobile Phase Solvent A; Acetonitrile, Solvent B; 0.03% phosphoric acid (pH 2.30)

0 → 13 min A/B = 20/80 → 40/60 13 → 20 min A/B = 40/60 → 75/25 20 → 23 min A/B = 75/25 → 20/80 23 → 25 min A/B = 20/80 → 20/80

• Flow rate : 1.0 ml/min, back pressure: ~ 1300 psi

• Column Heater : 20℃

• Wavelength : 203, 230, 250, 280 nm

• Chromatographic Run Time: 25.0 min

0.0 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0 18.0 20.0 22.0 25.0-200

500

1,000

1,600 À»ÀÚÅÁ #3 [modified by 1] À»ÀÚÅÁ(ÁËÁ¾Á¶°Ç) UV_VIS_3mAU

min

1 - 8.134

2 - 16.350

WVL:250 nm

glycyrrhizin

baicalin

HPLC chromatogram

Peak #1 100% at 8.12 min

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

200 225 250 275 300 325 350 375 400

%

nm

216.1201.8205.5

50% at 8.06 min: 999.83 -50% at 8.18 min: 999.91

Peak #2 100% at 16.30 min

-10.0

0.0

10.0

20.0

30.0

40.0

50.0

60.0

200 225 250 275 300 325 350 375 400

%

nm

251.7

50% at 16.25 min: 999.97 -50% at 16.36 min: 999.97

baicalin  glycyrrhizin   

Compound concentration

y=ax+b R2 LOD(ug) LOQ(ug)

range (ug/ml) slope(a) intercept(b)

Baicalin 2.0 – 400 7.7973 -0.1123 0.9994 0.0376 0.0946

Glycyrrhizin 1.0 – 200 7.7957 0.0060 0.9995 0.0307 0.0930

Calibration curves for marker substances

y = 7.7973x - 0.1123R2 = 0.99940.00

10.00

20.00

30.00

40.00

0 1 2 3 4 5

Conc.(ug)

Are

a(m

AU

*min

) baicalin glycyrrhizin

y = 7.9157x + 0.005R2 = 0.99950.00

5.0010.0015.0020.00

0 0.5 1 1.5 2 2.5

Conc.(ug)

Are

a(m

AU

*min

)

검량선 및 정량한계

동시분석법 검증 : 정밀성

Compound Intraday (n=3) Interday (n=3)/spiked amount(ug)

Detected (ug)

R.S.D.(%)

Accuracy (%)

Detected (ug)

R.S.D.(%)

Accuracy(%)

Baicalin

2.00 2.020.06 2.92 98.90 2.070.05 2.28 96.370.80 0.850.03 2.99 94.20 0.760.05 6.66 105.030.20 0.220.02 7.74 91.40 0.210.03 15.27 92.95

Glycyrrhizin

1.00 1.000.03 2.64 100.19 1.040.03 2.88 96.180.40 0.410.01 2.45 96.50 0.390.02 6.12 103.340.10 0.110.001

21.06 88.28 0.110.01 7.89 94.56

R.S.D.(%) = (S.D./mean)X100Accuracy(%)=[1-(mean concentration measured-concentration spiked)/concentration spiked] X100

Intra- and Inter day variability

동시분석법을 이용한 함량 분석

탕제 농도 (mg/ml) 함량 (%) STDEV R.S.D. (%)

baicalin

100 2.23 0.03 1.44

50 2.35 0.05 2.15

25 2.17 0.10 4.66

Average 2.25 0.10

Glycyrrhizin

100 0.210.0016 0.75

50 0.210.02 9.28

25 0.200.01 3.18

Average 0.21 0.01

precision

spiked amount(ug) Detected amount(ug) recovery(%) R.S.D.(%)

baicalin

11.76 11.84 100.72 1.21 1.20

9.48 9.55 99.73 0.96 0.96

7.97 8.07 101.26 0.09 0.09

Glycyrrhizin

1.06 1.17 101.241.71 1.68

0.85 0.86 100.561.60 1.59

0.71 0.71 99.513.75 1.77

Accuracy

정확성