Jornada Interhospitalaria de Residentes de Laboratorio

Diagnstico Alergolgico in vitro: Alergeno y respuesta IgE

Ingrid Buhigas Garca

MIR 3 ao

Alergeno Allos= otro, ergon= actividad.

genes= produccin, descendencia.Antgenos, normalmente de naturaleza proteica, que sensibilizan al husped provocando reacciones alrgicas.

ALERGENOS Y ENFERMEDADES ALRGICAS

Asma y/o rinitis Anafilaxia Dermatitis atpica

Polen de herbceas Veneno de insectos caros del polvo Alergenos de alimentos Frmacos domsticoPolen de rboles Alergenos de Alergenos profesionalesPolen de plantas leosas alimentosHongoscaros del polvo domsticoEpitelio de animalesAlergenos profesionalesAlergenos de alimentos

FACTORES QUE INFLUYEN SOBRE LA ALERGENICIDAD

Intrnsecos Extrnsecos

Complejidad molecular (tamao) Contaminantes Concentracin Humo del tabaco Solubilidad Infecciones vricasDistancia filogentica Sexo y predisposicin genticaEstabilidad Estacin del ao en que se naceActividad bioqumica Higiene

Peso al nacer

Fuentes alergnicas

Aeroalergenos: plenes, hongos, harina de cereales, productos de las plantas, epitelio y orina de animales, plumas de aves, caros del polvo domstico, insectos.

Orales: alimentos, frmacos.

Inyectados: insectos, y frmacos.

Aeroalergenos: Va de exposicin ms importante es la inhalacin, aunque

tambin pueden llegar por ingestin y por inyeccin: 1. Plenes: que son una de las fuentes principales de alergenos,

responsables del 10-20% de enfermedades alrgicas, la ms importantes de las cuales es la rinitis. Los ppales plenes alergnicos derivan ms de plantas polinizadas por el viento (anemfilas) que de plantas polinizadas por insectos, y losplenes de importancia clnica varan de acuerdo con su ubicacin. En Espaa, por reas geogrficas, la 1 causa depolinosis son las gramneas en el centro y norte de la pennsula, el olivo en el Sur y la parietaria en las regiones costeras mediterrneas (Barcelona, Murcia y Valencia). Los granos de polen desaparecen de la atmsfera los das de lluvia, y son liberados cuando predomina un tiempo seco y caluroso. El final de la primavera y el verano son las pocas con recuentos mximos de polen. La cantidad de polen necesaria para desencadenar la sintomatologa es superior al principio que al final de la estacin polnica.

Aeroalergenos: 2. Alergenos de hongos: Aspergillus, Cladosporium, penicilllium y

Alternaria spp as como los championes, hongos de los helechosetc, constituyen fuentes importantes de alergenos. Las condiciones que influyen en la liberacin de las esporas son extremadamente variables pero sumamente especficas para una determinada especie. De los hongos, el Aspergillus y Alternariaparece que son sumamente importantes para el asma.

3. Alergenos derivados de animales: son de importancia clnica primordial tanto domstica como familiar. Es especialmente frecuente la alergia a perros y gatos. En el entorno laboral es frecuente la alergia a ratas, caballos, conejos, ratones, jerbosy cobayas. Los alergenos derivan de la caspa, del epitelio, del pelo, de la orina y de la saliva, aunque es posible que losalergenos procedan de la misma fuente ( ej orina o saliva depositadas en el pelo)

Aeroalergenos: 4. Alergenos de los artrpodos: incluyen cucarachas, polillas,

mosquitos, mariposas, caros del polvo y saltamontes. Los caros del polvo domstico suponen la fuente de alergenos clnicamente ms importante en todo el mundo. Las especies de caros son universales, pero las ms importantes son las localizadas en los domicilios privados, que suelen vivir en las alfombras, las tapiceras y colchones, proliferan mejor a 25C y a una humedad relativa del 80%

5. Alergenos profesionales: oscilan desde compuestos qcos de bajo Pm ht prots complejas derivadas de animales o plantas. La exposicin recurrente puede ocasionar una enfermedad crnica con escasa variabilidad perceptible, lo que hace difcil asociar la enfermedad con la exposicin.

Alergenos por va oral Alergenos de alimentos: Parece que estn implicados mltiples mecanismos,

incluyendo las respuestas de HS I-IV, la liberacin directa de mediadores inflamatorios celulares tras una exposicin a productos alimenticios y la existencia de mediadores inflamatorios en los alimentos. Cualquier alimento puede producir una alergia, aunque los ms frecuentes son:leche de vaca, huevo de gallina (ms la clara), harinas (trigo.), fruta (melocotn, manzana, fresas, kiwi, pltano, castaa.), pescado, marisco, frutos secos (nueces, almendras.), legumbres (cacahuetes, soja.)

Alergenos de frmacos: la mayora son de bajo Pm y actan como haptenos, combinndose con las protenas del husped. Los F tpicos implicados en las reacciones de HS inmediata son los antibiticos y anestsicos, y las reacciones suelen ocurrir con dosis subteraputicas. Las reacciones graves de anafilaxia se asocian generalmente a administracin va parenteral.

Alergenos por va parenteral Insectos: ppalmente abejas, avispas, avispones, hormigas y mosquitos. Los

alergenos de las abejas melenferas parece que son los ms importantes clnicamente y no es rara la anafilaxia.

Frmacos.

Nomenclatura de los alergenos

Nomenclatura de los alergenosEl Allergen Nomenclature Subcommittee de laInternational Union of Immunological Societieselabor unas directrices para facilitar una denominacin del alergeno.Se forma tomando las tres primeras letras del gnero y la primera letra de la especie y combinndolas con un n arbigo que refleja, bien el orden en el que se aisl el alergeno o bien su importancia clnica.Los alergenos similares de distintas especies dentro de un gnero tendrn el mismo n de orden.

Ej: la denominacin del alergeno cistenproteasadel caro del polvo domstico Dermatophagoides pteronyssinus es: Der p 1

De la fuente al extracto

DeterminaciDeterminacin de la n de la alergenicidadalergenicidad

DeterminaciDeterminacin de la n de la alergenicidadalergenicidad

Pruebas de alergoabsorcinRadioinmunoelectroforesis

cruzadaInmunotransferencia

Pruebas de alergoabsorcin

El alergeno o el extracto alergnico se une a una matriz insoluble como el plstico, nitrato de celulosa, celulosa (papel) o bolas de agarosa y se incuba con el suero del paciente con sospecha de hipersensibilidad al alergeno. LosAc IgE se unen al alergeno unido a la matriz insoluble y posteriormente, son detectados mediante un Ac especfico para IgE. Este Ac se conjuga bien con un istopo, en una prueba de radioalergoabsorcin , o bien con una enzima (pej:peroxidasa de rbano) en una prueba de alergoabsorcinenzimtica y la cantidad de IgE unida se determina mediante sistemas de deteccin adecuados.

Respuesta

RAST

Inhibicin delRAST

Alergeno o suero de paciente alrgico

Respuesta

Alergeno

Es una variante de la alergoabsorcin: Se aaden concentraciones variables del alergeno a alcuotas del suero del paciente alrgico antes de la incubacin con el alergeno unido a la matriz, es decir, hay una incubacin previa en fase lquida. Cuanto ms potente sea el alergeno en fase lquida, quedar menos IgElibre para unirse al alergeno en fase slida.Los resultados se expresan en la cantidad de alergenonecesaria para inhibir en un 50% la unin mxima, siempre que se comparen extractos parecidos; cuanto menor sea la concentracin necesaria, ms potente serla fuente alergnica. La pendiente de la curva de inhibicin obtenida proporciona informacin respecto a la diversidad de alergenos que contiene un extracto. Se emplea regularmente en la estandarizacin dealergenos.

Ensayo de inhibicin:

Radioinmunoelectroforesis cruzadaCRIE

Radioinmunoelectroforesis cruzadaCRIE

En la CRIE, los extractos alergnicos se separan mediante electroforesis en gel de agarosa, al cabo de la cual el gel se rota 90 y se contina la electroforesis en una agarosa que contiene un antisuero contra el extracto alergnico completo (inmunoelectroforesis cruzada, CIE). Las protenas migran en el gel hasta que se encuentran con su anticuerpo IgG homlogo, el cual, debido a las condiciones elegidas, permanece estacionario.Una vez que ha interaccionado una cantidad suficiente de anticuerpo con su antgeno homlogo, se forman precipitados que se corresponden con en n de antgenos que contena la mezcla original. Para determinar cul de las protenas precipitadas es alergnica, la placa de CRIE sin teir se lava y se incuba con el suero problema. La IgE especfica del alergeno se une a los epitopos quese encuentran en el precipitado y se detecta empleando una anti-IgE marcada con isotopos.

Extacto alergnico

Separacin de protenas mediante SDS-PAGE

Transferencia de lasprotenas separadasa una membrana. Corte en tiras.

Gel de separacin

Incubacin de los sueros de los pacientes, lavado y

visualizacin de la unin con anti-IgE y autorradiografa

Inmunotranferencia

La inmunotransferencia se realiza despus de una electroforesis en gel de poliacrilamida con duodecilsulfato sdico. Los componentes proteicos individuales de un extracto alergnico se someten a electroforesis tras reduccin de los puentes disulfurointra e inter-catenarios. Las protenas se separan en orden decreciente segn su Pm. Las prots se transfierenposteriormente a una mbr de nitrato de celulosa y se incuban con el suero problema. La IgE unida a los alergenos individuales se visualiza empleando una anti-IgE marcada. La inmunotransferencia proporciona informacin sobre el n y el Pm de los alergenos de un extracto.

Aislamiento del alergeno

alergeno

Cs esplnicas(resistentes

a HAT)

FusinPEG

Cultivo enHAT

Mieloma nosecretor

(sensible a HAT)

Anlisis de pocillos positivosClones productores de Anticuerpos

Mapeo deeptopos

Cuantificacinde alergenos

Aislamientode alergenos

Tcnica delos Acmonoclonales

Cromatografa de penetrabilidad.

Cromatografa de intercambio inico.

Cromatografa de afinidad e hidrofobicidad.

Purificacin del alergeno

Estandarizacin de alergenos

Garantizar que la fuente alergnica proviene de las especies adecuadas.

Garantizar que la fuente alergnica no est contaminada con otras fuentes alergnicas.

Determinar que estn la mayora de los alergenos.

Medir y estandarizar el contenido alergnico total.

Determinar la concentracin de los principales alergenos seleccionados en los casos en que se puedan realizar los anlisis oportunos.

Garantizar que el extracto es biolgicamente activo.

Requisitos para la estandarizacin:

Alergenos principales

Alergenos procedentes de una nica fuente, que estimulan la produccin de IgE en ms del 50% de los pacientes alrgicos

a dicha fuente.

Por qu falla el diagnstico el diagnstico de alergia a un material biolgico en algunos pacientes en los que los sntomas y la historiaclnica nos hablan de tal afeccin?

Por qu la inmunoterapia con extractos alergnicos naturales funciona en unos pacientesy no en otros?

qu utilidad tiene conocer cuales son los aler-genos concretos de una fuente biolgica dada a los que un paciente determinado presenta hiper-sensibilidad?

Ventajas1) Cantidades limitadas.2) Bajo rendimiento del proceso de purificacin.3) Obtencin de la forma natural del alergeno, nunca de formas modificadas.4) Ausencia de estandarizacin.5) Concentraciones muy diversas de alergenos.6) Presencia significativa de productos indeseables.7) Desnaturalizacin, dao y degradacin proteica.

Inconvenientes

1) Mezcla completa de las isoformas.

Alergenos recombinantes

Ventajas

1) Disponibilidad de productos muy bien definidos.

2) Produccin ilimitada de la protena.

3) Estabilidad del producto.

4) Posibilidad de expresar alergenos modificados.

Inconvenientes

1) Plegamiento.

I- Co- sensibilizacin, frente a determinados componentes moleculares alergnicos

presentes en diferentes fuentes de manera separada e independiente.

II-Reactividad cruzada entre alergenos presentes en distintas fuentes

Diagnstico alergolgico con separacin de componentes:Discriminar entre co y cross- sensibilizacin

Alergenos Marcadores

Alergenos marcadores de Multisensibilizacin.Predicen sensibilizacin cruzada frente a dif.alergenosProfilina

Alergenos marcadores especficosAlergenos que se producen exclusivamente en ciertos tejidos

vegetales y algunas plantas

-Permiten seleccionar estrategias terapeticas ptimas

-Discriminar si un paciente es adecuado de recibir Inmunoterapia

-Disear tratamiento de Inmunoterapia a medida

-Disminuir el riesgo de sensibilizaciones de novo en la IT

Diagnstico alergolgico con separacin de componentes:Aportaciones a la Inmunoterapia

IgEIgE

La Inmunoglobulina E (IgE) fue descubierta en 1966 por los esposos Teruko y Kimisighe Ishizaka.

La respuesta alrgica se diferencia de otras rptas inmunitarias pq depende de la IgE y su receptor de alta afinidad FcRI, y tambin por la naturaleza de su ppal cl efectora, el mastocito tisular.

La cuantificacin de esta Ig en suero constituye una tca de rutina en el dx alergolgico.

La elevacin de IgE no es patognomnica de procesos alrgicos. Valores se modifican con la edad, sexo, antecedentes familiares

de patologa alrgica y el propio proceso alrgico.

sIgE

La IgE es una molcula glicoproteica compuesta en su mayor parte por protena y en una pequea proporcin por carbohidrato. Consta de 4 cadenas de aminocidos, dos cadenas ligeras (L) y dos cadenas pesadas (H) idnticas entre s.

La cadena L tiene un dominio terminal-N variable (VL) y un dominio constante (CL ) mientras que la cadena H tiene un dominio terminal-N variable (VH) y cuatro dominios constantes (CH). La clase de Ac viene determinada por la secuencia CH, que se designa como C para la IgE. Las cadenas ligeras, de acuerdo con su constitucin particular, pueden tener 2 variantes que se han llamado kappa (K) o Lambda (L) pero hay que aclarar que en una sola molcula de IgE siempre sern iguales las 2 cadenas ligeras, es decir, tendr las 2 del tipo K o las 2 del tipo L.

sIgE

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas estn formadas por segmentos de aproximadamente 110 aminocidos a los que se llaman dominios los mismos que estn unidos entre s de modocovalente por puentes o uniones disulfuro. En la IgE existen 2 dominios en cada cadena ligera y 5 dominios en cada cadena pesada. Al igual que como ocurre en los otros tipos deinmunoglobulinas, hay dominios llamados constantes (porque los aminocidos que los componen mantienen siempre la misma secuencia) y dominios variables (porque la secuencia de sus aminocidos varia de una molcula a otra) que son los que por su variabilidad de secuencia determinan la especificidad para el antgeno.

sIgE

Las funciones ms importantes de la IgE se dan en sus extremos: por el lado de sus dominios variables se une especficamente al Agmientras que por el otro extremo, a travs del CH4 tiene capacidad para unirse a la membrana de la clula cebada, esto gracias a un receptor presente en la superficie de esta clula que tiene gran afinidad para la IgE, receptor que es conocido como Receptor de alta afinidad para el Fc de la IgE (FceRI). La IgE tambin puede unirse a eosinfilos y plaquetas a travs de otros receptores expresados en la superficie de estas clulas y que en este caso se conocen como Receptores de baja afinidad (FceRII).

sIgE

Importancia de la sIgE en el dx de alergia

Los individuos atpicos se pueden dividir en dos grupos:

Pacientes sintomticos Pacientes asintomticos.

La sensibilizacin a alergenos puede preceder a los sntomas y es un fuerte factor de riesgo para la enfermedad alrgica.

La sensibilizacin a alergenos es un factor de riesgo para la persistencia de los sntomas.

Valores normales de IgE

test in vitro sIgE Apoyo diagnstico en hipersensibilidad IgE mediada,

similar a las PC No influencia terapia farmacolgica. No influencia enfermedades cutneas Independiente del alergeno testado Elevado nmero de alergenos a testar En general ms especfica que las PC y menos sensible Posibilidad de evaluar multialergenos Ausencia de reacciones adversas No exige personal con formacin especfica Menos impacto educativo en el paciente que las PC

Complejidad alergnica

Extracto alergnico

Obtencin extracto

Variables inmunoensayos

Caractersticas ptimas de un ensayo de IgEespecfica

Variables a evaluar en la determinacin de IgE Especfica

Son realmente negativos los niveles bajos de sIgE.

Boyano Martinez et al. Validity of specific IgE antibodies in children with egg allergy. Clin Exp Allergy 2001;31: 1464-9

Sasai K et al. Early detection of specific IgE antibody against house dust mite in children at risk of allergic disease. J pediatr 1996; 128:834-40.

EL RETOAyudar a establecer cuando un nivel de IgE es lo suficientemente

bajo para realizar de un modo seguro el test de provocacin

The relationship of allergen-specific IgE levels and oral food challenge outcomePerry T, Matsui E, Conover- Walker M, Wood R: JACI;144-149;2004.04.09

El laboratorio en el Dx de la alergia alimentaria

GRACIAS