ก

รายงานการวจย

ชอเรอง พฒนาการของคพภะปลาดกล าพน (Clarias nieuhofii) โดยใชเทคนคเนอเยอวทยา

Development of Nieuhofii Catfish (Clarias nieuhofii) Embryos using Histological Techniques

ชอผวจย วนวภา หนมา

รายงานวจยฉบบนไดรบเงนอดหนนการวจยจากงบประมาณกองทนวจย

มหาวทยาลยราชภฏสงขลา พ.ศ. 2557

ก

ชองานวจย พฒนาการของคพภะปลาดกล าพน (Clarias nieuhofii) โดยใชเทคนคเนอเยอวทยา ผวจย นางสาววนวภา หนมา คณะ วทยาศาสตรและเทคโนโลย ป 2560

บทคดยอ

จากการศกษาคพภะของปลาดกล าพนโดยเมอไขไดรบการผสมจากเชอเพศผ ปรบอณหภมใหมคาในชวง 26-28 องศาเซลเซยส สมตวอยางไขปลาดกล าพนจากบอฟกไขตงแตปฏสนธจนถงหลงฟกออกจากไข จ านวน 40 ตวอยาง/ครง เพอตรวจสอบพฒนาของเนอเยอตามระยะเวลาตางๆ โดยบนทกภาพดวยกลองจลทรรศนถายภาพ พบวาลกษณะไขเปนชนดไขจมแบบตด (Adhesive dermersal egg) มการแบงเซลลแบบไมโทซสเพอเพมจ านวนเซลลแบบ Meroblastic Cleavage และใชเวลาตงแตปฏสนธจนฟกเปนตวประมาณ 36 ชวโมง โดยมการเจรญและพฒนาเปนขนตางๆ ดงน เขาสระยะ Cleavage เมอเวลา 5 นาท - 8 ชวโมง เมอเวลาผานไป 7 - 9 ชวโมง พฒนาเขาสระยะ Morular เมอเวลาผานไป 10 - 11 ชวโมง พฒนาเขาสระยะ Blastula เมอเวลาผานไป 15-16 ชวโมง พฒนาเขาสระยะ Gastrula Stage เมอเวลาผานไป 17 - 20 ชวโมง เขาสระยะล าตวเรมเกดปลอง (Body Segment Appearance Stage) เมอเวลาผานไป 36 ชวโมง ลกปลาฟกออกจากไข และหลงจากฟกออกจากไข มการเปลยนแปลงของลกปลา ดงน หลงฟก 6 ชวโมง ปากยงไมเปดมเนอเยอบางๆ เชอมตดกน พบเนอเยอสมองเจรญอยดานบนสวนหวแยกออกเปน 2 สวน เมอเวลาผานไปหลงจากฟก 12 ชวโมง พบ Notochord และมดกลามเนอจ านวนหลายมด เมอเวลาผานไปหลงจากฟก 24 ชวโมง ปากเรมเปด ทอทางเดนอาหารเปนทอตรง ไมแบงเปนสวน ๆ พบโครงสรางของเหงอก เมอเวลาผานไปหลงจากฟก 3 วน เหงอกมการแตกแขนงของกงเหงอก ทางเดนอาหารพฒนาแบงเปนอวยวะในระบบทางเดนอาหาร มการพฒนาของเนอเยอไต และเมอเวลาผานไปหลงจากฟก7 และ 15 วน มพฒนาการของอวยวะสมบรณ ถงไขแดงสลายหลงจากฟก 7 วน

ข

กตตกรรมประกาศ งานวจยนไดรบทนสนบสนนการวจยจาก งบประมาณกองทนวจยมหาวทยาลยราชภฏสงขลา ประจ าป พ.ศ. 2557

นางสาววนวภา หนมา

คณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มถนายน 2559

ค

สารบญ

หนา บทคดยอ ก กตตกรรมประกาศ ข สารบญ ค สารบญภาพ ง บทท 1 บทน า 1 ความส าคญและทมาของปญหา 1 วตถประสงคของการวจย 1 ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 2 ขอบเขตการวจย 2 นยามศพทเฉพาะ 2

บทท 2 ทฤษฎ 3ปลาดกล าพน 3เทคนคทางเนอเยอวทยากบการศกษาคพภะ 3

บทท 3 การทดลอง 7 กลมตวอยาง 7 วสดอปกรณ 7 สารเคม 7

การด าเนนการวจย 7

บทท 4 ผลการทดลองและวจารณผล 11 ผลการศกษาพฒนาการทางเนอเยอของคพภะปลาดกล าพน 11 วจารณผล 17

บทท 5 สรปและขอเสนอแนะ 21 เอกสารอางอง 22 ภาคผนวก 26 ประวตผวจย 27

ง

สารบญภาพ ภาพท หนา

1 พฒนาการของคพภะปลาดกล าพนตงแตปฏสนธจนฟกออกจากไข 12 2 ลกปลาหลงฟก 6 ชวโมง 13 3 ลกปลาหลงฟก 12 ชวโมง 14 4 ลกปลาหลงฟก 18 ชวโมง 14 5 ลกปลาหลงฟก 24 ชวโมง 15 6 ลกปลาหลงฟก 3 วน 15 7 ลกปลาหลงฟก 7 วน 16 8 ลกปลาหลงฟก 15 วน 17

1

บทท 1 บทน า

ความส าคญและทมาของปญหา ปลาดกล าพน (Clarias nieuhofii) เปนปลาน าจดชนดหนงทอาศยเฉพาะถน นยมน ามา

บรโภคเนองจากมรสชาตดกวาปลาดกทวไปและจากการส ารวจพบวาปลาดกล าพนในธรรมชาตมแนวโนมลดลง (ศราวธ เจะโสะ และคณะ, 2538) จงมความพยายามเพาะขยายพนธปลาดกล าพนเพอการอนรกษพนธปลาและศกษาความเปนไปไดในการเพาะเลยงเชงเศรษฐกจ แตเนองจากเปนปลาชนดใหมทสามารถเพาะขยายพนธไดจงขาดขอมลทางชววทยาทจ าเปนตอการเพาะเลยงและขยายพนธซงพบวามการวจยในดานความตองการสารอาหารของปลา ดานเทคนคการเพาะฟก และการอนบาลลกปลา เชน การศกษาผลของอาหารรปแบบตางๆ ตอการเจรญเตบโต และการรอดตายของปลาดกล าพนวยออน (Kiriratnikom et al. Retrieved January 30, 2014, from http://www. scisoc.or.th) ระดบของโปรตนในอาหารทมผลตอปลาดกล าพน (Chessadapa et al., 2009) ผลของระดบความหนาแนนตอการเจรญเตบโต อตราการเปลยนอาหารเปนเนอและการรอดตายของ ปลาดกล าพนระยะปลานวในบอคอนกรต (พนธสทธ โชคสวสดกร และคณะ, สบคนเมอ 30 มกราคม 2557, จาก http://www.bio.sci.tsu.ac.th) เปนตน ส าหรบขอมลทางดานพฒนาการทางเนอเยอของคพภะเปนขอมลส าคญอกดานทจะชวยใหเกดการพฒนาวางแผนเทคนคการเพาะเลยงปลาดกล าพนในดานการอนบาลลกปลาใหประสบความส าเรจมากขนทงเพอการอนรกษพนธ และน าไปสการเพาะเลยงปลาดกล าพนในเชงเศรษฐกจตอไป (Ortiz-Delgado et al., 2003)

การเพาะเลยงสตวน าวยออนใหประสบความส าเรจนนตองอาศยขอมลหลายๆ ดาน มาประกอบกน เนองจากพฒนาการทางเนอเยอของสตวน าแตละชนดไมเหมอนกน ท าใหชวงเวลาในการกนอาหารจากภายนอกครงแรก ประเภทของอาหาร อตราการเจรญเตบโต ความตองการดานสภาพแวดลอม แตกตางกนไปตามชนดของสตวน าวยออน ซงการศกษาดานพฒนาการทางเนอเยอของคพภะ จะชวยใหสามารถวางแผนการเพาะเลยงสตวน าไดประสบความส าเรจมากขน (Ortiz-Delgado et al. (2003); Saelee et al. (2011); Rangsin et al., (2012); เบญจศภลกษณ อดรโพธ (2545); ปรญญา สทธนนท และคณะ (2012)) ดงนนการศกษาพฒนาการทางเนอเยอของคพภะ ปลาดกล าพนโดยใชองคความรดานเนอเยอวทยาจงเปนขอมลอกทางหนงทมประโยชนตอการวางแผนการเพาะเลยงปลาดกล าพน

วตถประสงคของการวจย เพอศกษาพฒนาการของคพภะปลาดกล าพนตงแตปฏสนธจนถงหลงฟกออกจากไขเปน

เวลา 15 วน โดยเทคนคทางเนอเยอวทยา

2

ประโยชนทคาดวาจะไดรบ 1. ทราบถงพฒนาการของคพภะของปลาดกล าพนตงแตปฏสนธจนถงหลงฟกออกจากไขเปนเวลา 15 วน เพอเปนองคความรดานพฒนาการของอวยวะสตววยออน

2. เปนขอมลสวนหนงทส าคญในการพฒนาเทคนคการเพาะเลยงปลาดกล าพน เพอการอนรกษพนธ และน าไปสการเพาะเลยงในเชงเศรษฐกจตอไป

3. สามารถน าไปบรณาการในการเรยนการสอนในวชาชววทยาพนฐาน และเทคนคทางชววทยาได ขอบเขตการวจย

เปนการวจยเชงทดลอง ศกษาพฒนาการทางเนอเยอของคพภะปลาดกล าพน โดยสมตวอยางไขปลาดกล าพนจากบอฟกไขตงแตปฏสนธจนถงหลงฟกออกจากไข เรมตงแต 0-60 นาท เกบทก 5 นาท ชวโมงท 1-3 เกบทก 30 นาท ชวโมงท 3-40 เกบทก 1 ชวโมง และหลงจากลกปลาฟกออกจากไขอาย 15 วน จ านวน 40 ตวอยาง/ครง เพอตรวจสอบพฒนาของเนอเยอตามระยะเวลาตางๆ โดยบนทกภาพดวยกลองจลทรรศนถายภาพ และควบคมอณหภมโดยใชเครองท าความรอนขนาด 100w เพอปรบอณหภมใหมคาในชวง 26-28 oซ. นยามศพทเฉพาะ

พฒนาการของคพภะของปลา หมายถง การพฒนาเปลยนระยะของตวออนตงแตปฏสนธจนถงหลงฟกออกจากไข ศกษาพฒนาการของอวยวะ และระยะเวลาทลกปลาฟกเปนตว

เนอเยอวทยา หมายถง ศกษาเกยวกบจลกายวภาคศาสตรของเซลลและเนอเยอ โดยใชเครองตดชนเนอ (microtome) ตดเนอเยอใหบางและยอมส (stained) เพอเพมความสามารถในการแยกแยะความแตกตางของเนอเยอ แลวน าไปศกษาดวยกลองจลทรรศนแบบใชแสง

3

บทท 2 ทฤษฎ

ปลาดกล าพน ลกษณะและทอยอาศย ปลาดกล าพนเปนปลาน าจดไมมเกลด มครบหลง ครบหาง และครบกนเชอมตอกน จดอย

ในกลมปลากนเนอ ล าตวคอนขางยาวและมจดขาวเรยงขวางกบล าตว ลกษณะสของล าตวจะเปลยนไปตามอาย ขนาด และสภาพแวดลอมมถนทอยจ ากดเฉพาะในเขตปาพรทรกทบ มกระแสน าไหลเออย ๆ หรอเปนแองน าคอนขางนงมตนไมปกคลม อยในสภาพดนหรอน าทเปนกรด มซากวชพชหรอใบไมทบถม มปรมาณออกซเจนละลายในน าต า (ศราวธ เจะโสะ และคณะ, 2538)

อนกรมวธาน Kingdom Animalia

Phylum Chordata Subphylum Vertebrata

Class Actinopterygii Order Siluriformes

Family Clariidae Genus Clarias Species Clarias nieuhofii

(Valenciennes. Retrieved June 6, 2013, from http://www.fishbase.org) จากการทปลาดกล าพนเปนปลาทอาศยเฉพาะถนในเขตปาพร อกทงเปนปลาทนยมบรโภค

เนองจากปญหาการบกรกพนท การดกจบสตวน า สงผลใหปจจบนพบปลาดกล าพนจ านวนนอยในธรรมชาต ซงจดอยในกลมเสยงตอการสญพนธ ดงนนการศกษาขอมลหลายๆ ดาน จะชวยใหการวางแผนเพาะเลยงปลาดกล าพนมประสทธภาพมากขน โดยการศกษาพฒนาการทางเนอเยอของคพภะปลาดกล าพน จะชวยใหการเพาะขยายพนธปลาดกล าพนมความประสบผลส าเรจมากยงขน (Ortiz-Delgado et al. (2003); Saelee et al. (2011); เบญจศภลกษณ อดรโพธ (2545))

เทคนคทางเนอเยอวทยากบการศกษาคพภะ การศกษาทางเนอเยอวทยาจะใชอธบายการท างานของระบบตางๆ ของคพภะได เนองจาก

ชวยใหทราบถงล าดบการเกดของระบบอวยวะในชวงเวลาตางๆ ได สนตย โรจนพทยากล และคณะ (2540) ศกษาชววทยาและพฒนาการของลกปลาเหดโคน

วยออนระยะแรกเพอเปนแนวทางในการอนบาลลกปลาใหมอตรารอดสงขนโดยสมตวอยางลกปลาเหดโคนทเพงฟกทก 3 ชวโมง จนครบ 96 ชวโมงจากการศกษาพบวา ลกปลาเหดโคนฟกเปนตวใน

4

เวลา 13-15 ชวโมงทอณหภม 27-29 Oซ. ลกปลาทเพงฟกมความยาว 1.38 ± 0.07 มม. มปรมาตรถงไขแดง (yolk sac) 0.132 ลบ.มม. และหยดน ามน (oil globule) มขนาดเสนผาศนยกลาง 0.15 ± 0.005 มม. ลกปลามทวารหนก ขากรรไกร ครบอก และนยนตาสด าสนทปรากฎใหเหนชดเจนเมออาย 3, 18, 24 และ 30 ชวโมงตามล าดบ ลกปลาเรมเปดปากเมออาย 36 ชวโมงโดยมขนาดของปาก (mouth height) 84.79 ± 14.74 ไมครอน ถงไขแดงและหยดน ามนยบสมบรณเมอลกปลาอาย 63 และ 69 ชวโมง ตามล าดบ เรมพบโรตเฟอรในกระเพาะอาหารของลกปลาหลงปากเปด 12 ชวโมง และกระเพาะลม (swim bladder) เรมพองตวในเวลากลางคนเมอลกปลาอาย 57 ชวโมงลกปลาทไมใหอาหารจะตายหมดภายในเวลา 81 ชวโมง สวนลกปลาทใหโรตเฟอรเปนอาหาร มอตรารอดตายต า

เบญจศภลกษณ อดรโพธ (2545) ศกษาพฒนาการทางเนอเยอวทยาและฮสโตเคมของระบบยอยอาหารในปลาบทรายระยะวยออนอาย 0-45 วน พบวาทางเดนอาหารมลกษณะเปนทอตรง ถงไขแดงขนาดใหญอยใตทอทางเดนอาหารและจะยบหมดในวนท 5 หลงจากฟก เซลลเยอบทางเดนอาหารเปนแบบางเรยงตวหลายชน ปากและทวารหนกเปดเมอปลามอาย 2 วน พบ eosinophilic granule ทล าไสสวนทายซงแสดงถงการเกดการดดซมสารอาหารในล าไส และพบการท างานของเอนไซม alkaline phosphatase ในทางเดนอาหาร ตงแตปลาเรมออกจากไขและมปรมาณมากขนเมอปลามการเจรญเตบโตมากขน พบ acid mucosubstance ท goblet cell ของหลอดอาหารในวนท 2 และล าไสวนท 15 โดยระบบทางเดนอาหารจะสมบรณเมอปลาอาย 30 วน ซงขอมลเหลานสามารถน าไปใชเพมประสทธภาพในการเพาะเลยง และอนบาลลกปลาบใหดขน

อาคม สงหบญ และคณะ (2546) ศกษาพฒนาการของคพภะและลกปลาวยออนของปลาเกาเสอพบวาไขปลาเกาเสอเปนไขลอย ขนาดเสนผานศนยกลาง 863±27.69 ไมครอน ไขทรบการผสมเรมมการแบงเซลล (cleavage stage) เมอเวลาผานไป 35 นาท พฒนาเขาสระยะมอรลา (morula) เมอเวลา 2 ชวโมง 20 นาท ระยะบลาสตลา (blastula) เมอเวลา 3 ชวโมง 5 นาท ระยะแกสตลา (gastrula) เมอเวลา 5 ชวโมง 35 นาท ระยะบลาสโตพอรปด (closing of blastopore) เมอเวลา 9 ชวโมง 25 นาท และฟกออกเปนตวเมอเวลา 19 ชวโมง 5 นาท ลกปลาแรกฟกมความยาว 1.69±0.08 มลลเมตร ไขแดงมปรมาตร 1.31±0.27 ลกบาศกมลลเมตร และหยดน ามนขนาดเสนผานศนยกลาง 0.19±0.01 มลลเมตร เมออาย 24 ชวโมง ทอทางเดนอาหารเจรญมากขน เรมมองเหนชองวางภายในทอทางเดนอาหาร ปากเรมเปดเมออาย 48 ชวโมง ทอทางเดนอาหารแบงเปน 3 สวนชดเจน คอ ทางเดนอาหารตอนตน หรอล าคอ ทางเดนอาหารตอนกลางหรอกระเพาะอาหาร และทางเดนอาหารตอนปลายหรอล าไส ในแตละสวนจะมผนงทหนาขนเรมพบอาหารในกระเพาะเมออาย 66 ชวโมง ไขแดงและหยดน ามนยบสมบรณเมออาย 72 และ 90 ชวโมง ตามล าดบ ลกปลาเรมมการเปลยนแปลงรปรางเมออาย 7 วน และพฒนาเขาสระยะปลาวยรนเมออาย 39 วน

5

Micale et al. (2006) ศกษาระบบทางเดนอาหารของปลา Common pandora ตงแต 0-50 วนหลงฟก พบวาปลาจะเรมกนอาหารในวนท 3 ซงปลาจะไดรบอาหารชนดแรกคอ โรตเฟอร ส าหรบระบบทางเดนอาหารแบงเปน 4 สวน คอ คอหอย หลอดอาหาร กระเพาะอาหาร และล าไสเลก หลงจากปลาไดรบอาหารภายนอกรางกายจะพบวา เนอเยอบผวของล าไสสวนตนจะมหยดไขมนและพบ supranuclearninhydrin-Schiff ซงแสดงใหเหนถงการดดซมโปรตนในเยอบผวล าไสสวนทาย สวนของล าไสมการขดพบในวนท 4 และพบเยอเมอกตลอดทางเดนอาหารในวนท 10 พบ gastric glands ปรากฏในวนท 28 ซงสามารถใชบงชถงการเปลยนจากระยะตวออนเขาสระยะ juvenile

จราพร โรจนทนกร และจรยา เทพณรงค (2549) ศกษาทางเนอเยอวทยาของการพฒนาของโอโอไซดปลากลม catfish 2 ชนด คอ ปลาดกรสเซย (Clarias gariepinus) และปลาสวาย (Pangasius hypophthalmus) พบวารงไขปลาแบงระยะโอโอไซตไดเปน 6 ระยะ โดยโอโอไซตระยะ primary growth phase (ระยะท 1 และ 2) มสภาพไมคอยชดเจนและพบไดนอยมาก และทพบคอนขางนอยรองลงมาคอระยะท 3 early-vitellogenesis (central germinal vesicle, CGV) ขนาดของนวเคลยสมขนาดใหญเมอเทยบกบขนาดของเซลลไขและอยตรงกลางเซลล มการเพมจ านวนของ yolk granules ตรงขอบเซลลและ cortical alveoli บรเวณรอบนวเคลยส ระยะท 4 vitellogenic stage (migrating germinal vesicle, MGV) จะมลกษณะของไซโตพลาสซม (cytoplasm) เตมไปดวยโยค (yolk) และหยดไขมนทขอบเซลล ครอบคลมทงโอโอไซต นวเคลยสเรมเคลอนตวไปทขว animal pole เนองจากมองเหนไมชดเจน ระยะท 5 peripheral germinal vesicle (PGV) ไมปรากฏสวนของไซโตพลาสซม สวนโยคเตมเซลล ขอบเซลลบาง และนวเคลยสซงอยทขอบเซลลเหนไมชดเจน แตเหนการแบงชนของ zonaradiata และเนอเยอชน follicle ระยะท 6 maturation (germinal vesicle breakdown, GVBD) นวเคลยสชดขอบเซลล และ yolk granule เตมเซลล ขอบเซลลของโอโอไซตบางและแยกชนจาก follicle อยางชดเจน

จรยา เทพณรงค และจราพร โรจนทนกร (2550) ศกษาการพฒนาโอโอไซทปลาสวายดวยวธการ In vitro maturation (IVM) โดยการใชอาหารเลยงเซลล 3 ชนด ไดแก Leibovitz’s L15, Dulbecco‘s Modified Eagle Medium และ M-199 medium ทอณหภมบม 23, 25 และ 28OC และการใชฮอรโมนทเกยวของกบการพฒนาของโอโอไซท 4 ชนด ไดแก human chorionic gonadotro-pin (HCG), Luteinizing hormone (LH), 17α, 20β-dihydroxy-4-pregnen-3-one (DHP) และ Estradiol-17β ทความเขมขนตางๆ เพอศกษาประสทธผลของสารเหลาน และปจจยทมผลตอการพฒนาโอโอโซทในหองทดลอง เพอใชเปนประโยชนตอการเลยงโอโอไซทของปลากลม Pangasianodon ใหสกในหองทดลอง ซงจะประยกตใชกบปลาชนดทใกลจะสญพนธ พบวาเลยง โอโอไซทดวย M-199 medium ทอณหภม25 OC ท าใหสภาพเซลลและอตรารอดของโอโอไซทดทสด จากการใชฮอรโมน พบวา Luteinizing hormone (LH) ทความเขมขน 11 และ 33 ng/ml มการ

6

พฒนาของโอโอไซทจากระยะ germinal vesicle migration (GVM) ไปเปน germinal vesicle beak down (GVBD)

อธยา อรรถอนทรย และคณะ (2552) ศกษาการเพาะพนธและคพภะวทยาของปลาหมคอก (Yasuhikotakia morleti) โดยการกระตนดวยฮอรโมนสงเคราะหและคดเลอกแมปลาแบบสมฉด Buserelin acetate ในอตราความเขมขน 10, 20 และ 30 μg/kg รวมกบ Domperidoneในอตรา 10 mg/kg ทกชดการทดลอง ส าหรบปลาเพศผฉดในอตรา 10 μg/kg รวมกบ Domperidoneในอตรา 10 mg/kg พบวาแมปลาทฉดฮอรโมนสงเคราะหในระดบ 20 μg/kg มการตกไข ลกษณะไขปลาหมคอกมลกษณะกลม สเทาอมเขยว เปนแบบครงจมครงลอย มพฒนาการของคพภะจนกระทงฟกออกเปนตวใชเวลาประมาณ 13 ชวโมง ทอณหภม 26 องศาเซลเซยส โดยมอตราฟกเฉลย 17 เปอรเซนต ลกปลาหมคอกทฟก ออกเปนตวมขนาดความยาว 2.9 มลลเมตร และถงอาหารยบหมดภายใน 3 วน

ปรญญา สทธนนท และคณะ (2012) ศกษาพฒนาการของปลากะรงจดฟาว ยออน (Plectropomus leopardus) อาย 1-50 วน พบวา ลกปลาอาย 1 วน หวตดกบถงอาหารส ารอง ไมปรากฏตา ไมมการพฒนาของปาก เมอลกปลาอาย 2 วน สวนหวแยกออกจากถงอาหารส ารอง ขนาดของถงอาหารส ารองเลกลง ปากยงไมเปด ลกตาใสไมมจดสด าสะสม เมอลกปลาอาย 3 วน ปากเรมเปดมขนาดกวาง 370.47±17.38 ไมครอน ถงอาหารส ารองยบหมดเจรญและพฒนาไปเปนบางสวนของกระเพาะอาหาร ชองเปดของทวารหนกเหนไดชดเจน ลกตามจดสด ามาสะสมจนมองเหนไดชดเจน เมอลกปลาอาย 7 วน ครบหลงมการพฒนากานครบแขง (dorsal spine) อนแรก และครบอกทงสองขางมกานครบแขง (pelvic spine) อนแรกยนยาวออกมา เมอลกปลาอาย 12-24 วน กานครบแขงอนแรกของครบหลงและครบอกทงคยนยาวมากขน เมอลกปลาอาย 25-30 วน กานครบแขงอนแรกของครบหลงและครบอกทงคเรมหดสนลง เมออาย 35 วน ครบหลงพฒนาจนเกอบสมบรณ ครบห ครบอก ครบกน และครบหางพฒนาสมบรณ และเมอลกปลาอาย 50 วน มการเปลยนแปลงรปรางสมบรณเปนลกปลาขนาดเลกทมรปรางลกษณะภายนอกเหมอนปลาโตเตมวย ลกปลาอายระหวาง 1-35 วน มความกวางปากสมพนธกบความยาวล าตว คอ ความกวางปาก (ไมโครเมตร) เทากบ (-27.86 + 201.48) x ความยาวล าตว (มลลเมตร)

7

บทท 3

วธด าเนนการวจย กลมตวอยาง ไขปลาดกล าพนตงแตปฏสนธจนถงหลงฟกออกจากไขเปนเวลา 15 วนของไขปลาดกล า

พนจากบอฟกไขเพอน ามาตรวจสอบพฒนาการของเนอเยอ

วสดและอปกรณ ใบมด (microtome knife) กระจกปดสไลดขนาด 22x40 มม. (cover slip) ขวดใสตวอยาง (bottom) สไลดแกวขนาด 25x75x2 มม. (slide) เครองอนสไลด (slide warmer) กลองจลทรรศนแบบใชแสง (light microscope) จารยอมส (staining jar) กลองใสสไลด (slides box) ตอบ (oven) เครองตดชนเนอ (rotary microtome) บกเกอร (beaker) อางลอยเนอเยอ (water bath)

สารเคม Absolute ethyl alcohol Acetone Bouin's Fluid Haematoxylin Crystal Sodium Iodate PotasiumAluminium Sulfate, Alum Citric Acid Chloral Hydrate Eosin-Y Acetic acid Isopropyl Alcohol Xylene Paraplast Permount การด าเนนการวจย การเพาะพนธปลาดกล าพน คดเลอกพอ-แมพนธปลาดกล าพน ทมอายระหวาง 2-4 ป ซงเลยงไวในอาคารปฏบตการ

เพาะเลยงสตวน า มหาวทยาลยทกษณ วทยาเขตพทลง น ามาตรวจสอบสขภาพ และความสมบรณเพศ แลวเพาะขยายพนธดวยการผสมเทยม โดยการฉดฮอรโมนสงเคราะห LH-RH รวมกบ domperidone(พรพนม พรหมแกว, 2538; ศราวธ เจะโสะ และคณะ, 2538) ภายหลงการฉดฮอรโมนเขมท 2 เปนเวลา 14 ชวโมง จงรวบรวมไขจากแมปลา และน าเชอจากปลาเพศผ ผสมพนธ

8

เชนเดยวกบปลาดกชนดอน จากนนฟกไขปลาดกล าพนทปฏสนธแลวในบอฟกไขทมการเปลยนถายน าตอเนองเพอลดการสะสมของของเสยจากการสลายตวของไขปลาทไมปฏสนธ

การศกษาพฒนาการทางเนอเยอของคพภะปลาดกล าพน สมตวอยางไขปลาดกล าพนจากบอฟกไขตงแตปฏสนธจนถงหลงฟกออกจากไขโดยเรม

ตงแต 0-60 นาท เกบทก 5 นาท ชวโมงท 1-3 เกบทก 30 นาท ชวโมงท 3-40 เกบทก 1 ชวโมง และหลงจากลกปลาฟกออกจากไขเกบทก 6 ชวโมงเปนเวลา 24 ชวโมง จากนนเกบในวนท 3 7 และ15 วนหลงฟกจ านวน 40 ตวอยาง/ครง เพอตรวจสอบพฒนาของเนอเยอตามระยะเวลาตางๆ โดยบนทกภาพดวยกลองจลทรรศนถายภาพ และควบคมอณหภมโดยใชเครองท าความรอนขนาด 100w เพอปรบอณหภมใหมคาในชวง 26-28 oซ. รายงานตามระยะทมการเปลยนแปลงของเนอเยอ

การเตรยมตวอยางเนอเยอ เกบตวอยางไขปลาดกล าพนเพอศกษาทางเนอเยอวทยา โดยน าตวอยางมาเกบรกษาสภาพ

ในน ายาบแอง (Bouin's Fluid) เปนเวลา 3 วน แลวจงเปลยนจากน ายาบแองเปนแอธลแอลกอฮอล ความเขมขน 50 และ 70 เปอรเซนต ตามล าดบกอนน ามาผานขนตอนการเตรยมเนอเยอ (Humason, 1967)

ขนตอนการดงน าออก (Dehydration) และการฝงเนอเยอ (Embedding) 1. ตดแตงตวอยาง (Trim) ทผานการดองแลวใหมขนาดพอเหมาะเพอสะดวกตอ

การฝง และน าไปตด (Section) 2. น าตวอยางไปผานขนตอนการดงน าออกจากตวอยาง ซงมขนตอนดงน ขนตอนท สารละลาย เวลา (ชวโมง) 1 แอลกอฮอล 50 เปอรเซนต 1 2 แอลกอฮอล 70 เปอรเซนต 1 3 แอลกอฮอล 70 เปอรเซนต 1 4 แอลกอฮอล 95 เปอรเซนต 1 5 แอลกอฮอล 95 เปอรเซนต 1 6 แอบโซลท แอลกอฮอล (Absolute Alcohol) 1 7 ไอโซโพรพล แอลกอฮอล (Isopropyl Alcohol) 1 8 ไอโซโพรพล แอลกอฮอล 1 9 ไซลน (Xylene) 1 10 ไซลน 1 11 พาราพลาสท (Paraplast) 1 12 พาราพลาสท 1

9

3. น าตวอยางทผานขนตอนท 2 ไปฝงดวยพาราพลาสท จากนนน าบลอค (Block) ไปแชตเยนเพองายตอการน าไปตดตอไป

4. ตดแตงตวอยางทมอยในบลอคใหมขนาดพอดกบขนาดสไลด และแผนปดสไลด จากนนน าไปตดดวยเครองตดเนอเยอ ใหมความหนาประมาณ 5-7 ไมครอน น าไปลอยในน าอนทอณหภม 45-50 องศาเซลเซยส

5. ใชแผนสไลดชอนตวอยาง แลวน าไปอบทอณหภม 45 องศาเซลเซยส เพอใหตวอยางยดตดแผนสไลดไดด

6. น าสไลดไปผานขบวนการยอมสฮมาทอกซลนและอโอซน โดยมขนตอนดงน ขนตอนท สารละลาย เวลา (นาท) 1 ไซลน 2 2 ไซลน 2 3 ไอโซโพรพล แอลกอฮอล 1 4 ไอโซโพรพล แอลกอฮอล 1 5 แอลกอฮอล 95 เปอรเซนต 1 6 แอลกอฮอล 70 เปอรเซนต 1 7 แอลกอฮอล 70 เปอรเซนต 1 8 แอลกอฮอล 50 เปอรเซนต 1 9 แอลกอฮอล 50 เปอรเซนต 1 10 น ากลน 1 11 ฮมาทอกซลน 6 12 น าประปา 1 13 แอลกอฮอล 50 เปอรเซนต 1 14 อโอซน 2 15 แอลกอฮอล 70 เปอรเซนต 2 16 แอลกอฮอล 70 เปอรเซนต 2 17 แอบโซลท แอลกอฮอล 2 18 ไอโซโพรพล แอลกอฮอล 2 19 ไอโซโพรพล แอลกอฮอล 2 20 ไซลน 2 21 ไซลน 2

7. ปดผนกเปนสไลดถาวรโดยใชน ายาเปอรเมาท (Permount) หยดลงบนแผนเนอเยอ แลวปดทบดวยกระจกปดสไลด จากนนจงน าตวอยางไปศกษาพยาธสภาพดวยกลองจลทรรศน

10

บนทกภาพพฒนาการทางเนอเยอของระบบอวยวะของคพภะปลาดกล าพน รายงานผลการศกษาโดยแสดงถงพฒนาการของเนอเยอตามระยะเวลาการพฒนาของไข และสรปล าดบขนการสรางอวยวะตางๆ ของปลาดกล าพน

11

บทท 4 ผลการทดลองและวจารณผล

ผลการศกษาพฒนาการทางเนอเยอของคพภะปลาดกล าพน 1. พฒนาการของคพภะ (Embryonic Development)

เมอไดรบการผสมจากเชอเพศผไขปลาดกล าพนเขาสระยะ Zygote Period ลกษณะกลม มชน Perivitelline Space หมไขไว ภายในม Yolk Granules ตดสแดง กระจายทวไซโทพลาซม (เรมตน) จากนนมการเจรญและพฒนาเปนขนตางๆ (ภาพท 1) ดงน

เวลา 5 นาท - 8 ชวโมง Cleavage Stage ระยะทไซโกต แบงเซลลแบบไมโทซสเพอเพมจ านวนเซลล เปนการแบงแบบ Meroblastic Cleavage โดยไซโกตจะแบงเซลลในดาน Animal Pole ซงเซลลใหมทแบงไดจะมขนาดเลกลงครงหนงจากเซลลเดม สวนดาน Vegetal Pole มไขแดงสะสมอย

เวลา 7 - 9 ชวโมง เรมเขาส Morular Stage เซลลเรมแบงมากขนเปนวงมขนาดเลกมากจนเหนเปนเนอเดยวกน ซอนกนอยอยางหนาแนน มลกษณะเปนหมวกครอบเหนอไขแดง

เวลา 10 - 11 ชวโมง Blastula Stage มการจดเรยงเซลลใหม เรยกวา Blastoderm และเกดชองกลวงตรงกลาง เรยกวา Blastocoel

เวลา 15-16 ชวโมง Gastrula Stage กลมเซลล Blastoderm เรมหนาขน เจรญคลมไขแดงเกดเปนวงแหวน เรยกวา Germ Ring และมการมวนตวของเซลลผานชองวางภายใน (Gastrocoel) ซงจะพฒนาเปนทอทางเดนอาหาร เมอ Blastoderm คลมไขแดงจนหมด จะเปนชวงท Blastopore ปด

เวลา 17 - 20 ชวโมง ระยะล าตวเรมเกดปลอง (Body Segment Appearance Stage) เรมมองเหน Somite ตวออนเจรญและยกขนสงจากไขแดง

เวลา 21 ชวโมง เรมเหนสวนของ Notochord เมอดภายนอกสงเกตสวนของหวและหางไดชดเจนขน

เวลา 22 - 30 ชวโมงเนอเยอบางสวนเรมพฒนาเปนกลามเนอ ท าใหตวออนกระดกตวได มแนวกระดกสนหลงชดเจนขน สวนหวมการพฒนาเปนเนอเยอประสาทสวนสมองและเนอเยอตา

เวลา 36 ชวโมง Hatching Stage ฟกเปนตว ตวออนจะยดตวใชหวและหางท าใหเปลอกไขแตกออก และดนออกจากเปลอกไข

12

เรมตน 5 นาท 10 นาท 15 นาท

20 นาท 25 นาท 30 นาท 45 นาท

60 นาท 1 ชวโมง 30 นาท 2 ชวโมง 30 นาท 3 ชวโมง

4 ชวโมง 5 ชวโมง 6 ชวโมง 7 ชวโมง

8 ชวโมง 9 ชวโมง 10 ชวโมง 11 ชวโมง

15 ชวโมง 16 ชวโมง 17 ชวโมง 19 ชวโมง

ภาพท 1 พฒนาการของคพภะปลาดกล าพนตงแตปฏสนธจนฟกออกจากไข

Blastocoel

Germ Ring Gastrocoel

Somite

ก ข ค

ซ จ

ง

ช ฉ

ณ ฒ

ฏ ฎ ญ ฌ

ฑ ฐ

ด ต ถ ท

น ธ บ ป

13

20 ชวโมง 21 ชวโมง 22 ชวโมง 23 ชวโมง

29 ชวโมง 30 ชวโมง 36 ชวโมง

ภาพท 1 (ตอ) พฒนาการของคพภะปลาดกล าพนตงแตปฏสนธจนฟกออกจากไข

2. พฒนาการของลกปลาวยออน

หลงฟก 6 ชวโมง รปรางตวออน ลกษณะล าตวยาว ปลายหางแหลม ปากยงไมเปดมเนอเยอบางๆ เชอมตดกน พบเนอเยอสมองเจรญอยดานบนสวนหวแยกออกเปน 2 สวน คอสมองสวนตนและสมองสวนทาย ทอทางเดนอาหารเรมมรปรางเปนทอไปตามแนวของล าตว และยงมถงไขแดงอยทางดานทอง (ภาพท 2)

ภาพท 2 ลกปลาหลงฟก 6 ชวโมง Brain (Bn), Digestive tract (DT), Yolk sac (Y)

Notochord Muscle ฝ ผ พ

ร ม ภ

ฟ

14

หลงฟก 12 ชวโมง ล าตวเรยวยาวเหนจดชดขน ปากยงปด ถงไขแดงมขนาดเลกลง พบNotochord อยถดจากเซลลประสาท เปนเซลลขนาดใหญ คลายเซลลไขมนภายในม Matrix แทรกอย ซงตดกนจะพบมดกลามเนอจ านวนหลายมด (ภาพท 3)

ภาพท 3 ลกปลาหลงฟก 12 ชวโมง Brain (Bn), Muscle (M), Notochord (N), Yolk sac (Y)

หลงฟก 18 ชวโมง เนอเยอสมองเจรญมากขน เรมแบงเปนสวนตางๆ พบสวนของ Diocoele ล าตวเรยวยาวขน ยงเหนเปนสใส ปากยงไมเปด (ภาพท 4)

ภาพท 4 ลกปลาหลงฟก 18 ชวโมง Diocoele (D), Muscle (M), Yolk sac (Y)

หลงฟก 24 ชวโมง อวยวะรบสมผสตาง ๆ เรมพฒนามากขนตามเวลาทมากขน ปากเรมเปด มเซลลสเหลยมบรเวณรมฝปากบนซงตอไปจะพฒนาเปน Olfactory organ มหนาทรบความรสกจากสารเคมในน า ทอทางเดนอาหารยงเปนทอตรง ไมแบงเปนสวน ๆ พบเนอเยอกลามเนอหวใจท

15

หวใจหอง Atrium เรมเหนโครงสรางของเหงอก มกระดกออนบรเวณซเหงอก (Gill filament) แตยงไมมการแตกแขนงของกงเหงอก (Gill lamelae) ถงไขแดงเลกลงอก (ภาพท 5)

ภาพท 5 ลกปลาหลงฟก 24 ชวโมง Atrium (At), Diocoele (D), Gill (G), Muscle (M), Yolk sac (Y)

หลงฟก 3 วน สมองมการแบงเปนสวนตาง ๆ ชดเจนขน โดยพบสวน Telencephalon อยดานหนาและตามดวย Mesencephalon (Me) เรมมรงควตถสน าตาลด าบรเวณชนผวหนง ส าหรบเหงอกซงเปนอวยวะชวยหายใจเรมมการแตกแขนงของกงเหงอก นอกจากนพบสวนของทางเดนหลอดอาหารเปนทอทเรมพฒนาแบงเปนสวนตาง ๆ ในระบบทางอาหาร ถงไขแดงเลกลงจากเดมมากขน พบตบตดกนกบทอทางเดนอาหารบรเวณทางดานหนา และมการพฒนาของเนอเยอไตซงอยใกลกบบรเวณกระดกสนหลง (ภาพท 6)

ภาพท 6 ลกปลาหลงฟก 3 วน Brain (B), Digestive tract (DT), Gill (G), Kidney (K), Liver (L), Mesencephalon (Me), Spinal cord (Sp), Telencephalon (Te)

หลงจากฟกปลาอาย 7 และ 15 วน มพฒนาการของระบบอวยวะสมบรณ ประกอบดวยระบบประสาท พบสมองและไขสนหลง ระบบทางเดนอาหาร ไดแก กระเพาะอาหาร ล าไสเลก ล าไสใหญ ตบ ตบออน ระบบหายใจ ไดแก เหงอก ระบบเลอด ไดแก หวใจ มาม ระบบขบถาย ไดแก ไต และถงไขแดงสลายหลงจากฟก 7 วน ลกปลาเรมกนอาหารจากภายนอก (ภาพท 7 และ 8)

ก ข

ก ข

16

ภาพท 7 ลกปลาหลงฟก 7 วน Cerebrum (Cr), Diencephalon (Di), Gill (G), Intestine (I)Kidney (K), Liver (L), Medula oblongata (Med), Mesencephalon (Me), Spinal cord (Sp), Stomack (S), Swim bladder (SB), Olfactory lobe (OL),

17

ภาพท 8 ลกปลาหลงฟก 15 วน Diencephalon (Di), Gall bladder (GB), Gill (G), Intestine (I), Kidney (K), Liver (L), Mesencephalon (Me), Metencephalon (Met), Pancreas (P), Stomack (S), Telencephalon (Te), วจารณผล

จากการศกษาคพภะของปลาดกล าพนโดยเมอไขไดรบการผสมจากเชอเพศผ ปรบอณหภมใหมคาในชวง 26-28 องศาเซลเซยส ลกษณะไขเปนชนดไขจมแบบตด (Adhesive dermersal egg) เมอปฏสนธมการแบงเซลลแบบไมโทซสเพอเพมจ านวนเซลลแบบ Meroblastic Cleavage และใชเวลาตงแตปฏสนธจนฟกเปนตวประมาณ 36 ชวโมง ซงใกลเคยงกบการศกษาของ Kiriratnikorm และคณะ (2007) รายงานวาลกปลาดกล าพนฟกออกจากไขในระยะเวลาประมาณ 30-36 ชวโมง และรายงานของกฤษณะ เรองคลาย และคณะ (2551)ไขปลาดกล าพนใชเวลาในการฟกตวประมาณ 33 ชวโมง 15 นาท และใกลเคยงกบระยะเวลาฟกของปลาดกอนๆ ในสกล Clarias เชน ปลาดกดาน 30 ชวโมง (Hossain et al., 2006)

18

หลงจากฟก ลกปลามการพฒนาของเนอเยออวยวะตางๆ ตามล าดบ โดยเวลา 21 ชวโมงกอนฟก เรมเหนสวนของ Notochord และเซลลประสาทเรมพฒนา และพบเนอเยอสมองหลงจากฟก 6 ชวโมง ซงสมองเปนสวนทตงอยบรเวณสวนหว สามารถแบง ออกไดเปนสวนๆ ตามลกษณะการวางตวของเซลล คอสวน Molecular Layer เปนสวนทอยดานนอก ประกอบดวยเสนใยและนวเคลยสจ านวนเลกนอย ตดสน าเงนเขม เมอยอมดวยส H&E สวนดานใน คอ Granular Layer ประกอบดวยเซลลเลก รปกลมจ านวนมาก ยอมตดสน าเงนเขมแทรกอยกบเสนใย ระหวางชน Molecular Layer และ Granular Layer พบ Purkinje Cells กระจายอยโดยรอบ อกทงยงสามารถแบงสวนของสมองไดตามการท าหนาทควบคมการท างานของระบบรางกายไดเชนกน และสวนทตอจากสมองคอไขสนหลง ซงจะทอดไปตามแนวความยาวของล าตวจนสดโคนหาง โดยมสวนของ Neural Arch ของกระดกสนหลง (Vertebral Column) หอหมสวนไขสนหลงไว เนอเยอกลามเนอ เรมมการพฒนา เวลา 22 - 30 ชวโมงกอนฟก กลามเนอเปนองคประกอบสวนใหญของรางกาย ท างานไดโดยมการหดตว (Contraction) ของเซลลกลามเนอเมอไดรบสงกระตนภายในเสนใยกลามเนอ ประกอบดวย Myofibrils จ านวนมาก (สปราณ ชนบตร และคณะ, 2536) ภายนอกรางกายถกปกคลมดวยชนผวหนง เรมมรงควตถสน าตาลด าบรเวณชนผวหนงหลงฟก 3 วน ปลาดกล าพนเปนปลาไมมเกลด ผวหนงของปลาโดยทวไปเปนแบบ Unkeratinized mucous membrand ประกอบดวยชนตางๆ ไดแก ผวหนงชนนอก (Epidermis), ผวหนงชนใน (Dermis) และในบางบรเวณพบชนไขมน (Hypodermis) (วมล เหมะจนทร, 2540) การหายใจของลกปลาดกล าพนมการหายใจผานทางเหงอกซงมการพฒนาเปนเหงอกหลงจากฟก 24 ชวโมง แตยงไมมการแตกแขนงของกงเหงอกจนถงเวลาประมาณ 3 วนหลงฟก เหงอกแตละอนจะประกอบดวย Gill Raker เปนสวนชวยบอกถงลกษณะ การกนอาหารของปลาดกล าพนวาเปนปลากนเนอ และซเหงอก (Gill Filament) ตงอยตรงขามกน บนสวนของแกนเหงอก ในบรเวณสวนทายของเหงอกแตละอนจะมแกนเหงอกทโคงงอขนดานบน คลายกระดกยนออกมา ซเหงอก มลกษณะเปนแขนงยนออกมาจากแกนเหงอก ประกอบดวย Primary Lamellae และ Secondary Lamellae ซงบรเวณ Secondary Lamellae จะมเซลล Squamous Epithelial Cells ปกคลมเปนชนเนอเยอบผว ภายในพบ Pillar Cells เชอมตอกนเปนตวค าจน เกดเปนทอเลอดขนาดเลก ซงเปนชองทเมดเลอดผานไปแลกเปลยนกาซกบน า และพบวาหลงจากฟก 24 ชวโมงมการเจรญของเนอเยอหวใจ โดยหวใจของปลาดกล าพนมเยอหมหวใจ (Pericardial Sac) ซงเปนเซลลแบบชนเดยวและมเนอเยอเกยวพนแทรกหลวมๆ ม 2 หอง คอหวใจหอง Atrium มผนงบาง และหวใจหอง Ventricle ซงเปนสวนทเหนเดนชด มสแดง ผนงหนา จะถกแบงดวยลนหวใจ (Valve) ส าหรบทอทางเดนอาหารเรมมการพฒนาตงแตหลงฟก 6 ชวโมง แตไมสามารถแยกเปนอวยวะไดจนถงเวลาหลงฟก 7 วนจงสามารถแยกเปนสวนตางๆ ได คอ กระเพาะอาหาร (Stomach) มหนาทเปนทพกอาหารและยอยอาหาร โดยใชน ายอยจากตอมน ายอยทมอยในผนงกระเพาะอาหาร (วมล เหมะจนทร, 2540) ล าไส มหนาทยอยและดดซมอาหาร

19

ซงลกษณะส าคญของทอทางเดนอาหารแตละสวน ประกอบดวยชน Mucosa ยนยาวเขาไปใน Lumen และมการแตกแขนง เซลลเยอบเปนรปสเหลยมทรงสงชนเดยว มนวเคลยสรปรอยคอนไปทางดานฐาน ระหวางเซลลเยอบมตอมเมอกแทรกอย ถดลงไปเปนช น Lamina Propria ประกอบดวยเนอเยอเกยวพนบางๆ ค าจนสวนของ Mucosa ใตลงมาเปนช น Submucosa ประกอบดวยเนอเยอเกยวพนเรยงตวกนแนน ถดมาเปนชน Muscularis ประกอบดวยกลามเนอเรยบ 2 ชน และชนนอกสด คอ ชน Serosa มเซลลรปแบนชนเดยว สวนระบบขบถายของลกปลาดกล าพนพบการพฒนาของเนอเยอไตหลงฟก 3 วน ไตมหนาชวยก าจดของเสยพวกไนโตรเจน และชวยควบคมปรมาณน าและเกลอใหสมดล (วมล เหมะจนทร, 2540) เนอเยอไตประกอบดวยสวนของทอไตทมลกษณะเปนเซลลสเหลยมลกบาศกเรยงตว 1 ชน และ Glomerulus ซงเปนกลมของหลอดเลอดฝอย ทประกอบดวย Endothelial Cells ของหลอดเลอดฝอย Basement Lamina และ Visceral Epithelium (Podocytes) ซงเปนชนของ Bowman,s Capsule ทลอมรอบ Glomerulus อย พฒนาการทางเนอเยอวทยาโดยเฉพาะในระบบยอยอาหารของลกปลาวยออนมการศกษากนมาก ทงนเนองจากชวยใหเขาใจสรรวทยาการกนอาหารและการเจรญเตบโตของลกปลาเพอเปนประโยชนในการวางแผนการอนบาลลกปลาวยออนใหมประสทธภาพ (Senger et al., 1993; Zaiss et al., 2006) ส าหรบการทดลองครงนเรมใหอาหารธรรมชาตคออารทเมยแกลกปลาในวนท 7 หลงฟกออกจากไข ซงการเรมกนอาหารครงแรกเปนชวงเวลาวกฤตส าหรบพฒนาการลกปลาวยออน โดยพบวาลกปลามอตราการตายสงในชวงเวลาน (Yufera and Darias, 2007) เมอลกปลาเรมกนอาหาร ทางเดนอาหารของลกปลาจะตองพรอมทจะท างาน ในชวงเวลานกระบวนการพฒนาของทางเดนอาหารจะมความสมพนธกบการเจรญเตบโตของลกปลา โดยมการเพมอตราการน าเขาและการยอยอาหารประกอบกบการเพมประสทธภาพของกระบวนการยอยและดดซมของลกปลาวยออน ซงสงผลตอการเจรญเตบโตทเพมขนของลกปลา (Bengson, 1993) ดงนนจงพบวาชวงเวลานเปนชวงเวลาวกฤตของลกปลาทตองไดรบสารอาหารอยางตอเนองหลงจากสารอาหารภายในถงไขแดงหมดลง (Gisbert et al., 2004; Pena and Dumas, 2005) มการศกษาพบวาในการอนบาลลกปลาหลายชนดมการรบสารอาหารแบบผสม คอ แมถงไขแดงจะยงยบไมหมดกสามารถกนอาหารจากภายนอกไดแลว เชน ปลาดกยโรปกนอาหารไดในวนท 4 หลงฟก กอนทถงไขแดงจะยบหมด 2 วน (Kozaric et al., 2008) ปลา Amphiprion percula สามารถกนอาหารไดตงแตวนแรกทฟก แมถงไขแดงจะยบหลงจากฟกในวนท 3 (Onal et al., 2008) โดยพบวาระบบทางเดนอาหารของลกปลาดงกลาวมการพฒนาสวนของตบและตบออน ถงแมวาทอทางเดนอาหารจะยงไมสามารถแยกความแตกตางและพฒนาเตมท ในชวงทมการกนอาหารจากภายนอกในขณะททางเดนอาหารยงไมสมบรณ ลกปลาควรกนอาหารทมชวต เนองจากสามารถอาศยเอนไซมภายในยอยตวมนเอง และมสารอาหารทเพยงพอตอการเจรญเตบโตของของลกปลา (Abol-Munafi et al., 2006)

20

อวยวะชวยยอยในระบบทางเดนอาหารอกสวนหนงคอ ตบ ซงมการพฒนากอนทระบบทอทางเดนอาหารจะพฒนาแยกเปนอวยวะ ตบมหนาททงดานการยอย และสะสมอาหาร โดยตบจะท าหนาทสรางน าดทชวยในการแตกตวของไขมนและสะสมสารอาหารหลายชนด เชน ไขมนในรปของไตรกลเซอไรด และคารโบไฮเดรตในรปของไกลโคเจน เปนตน (Lovell, 1998) โดยการเรมสะสมไกลโคเจนและไขมนในลกปลาวยออนแตละชนดมเวลาแตกตางกนซงเปนการแสดงถงความพรอมของกระบวนการยอย และดดซมอาหาร ดงเชนในปลาดกยโรปทเรมพบการสะสมในระหวางวนท 7-9 หลงฟก พรอมกบการพบหยดไขมนบรเวณล าไสสวนตน (Kozaric et al., 2008) เปนตน ถงไขแดงของลกปลาดกล าพนพบต งแตแรกฟกจนถงประมาณ 7 วนหลงฟก เมอเปรยบเทยบกบปลาชนดอนพบวาถงไขแดงของลกปลาดกล าพนมระยะเวลาในการยบนานกวา เชน ปลากดเหลอง (Mystus nemurus) ถงไขแดงยบหมดใน 3 วนหลงฟก (Amornsakun et al.,1997) แตใชเวลาใกลเคยงกบปลาดกยโรปทถงไขแดงจะยบหมดใน 6 วนหลงฟก (Kozaric et al., 2008) ซงอาจขนอยกบปรมาตรของถงไขแดงทแตกตางกนจงใชเวลาในยบตวแตกตางกน ทวสน (2554) รายงานวาถงไขแดงแรกฟกของลกปลาดกล าพนมปรมาตรเฉลย 1.735 ±0.691 ลกบาศกมลลเมตร การยบตวของถงไขแดงเปนไปในเชงเสนตรงซงมการลดลงคอนขางสม าเสมอ นอกจากการศกษาทางดานเนอเยอจะเปนประโยชนในการน าเอาองคความรไปใชในการชวยใหการอนบาลลกปลาดยงขนและเหมาะสมแลวยงมการศกษาประสทธภาพการท างานของเอนไซมชนดตางๆ กจะชวยเสรมความรใหการวางแผนอนบาลลกปลาวยออนมประสทธภาพมากขน เชน การศกษาเอนไซมอลคาไลนฟอสฟาเตสซงสามารถใชบอกความพรอมในการดดซมสารอาหารชนดตางๆ เชน ไขมน กลโคส แคลเซยม และฟอสเฟต (Roubaty and Portmann, 1988; Mahmood et al., 1994)

21

บทท 5 สรปและขอเสนอแนะ

สรปผลการศกษา พฒนาการของคพภะของปลาดกล าพน มการเจรญและพฒนาเปนขนตางๆ ดงน เวลา ระยะไขทพบ 5 นาท - 8 ชวโมง Cleavage Stage 7 - 9 ชวโมง Morular Stage 10 - 11 ชวโมง Blastula Stage 15-16 ชวโมง Gastrula Stage 17 - 20 ชวโมง ระยะล าตวเรมเกดปลอง (Body Segment Appearance Stage) 36 ชวโมง Hatching Stage พฒนาการของลกปลาวยออน เวลา การเปลยนแปลง หลงฟก 6 ชวโมง ปากยงไมเปดมเนอเยอบางๆ เชอมตดกน พบเนอเยอสมองเจรญอย

ดานบนสวนหวแยกออกเปน 2 สวน หลงฟก 12 ชวโมง พบ Notochord และมดกลามเนอจ านวนหลายมด หลงฟก 18 ชวโมง เนอเยอสมองเจรญมากขนพบสวนของ Diocoele หลงฟก 24 ชวโมง ปากเรมเปด ทอทางเดนอาหารเปนทอตรง ไมแบงเปนสวน ๆ เรมเหน

โครงสรางของเหงอก หลงฟก 3 วน สมองมการแบงเปนสวนตาง ๆ ชดเจนขน เหงอกมการแตกแขนงของกง

เหงอก ทางเดนหลอดอาหารพฒนาแบงเปนสวนตาง ๆ ในระบบทางอาหาร มการพฒนาของเนอเยอไต

หลงฟก 7 และ 15 วน มพฒนาการของอวยวะสมบรณ ถงไขแดงสลายหลงจากฟก 7 วน ลกปลา เรมกนอาหารจากภายนอก

ขอเสนอแนะ ในการศกษาพบวาพบวาในขนตอนการตดเนอเยอไขปลา เนองจากเปลอกไขของปลาดก

ล าพนมความแขง เมอผานกระบวนการเตรยมเนอเยอจะท าใหเปลอกไขแขงมากขน ดงนนจงควรน าไขปลาดกล าพนมาผานกระบวนการท าใหเปลอกไขมความนมเพอใหงายตอการตดมากขน

22

เอกสารอางอง จรยา เทพณรงค และจราพร โรจนทนกร. (2550). การพฒนาโอโอไซดปลาสวาย (Pangasianodon

hypophthalmus) ในหองทดลองโดยอาหารเลยงเซลล อณหภม และฮอรโมน.วารสารวจยเทคโนโลยการประมง 1(2) : 122-128.

จราพร โรจนทนกร และจรยา เทพณรงค. (2549). เทคนคการศกษาทางเนอเยอและเซลลของโอโอไซดในปลากลม Catfish.การประชมวชาการประมง ประจ าป 2549. กรมประมง รวมกบ ศนยพฒนาประมงเอเชยตะวนออกเฉยงใต. หนา 355-377.

ทวสน แซล. (2554). พฒนาการทางวทยาเนอเยอและฮสโตเคมของระบบยอยอาหารในปลาดกล าพนระยะวยออน. วทยาศาสตรมหาบณฑต. มหาวทยาลยสงขลานครนทร.

เบญจศภลกษณ อดรโพธ. 2545. พฒนาการทางเนอเยอวทยาและฮสโตเคมของระบบยอยอาหารในปลาบทรายระยะวยออน. มหาวทยาลยสงขลานครนทร วทยาเขตหาดใหญ คณะท ร พ ย า ก ร ธ ร ร ม ช า ต ว ท ย า น พ น ธ ส บ ค น จ า ก http://202.28.199.3/ tdc/browse.php?option=show&browse_type=title&titleid=232211&display=list_subject&q=%BB%C5%D2.

ปรญญา สทธนนท, วราห เทพาหด,อภชาต เตมวชชากร, เรณ ยาชโร,เมธ แกวเนน และพธชพล สวรรณชย (2012). พฒนาการและความสมพนธระหวางความกวางปากกบความยาวล าตวของลกปลากะรงจดฟา (Plectropomus leopardus Lacepide, 1802). The 13th Graduate Research Conference KhonKaenUniversith 1-7 กมภาพนธ 2555. สบคนจากhttp://gsbooks.gs.kku.ac.th/55/cdgrc13/files/sdp2.pdf.

พรพนม พรหมแกว. 2538. การศกษาการเพาะพนธและอนบาลปลาดกล าพน. การสมมนาวชาการประจ าป 2538, วนท 18-20 กนยายน 2538. กรมประมง, กระทรวงเกษตรและสหกรณ.

พนธสทธ โชคสวสดกร, สภฎา ครรฐนคม, กฤษณะ เรองคลาย และอานช ครรฐนคม. (2551).ผลของระดบความหนาแนนตอการเจรญเตบโต อตราการเปลยนอาหารเปนเนอ และการรอดตาย ของปลาดกล าพนระยะปลานวในบอคอนกรต. รายงานการวจยมหาวทยาลยทก ษณ . สบคนจาก http://www.bio.sci.tsu.ac.th/th/personal/academic_files/ 2 008 0 8190348291390.doc.

วมล เหมะจนทร. 2540. ชววทยาปลา. จฬาลงกรณมหาวทยาลย : กรงเทพ ศราวธ เจะโสะ, สวมล สหรญวงศ และพรพนม พรหมแกว. 2538. ชววทยาบางประการของปลา

ดกล าพน. รายงานการสมนาประจ าป 2538 กรมประมง. กรมประมง กระทรวงเกษตรและสหกรณ. หนา 329-348.

23

สนตย โรจนพทยากล, เจนจตต คงก าเนด และสรณฎฐ ศรสวย. (2540). ชววทยาและพฒนาการของลกปลาเหดโคน Sillago sihama วยออนระยะแรกเอกสารวชาการฉบบท 11 สถาบนวจยการเพาะเลยงสตวน าชายฝง, กรมประมง. 12 หนา.

สปราณ ชนบตร, กลยา จ าเรญรตนะ และ ชลอ ลมสวรรณ. (2536). เนอเยอวทยาของปลาชอน. สถาบนวจยสขภาพสตวน า, กรมประมง.

อภชาต เตมวชชาการ และศรวรรณ สขศร. (2551). พฒนาการและการจ าแนกชนดของลกปลาดกวยออน. วารสารประมง. 61(6): 514-519.

อธยา อรรถอนทรย, สมพนธ จนทรด า และณฐพล แปลกยอด. (2552). การศกษาการเพาะพนธและคพภะวทยาของปลาหมคอก (Yasuhikotakia morleti). วารสารวจยเทคโนโลยการประมง 3(1) : 25-33.

อาคม สงหบญ, ไพบลย บญลปตานนท และสามารถ เดชสถต. (2546). พฒนาการคพภะและลกปลาวยออนของปลาเกาเสอ Epinephelus fuscoguttatus (Forsskal, 1775) เอกสารวชาการฉบบท 28 สถาบนวจยการเพาะเลยงสตวน าชายฝง, กรมประมง. 29 หนา.

Abol-Munafi, A.B., Liem, P., Van, M.V. and Awang M. A. (2006). Histological ontogeny of the digestive system of marble goby (Oxyeleotris marmoratus) larvae. Journal of Sustainability science and management. 1(2): 79-86.

Amornsakun, T., Chiayvareesajja, S., Hassan, A., Ambak, A. and Jee, A.K. (1997). Yolk absorption and start of feeding of larval green catfish, Mystus nemurus (Cuv.&Val.). Songklanakarin Journal of Science and Technology. 19(1): 117-122.

Amornsakun, T., Sriwatana, W. and Promkaew, P. (2004). Some aspects in early life stage of Siamese gourami, Trichogaster pectoralis (Regan) Larvae. Songklanakarin Journal of Science and Technology. 26(3): 347-356.

Bengson, D.A. (1993). A comprehensive program for the evaluation of artificial diets. Journal of the World Aquaculture Society. 24(2): 285–293.

Chessadapa, N., Phromkunthong, W. and Kiriratnikom, S. (2009). Effect of dietary protein levels on growth, feed conversion, survival, protein efficiency ratio and apparent net protein utilization in Nieuhofii's waiking catfish (Clarias nieuhofii Valenciennes, 1840) fingerlings. in The 35th congress on science and technology of thailand (STT 35) "Science and technology for a better future". (pp. 240). October 15-17, 2009 The Tide Resort, Chonburi, Thailand. Chonburi :Burapha University.

24

Gisbert, E., Conklin, D.B. and Piedrahita, R.H. (2004). Effects of delayed first feeding on the nutritional condition and mortality of California halibut larvae. Journal of Fish Biology. 64: 116–132.

Govoni, J.J., Boehlert, G.W. and Watanabe, Y. (1986). The physiology of digestion in fish larvae Environinental Biology of Fishes. 16:59-77.

Hossain (2006). Artificial breeding and nursery practices of Clarias batrachus (Linnaeus, 1758). Scientific World. 4(4): 32-37.

Humason, G. L. (1967). Animal Tissue Techniques. San Francisco : W.H. Freeman and Company.

Kiriratnikom, S., Ruangklay, K., Choksawatdikorn, P., Anuchart, P. and Kiriratnikom, A. (2007). Effect of various forms of diet on growth performance and survival of nieuhofii catfish larvae (Clarias nieuhofii). in33rd Congress on Science and Technology of Thailand. Nakorn Si Thamarat: Walailak University. Retrieved january 30, 2014, from http://www.scisoc.or.th /stt/33/sec_f/paper/ stt33_F_F0007.pdf.

Kozaric, Z., Kuzir, S., Petrinec, Z., Gjurcevic, E. and Bozic, M. (2008). The development of the digestive tract in larval European catfish (Silurus glanis L.). Anatomia Histologia Embryologia. 37(2):141-146.

Lovell, T. (1998). Nutrition and Feeding of Fish, 2nd Ed.Kluwer Academic Publisheers: USA. Mahmood, A., Yamgishi, F., Eliakim, R., DeSchryver-Kecskemeti, K. Gramlich, T.L. and Alpers

D.H. (1994). A possible role for rat intestinal surfactant-like particles in transepithelial triacylglycerol transport. The Journal of Clinical Investigation 93:70-80.

Micale, V., Garaffo, Genovese, M. L., Spedicato, M.T. and Muglia,U. (2006).The ontogeny of the alimentary tract during larval development in common pandora Pagellus erythrinus L. Aquaculture 251 :354– 365.

Onal, U. Langdon, C. and Celik, I. (2008). Ontogeny of the digestive tract of larval percula clownfish, Amphiprion percula (Lacé pè de, 1802): a histological perspective. Aquaculture Research. 39(10): 1077–1086.

Ortiz-Delgado, J.B., Darias, M.J., Cañavate, J.P., Yúfera,M. and Sarasquete, C.(2003). Organogenesis of the digestive tract in the white seabream, Diplodus sargus Histological and histochemical approaches. Histology and Histopathology 18 : 1141-1154.

25

Pena, R. and Dumas, S. (2005). Effect of delayed first feeding on development and feeding ability of Paralabrax maculatofasciatus larvae. Journal of Fish Biology. 67: 640–651.

Rangsin, W., Areechon, N. and Yoonpundh, R. (2012). Digestive enzyme activities during larval development of Striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Kasetsart Journal Natural Science. 46 : 217-228.

Roubaty, C. and Portmann, P. (1988). Relation between intestinal alkaline phosphatase activity and brush border membrane transport of inorganic phosphate, D-glucose-6-phosephate. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 412: 482-490.

Saelee, T., Kiriratnikon, S., Suwanjarat, J., Thongboom, L. and Pongsuwan, K. (2011). The development of the digestive system in Clarias nieuhofii larvae : Histology and histochemical studies. Journal of the microscopy society of Thailand 4(1) : 16-19.

Senger, H., Rosch, R. Werreth, J. and Wit, U. (1993). Larval nutritional physiology: studies with Clarias gariepinus, Coregonus lavaretus and Scophthalmus maximus. Journal of the World Aquaculture Society. 24:121-134.

Valenciennes, A. (1840). Clarias nieuhofii. Retrieved June 6, 2013, from http://www.fishbase.org/summary/speciessummary.php?id=23346.

Yang, R., Xie, C., Fan, Q., Gao, O. and Fang, L. (2010). Ontogeny of the digestive tract in yellow catfish Pelteobagrus fulvidraco larvae. Aquaculture 302: 112-123.

Yufera, M. and Darias, M.J.(2007). The onset of exogenous feeding in marine fish larvae. Aquaculture. 268: 53-63.

Zaiss, M.M., Papadakis, I.E. Maingot, E. Divanach, P. and Mylonas, C.C. (2006). Ontogeny of the digestive tract in shi drum (Umbrina cirrosa L.) reared using the mesocosm larval rearing system. Aquaculture. 260(29): 357-368.

Zambonino Infante, J. and Cahu, C. (2001). Ontogeny of the gastrointestinal tract of marine fish larvae. Comparative Biochemistry and physiology Part C. 130:477-487.

26

ภาคผนวก สารเคมส าหรบศกษาเนอเยอ ( Humason. 1979 : 3-167) การเตรยมน ายาดองเนอเยอและสยอม 1. น ายาบแอง (Bouin's Fluid) Saturated Aqueous Picric Acid 100 มลลลตร 100% ฟอรมาลน 900 มลลลตร กรดอะซตก 5 มลลลตร 2. สยอมฮมาทอกซลน (Haematoxylin) เตรยมโดยใช ฮมาทอกซลน (Haematoxtlin Crystal) 4 กรม โซเดยมไอโอเดท (Sodium Iodate) 0.8 กรม อลม (Potasium Aluminium Sulfate, Alum) 100 กรม กรดซตรก (Citric Acid) 4 กรม คลอรลไฮเดรท (Chloral Hydrate) 200 กรม น ากลน 2,000 มลลลตร ละลายอลมลงในน ากลน เตมฮมาทอกซลนผสมจนกระทงละลายหมด จงเตมโซเดยม ไอโอเดทผสมใหเขากน จากนนเตมกรดซตรกและคลอรลไฮเดรทผสมจนกระทงเปนเนอเดยวกนทงไว 1 สปดาหกอนน ามาใชงาน 3. สยอมอโอซน (Eosin) เตรยมโดยใช อโอซน (Eosin Y.Cl 45380) 1 กรม เอทธลแอลกอฮอล ความเขมขน 70 เปอรเซนต 1,000 มลลลตร กรดอะซตกเขมขน 5 มลลลตร

27

ประวตผวจย หวหนาโครงการ ชอ - นามสกล (ภาษาไทย) นางสาววนวภา หนมา ชอ - นามสกล (ภาษาองกฤษ) Miss Wanwipa Nooma ต าแหนงปจจบน อาจารย หนวยงานและสถานทอยทตดตอไดสะดวก โปรแกรมวชาชววทยาและชววทยาประยกตคณะวทยาศาสตรและเทคโนโลย มหาวทยาลยราชภฏสงขลา ถ.กาญจนวนช ต.เขารปชาง อ.เมอง จ.สงขลา โทรศพท 080-0376704 โทรสาร 074-336950 E-mail wanwipa.no@gmail.com ประวตการศกษา วทยาศาสตรมหาบณฑต (ชววทยา) มหาวทยาลยทกษณ จงหวดสงขลา (พ.ศ. 2551-2554) วทยาศาสตรบณฑต (ชววทยา) มหาวทยาลยทกษณ จงหวดสงขลา (พ.ศ. 2547-2551) สาขาวชาการทมความช านาญพเศษ ชววทยาและชววทยาประยกต, เนอเยอวทยา ประสบการณทเกยวของกบการบรหารงานวจยทงภายในและภายนอกประเทศ งานวจยทส าเรจแลว ชอโครงการวจย : ผลของวตามนซและอตอการเจรญเตบโต, อตราแลกเนอ, ประสทธภาพอาหาร, การรอดตาย, องคประกอบทางเคมของตวปลา, องคประกอบเลอดและการเปลยนแปลงทางเนอเยอของปลาดกล าพน (Clarias nieuhofii) แหลงทน : ส านกงานคณะกรรมการวจยแหงชาต (วช.) สถานภาพ : หวหนาโครงการวจย/โครงการส าเรจแลว (28 ตลาคม 2553 – 28 เมษายน 2554) ผลงานวชาการใน Conference proceedings/Abstract books/Presentation

Nooma, W., Malee, F. and Kiriratnikom, S. (2009). “Study on histology of the integument and respiratory system of Nieuhofii’s catfish (Clarias nieuhofii)," in The 35th congress on science and technology of thailand (STT 35) "Science and technology for a better future,” (pp. 240). October 15-17, 2009 The Tide Resort, Chonburi, Thailand. Chonburi : Burapha University.

วนวภา หนมา และสภฎา ครรฐนคม. (2554). “ผลของวตามนซและอตอการเจรญเตบโต, อตราแลกเนอ, การรอดตาย, องคประกอบทางเคมของตวปลา และ การเปลยนแปลงทางเนอเยอของปลาดกล าพน (Clarias nieuhofii),” ใน การประชมวชาการระดบชาต “มหาวทยาลยบรพา 2554”. (ซดรอม). วนท 6-7 กรกฎาคม 2554 ณ อาคาร 50 ป มหาวทยาลยบรพา. ชลบร : มหาวทยาลยบรพา.

28

วนวภา หนมา และสภฎา ครรฐนคม. (2554). “ผลของวตามนซและอตอองคประกอบเลอดของปลาดกล าพน” ใน การประชมวชาการประมง ครงท 6 “เพอความมนคงดานการประมงและทรพยากรทางน า”. (หนา 102 - 103). วนท 1-3 ธนวาคม 2554 ณ คณะเทคโนโลยการประมงและทรพยากรทางน า มหาวทยาลยแมโจ จงหวดเชยงใหม. เชยงใหม : คณะเทคโนโลยการประมงและทรพยากรทางน า มหาวทยาลยแมโจ.

สภฎา ครรฐนคม อานช ครรฐนคม และวนวภา หนมา. “ความตองการไขมนในอาหารของปลาดกล าพน (Clarias nieuhofii) ระยะปลานว”. ในงานประชม โครงการสงเสรมการวจยในอดมศกษา ครงท 1 รหสโครงการ HERP (1)-54(1) ส านกงานคณะกรรมการอดมศกษาแหงชาต (สกอ.) ประจ าปงบประมาณ พ.ศ. 2554

ศรนช ทองขาว มตตา หลอศร และวนวภา หนมา. ผลของสารอนทรยเสรม 3 ชนดในอาหารสตร VW และอาหารสตร ½ MS ทมผลตอการเจรญเตบโตของโปรโตคอรมวานหางชางในสภาพปลอดเชอ งานประชมวชาการระดบชาต วลยลกษณวจย ครงท 6 วนท 3-4 กรกฎาคม 2557 ณ อาคารปฏบตการเทคโนโลยและพฒนานวตกรรม มหาวทยาลยวลยลกษณ.

นรอาราน สาแม, นรยะห สามะ, มต เจยรพนธ และวนวภา หนมา. 2558. ความหลากหลายของเหบในต าบลเขารปชาง ต าบลเกาะแตว และต าบลทงหวง จงหวดสงขลา. การประชมวชาการระดบชาต “ลมน าทะเลสาบสงขลา ครงท 3” 28-29 พฤษภาคม 2558 ณ มหาวทยาลยราชภฏสงขลา.

วนวภา หนมา. 2558. การศกษานเวศวทยาและความหลากหลายทางชวภาพของเหบและจลนทรยของเหบในจงหวดสงขลาและสตลของประเทศไทย. การประชมใหญโครงการสงเสรมการวจยในอดมศกษา ครงท 3 (HERP congress III) 9-11 มนาคม 2558 ณ มหาวทยาลยราชภฎนครศรธรรมราช.

ภควด รกษทอง, วนวภา หนมา, วชรพร ตฤณชาตวณชย และอรณ อหนทรก. 2015. ความหลากหลายทางชวภาพและการกระจายตวของเหบในภาคใตของประเทศไทย. Rajabhat J. Sci. Humanit. Soc. Sci. 16(2): 310-319.