USO DE TECNOLOGIAS MOLECULARESMOLECULARES

Conceitos básicos Conceitos básicos

Aonde esta localizada a informação genética?

•Cromossomos: acido desoxirribonucléico (DNA) + proteínas •O DNA é uma grande molécula de duas fitas •Cada fita é composta por: Açucares, radicais de fosfato e bases nitrogenadas

- A informação genética é contida nos cromossomos.

nitrogenadas–Adenina (A), Guanina (G), Citosina (C), Tiamina (T) –A com T (2 pontes de nitrogênio) –C com G (3 pontes de nitrogênio)

•As fitas são conectadas através de pontes de hidrogênio.

•Os cromossomos são arranjos lineares de DNA: ATTTGATCGCGCGTT

•Par de cromossomos homólogos (indivíduos diplóides) –Bovinos 2n:60; Suínos 2n:38; Ovinos 2n:54

•Loci (plural: locos): A posição de um gene ou de um marcador •Loci (plural: locos): A posição de um gene ou de um marcador

genético em um cromossomo.

•Alelos: formas alternativas de um gene

•Haplótipos: Alelos em diferentes loci localizados de forma próxima em um cromossomo tendem a ser herdados conjuntamente (Ligação)

•Meiose (I e II): um tipo especial de divisão celular que ocorre no processo de formação das gametas, através do qual uma célula tem o seu número de cromossomos reduzido pela metade.

• Os cromossomos segregam de forma aleatória (Meiose I) •“Crossing-over” ou recombinação: troca de segmentos

cromossômicos entre homólogos durante a meiose (Meiose I)

Que é crossing-over?

•Uma forte correlação entre a fração de recombinação e adistância em pares de bases.

•O crossing-over ocorre quando existe troca de segmentos decromossomos homólogos (ex, os cromossomos paternos ematernos)

A variação genética é devido a diferenças na seqüência de DNA

Os genes são uma sequência de DNA (ex: AGTCTAGGGATTAGA)

•As diferenças genéticas entre indivíduos são devidas às diferenças na sequência de DNA:

Animal 1 AGTCTAG Animal 2 AGTGTAG

•As diferenças genéticas são devido a variações naturais naseqüência do DNA (polimorfismos)

Nem sempre as diferenças a nível genética (DNA) determinam diferenças no fenótipo –Depende se a variação estiver numa região codificante–Exon/Intron

Algumas características são controladas por poucos (um) genes

• – Cor da pelagem

• – Algumas doenças genéticas

• – Dupla musculatura

• – Presença de chifres

• A maioria das características produtivas são

controladas por vários genes e por efeitos ambientais

• - Muitos genes + efeito ambiental

• - Modelo infinitesimal (Fischer, 1918)

Mensagem I

• A seleção depende da disponibilidade de registrosfenotípicos

• Dependendo da herdabilidade da característica podefornecer uma idéia ou não do valor genético aditivofornecer uma idéia ou não do valor genético aditivodo animal

• As informações de parentesco genético aditivo sãoutilizadas para a estimação dos valores genéticos

Limitações da seleção tradicional

• Seleção tradicional depende fortementeregistros fenotípicos e resposta muito baixapara algumas características:

– Características de difícil mensuração– Características de difícil mensuração

– Características que são expressos tardiamente na vida do animal

– Caracteres limitados ao sexo

– Características de baixa herdabilidade

Resposta a seleção

• ΔG: Progresso genético anual

• i: intensidade de seleção

• r: acurácia de seleção

• σa: desvio padrão aditivo

• IG: intervalo entre gerações

Detecção de genes de efeito maior (QTL)

•Se temos informação sobre a localização do QTL no genomapodemos:

–Diminuir o intervalo entre gerações –Aumentar a acurácia dos valores genéticos –Aumentar a acurácia dos valores genéticos –Incrementar a resposta à seleção

•Como encontrar os QTL? 1.-Mapeamento por ligação 2.-Abordagem de genes candidatos

Podemos observar diretamente os genes que afetam ascaracterísticas quantitativas?

Uso de marcadores moleculares

•Localizar os genes que tem grande efeito sobre ofenótipo•Identificar diferentes alelos destes genes•Permitem seguir ou rastrear a herança dos genes(ao longo das gerações)

Uso de marcadores no estudo de características quantitativas

• Características quantitativas– Controladas por vários genes de pequeno efeito

– Sofrem maior influencia ambiental

– Não se sabe quanto ele contribui para o fenótipo

• QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caráter quantitativo• QTL: Quantitative Trait Loci; Locos de um caráter quantitativoidentificado por marcadores moleculares.

• Finalidade: determinar quanto de uma característicaquantitativa é explicada por um ou mais marcadores

QTL• São regiões cromossômicas relacionadas com variação

fenotípicas das características quantitativas

• Limitações:• Dificuldade de avaliação dos caracteres quantitativos aliados a

necessidade de ligação dos marcadores com os QTLnecessidade de ligação dos marcadores com os QTL• Dificuldade de obtenção dos próprios marcadores• Estudo difícil e trabalhoso

• Obs: Há necessidade de mais pesquisas para tornarmais eficientes o emprego dos marcadores molecularesno estudo das características quantitativas

Busca de QTL

•O que necessitamos?

–Uma população de animais com genótipos dosmarcadores e os fenótipos para características relevantes

•Princípios chaves na busca

–Encontrar marcadores associados com diferenças nosfenótipos

–O marcador está ligado com um QTL que determina asdiferenças de fenótipo

Uso de marcadores moleculares

Duas alternativas 1- DIRETAMENTE identificaram o gene de interesse

Marcadores diretos Marcadores diretos

Aplicação: Análise de Genes Candidatos

•Genes de função conhecida relacionados com o desenvolvimento de uma característica

•Principal vantagem prática: não há necessidade de construção defamílias segregantes, podendo o efeito do gene candidato seravaliado em qualquer população (marcador direto)

•Outras Vantagens: –Alto poder estatístico –Ampla aplicabilidade –Baixo custo e simplicidade

•Desvantagem: Difícil de encontrar regiões candidatas

Dekkers and van der Werf, 2007

2- INDIRETAMENTE identificação de marcadores que estão próximos ao gene ou QTL de interesse

IMPORTANTE: Distância entre marcador e a mutação

Marcadores indiretos

Porque é que a distância é importante?

Um marcador genético indireto (variantes A e B) ligado a um gene principal (variantes círculo e triângulo):

Se organizamos o sêmen deste touro obtemos:

Gametas não recombinantes Gametas recombinantes

A distância é proporcional ao número de recombinantes

Mapeamento por ligação: LD e LE

• Marcadores em loci diferentes se encontram emassociação ao acaso (independentes) são ditos em

estado de equilíbrio de ligação (LE) na população.

• Marcadores em loci diferentes não estão emassociação ao acaso (não independentes) são ditos

em estado de desequilíbrio de ligação (LD) na

população.

MARCADORES GENÉTICOS

• Identificar ou etiquetar alguma coisa

• 1923: feijão com ausência de cor escura no tegumento xtamanho do semente : seleção de forma indireta (tegumentoclaro = marcador

• Qualidade de um bom marcadorQualidade de um bom marcador» Herdável

» Fácil observação

» Herdabilidade alta

» Intimamente relacionado ao alelo que desejamos selecionar

• OBS: Essas qualidades tornam mas eficientes a seleção indireta

• Os marcadores genéticos podem ser morfológicos e moleculares.

MARCADORES MORFOLOGICOS • Fenótipo de fácil identificação

• Normalmente determinada por único alelo.

• Exemplo 1: planta de milho jovem verde clara x esterilidademasculina ( fenótipo importante na produção de híbrido mas dedifícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem altadifícil identificação = estão em lócus bastante próximos e tem altaprobabilidade de serem herdados juntos)

• Exemplo 2: cor amarela do milho x teor de vitamina (o mesmoalelo para ambas características: mais fácil selecionar pela cor)

• Limitação dos marcadores morfológicos:• Ocorrência em número reduzido• Muitas características de interesse econômico não tem marcador morfológico• Muitos marcadores que apresentam baixa herdabilidade

Marcadores moleculares

• O que seriam marcadores moleculares?

São alterações encontradas na sequência de

aminoácidos de uma proteína ou do próprio DNA,aminoácidos de uma proteína ou do próprio DNA,

que podem alterar uma determinada

característica em alguns indivíduos de uma

população

Marcadores moleculares

• Características de DNA que diferenciam doisou mais indivíduos e são herdadasgeneticamente.

• Os tipos de marcadores diferenciam-se pelatecnologia utilizada para revelar variabilidadedo DNA.

Marcadores moleculares

• Marcadores de proteínas ( Produtos direto dos alelos);

• Marcadores que utilizam o próprio DNA (são os • Marcadores que utilizam o próprio DNA (são os próprios genes ou seqüências de DNA situadas próxima ao gene de interesse):

» RFLP

» PCR

» AFLP

» Microssatélites

Marcadores de proteínas -bioquímicos

• Mais comuns: isoenzimas ( esterases, fosfatases, peroxidases...)

• Procedimento consiste na extração e identificação da proteína.

• Exemplo: Cevada izoenzima esterase x resistência um • Exemplo: Cevada izoenzima esterase x resistência um virus ( seleção indireta)

• Vantagem:– menor custo– Codominância: identifica homozigotos e heterozigotos

• Limitações:– Reduzida variabilidade– Marcadores em número reduzido

Marcadores que utilizam o próprio DNA

• São os próprios genes ou seus vizinhos, isto é seqüências de DNA situadas próxima ao gene que se deseja marcar

• Vantagens;Vantagens;• Grande variabilidade entre indivíduos

• Numero de marcadores suficientes para marcar todos os alelos de todos os genes que se deseja marcar.

• Desvantagens:• Técnicas laboratoriais mais caras, que os bioquimicos e os

morfológicos

Marcadores moleculares princípio de funcionamento

� O princípio básico envolvido na obtenção e detecção dosmarcadores bioquímico e molecular reside na utilização daELETROFORESE

� Seu princípio é simples: moléculas de carga negativa migram parao pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para oo pólo positivo, e moléculas com carga positiva migram para opólo negativo

� A técnica de PCR (Polimerase Chain Reaction ou Reação emCadeia de Polimerase), a qual muito marcadores moleculares sãoderivados e consiste na amplificação enzimática direcionada por“primers” (iniciadores) de um DNA (PCR), é um método in vitroque sintetiza milhões de cópias de uma seqüência nucleotídicaem poucas horas

Técnica de PCRReação em Cadeia de Polimerase

• Técnica que replica milhões de vezes umfragmento de DNA, possibilitando a suadetecção e análise.

• Extração do DNA

• Vários protocolos

• Kits prontos

Algumas classes de marcadores moleculares

� RFLP (Restriction Fragmenth Lenght Polymorphism)

� RAPD (Random Amplified Polymorphism DNA)

� Microssatélites ou SSR (Sequence Simple Repeats)� Microssatélites ou SSR (Sequence Simple Repeats)

� AFLP (Amplified Frangment Lenght Polymorphism)

� SNP (Single-nucleotide polymorphism)

Os principais tipos de marcadores utilizadosatualmente em pecuária são:

• 1)Análise das variações no comprimento deregiões de DNA tipo Microssatélite (testes depaternidade e registro)paternidade e registro)

• 2)Painéis contendo diversos polimorfismos desítio único (SNP) (seleção e melhoramento)

RFLP (“Restriction Fragment Length Polymorphism”)Significa polimorfismo no comprimento de fragmentos derestrição (obtidos por corte de fita dupla de DNA).

Tome-se dois indivíduos distintos que têm o DNA extraído e

submetido a clivagem por enzima de restrição. O uso da técnica de

RFLP visa detectar diferenças na seqüência de DNA dos dois

indivíduos. Uma maneira de se fazer isto é sequenciar o DNA dos

dois indivíduos e comparar as seqüências obtidas.

• Admitindo-se que o fragmento de DNA identificado

pela sonda esteja intimamante ligado a um alelo de

interesse, pode-se selecionar esse alelo por meio

desse fragmento. Assim o fragmento RFLP funciona

como um marcador ou etiqueta do alelo de

interesse.

Usos marcadores RFLP

• Diversidade genética e identificação de paternidade

• Construção de mapas de ligação e mapeamento de QTLs

• Seleção assistida por marcadores (SAM)

RAPD-”Fragmentos de DNA amplificados ao acaso” ( Williams et al, 1990)

• Marcadores moleculares anônimos distribuídos pelogenoma;

• Utiliza “primers” curtos e de seqüências arbitrárias, com

seqüências alvo desconhecida;seqüências alvo desconhecida;

• Utiliza um “primer” único;

• Detecta polimorfismo em apenas um par de bases;

• Baseia-se na amplificação de DNA;

• Não Permite distinguir heterozigotos.

Microssatélites ou SSR

� Comportamento Mendeliano e consistem de trechos de DNA de unidades mono-, di-, tri-, tetra- ou penta-nucleotídica repetidas ao acaso, dispersas por todo o genoma eucarioto

� Os produtos da reação são separados em gel de � Os produtos da reação são separados em gel de poliacrilamida

� Vantagens (natureza multialélica, herança codominante; fácil detecção por PCR; quantidades mínimas de DNA)

� Desvantagens (custo final “primers informativos”)

Microssatélites

• Seqüências curtas (300 pb)

• Repetições em tandem (6 a 8 nucleotídeos = mais comuns TG/AC)

• Mais utilizada em mapeamento genético,• Mais utilizada em mapeamento genético,devido a sua grande varredura no genoma.

MÉTODO

� as sequencias que flanqueiam Regiões repetidas sãoamplificadas por um par de primers específicos (20 a30 bases) - complementares as seqüênciasmicrossatélites.

� Cada microssatélite –é um loco genético altamentevariável, multialélico.

� Separação por eletroforese (cada banda representa um alelo diferente do mesmo loco)

AFLP- Polimorfismo de comprimento defragmentos amplificados (Vos et al., 1995).

Técnica:• Clivagem do DNA genômico com duas enzimas derestrição• Ligação de adaptadores específicos aos terminais dos• Ligação de adaptadores específicos aos terminais dosfragmentos clivados•Pré-amplificação dos fragmentos,utiliza primersespecificos para cada adaptador mais uma base seletiva(Eco + A, M+C)• Amplificação seletiva utiliza primers específicos para oadaptador, sitio de restrição mais três bases seletivas• Eletroforese em gel de alta resolução

MARCADORES DERIVADOS DE SEQÜENCIAS EXPRESSASSEQÜENCIAS EXPRESSAS

Marcador molecular – SNP

� Polimorfismos de base única

� Correspondem a posições onde existe uma alternância dosnucleotídeos A, C, G e T, em uma freqüência alélica mínima de1% em uma dada população

� São polimorfismos estáveis

� A grande maioria é neutra

� Duas pessoas não relacionadas diferem em aproximadamente1 base a cada 1000. Do total de 3 bilhões de bases em seugenoma um indivíduo carregaria 3 milhões de SNPs.

SNP- Polimorfismo de um nucleotídeo

•Single Nucleotide Polymorphism ou Polimorfismos de Nucleotídeos Únicos

• Polimorfismo baseados na alteração de uma única base no genomano genoma

•Exemplo: AAGGTTA muda para ATGGTTA

Tipos mais comuns de SNPs:

•Transição: base púrica ésubstituída por outra púrica

A G T C

• Transversão: púrica substituída por pirimídica ou vice-versa : por pirimídica ou vice-versa : A C A TG C G T

•Podem ocorrer em regiões expressas e não expressas

• São estáveis do ponto de vista evolutivo

•SNP se ocorrer em pelo menos 1% da população

• Alta freqüência e distribuição no genoma:

Genoma humano: 90% polimorfismo – SNPs 1,42 milhãoMilho: 1SNP – 48pb (Regiões não-codificadoras)Total – 21.502 SNPsTotal – 21.502 SNPs

São encontrados no genoma em :•Haplogrupos: mutações que ocorrem próximas e são herdadasjuntasIndivíduo Seqüência encontrada Haplogrupo1 GATATTCGTACGGATGTATC AG2 GATGTTCGTACTGATGTATC GT•Individuais:

VANTAGENS

• Abundância no genoma

• Elevado grau de polimorfismo

• Detecção de diferentes alelos para genes de interesse

DESVANTAGEM

Sequenciamento de DNA em grande escala

Marcadores moleculares - aplicabilidade

� Caracterização de diversidade genética em populações

naturais e genótipos cultivados

� Sistemática e evolução (taxonomia molecular)

� Identificação de genes de interesse zootécnico

� Confecção de mapas genéticos

� Clonagem de genes e mapeamento

� Seleção assistida em melhoramento

� Diversidade genética e seleção de genitores

� Fingerprinting e proteção de cultivos

� Análise de pureza genética

� Mapeamento comparativo

Conclusão

As aplicações da biotecnologia na área animalsão múltiplas e estão em diferentes etapas dedesenvolvimento, algumas com problemastécnicos a serem solucionados e outras que jágeraram produtos que podem entrar no mercadogeraram produtos que podem entrar no mercadoou que já estão sendo comercializados. Oambiente é efervecente e fascinante e,certamente, contribuirá para a melhor qualidadede vida do homem.

Obrigado pela a atenção de vocês!!!vocês!!!