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CÁTEDRA

MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA

Guía de Trabajos Prácticos

BENINTENDE, S.; SÁNCHEZ, C., STERREN, M., MUSANTE, C. y CHAJUD, A.

Año Lectivo 2009

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS

FACULTAD DE

CIENCIAS AGROPECUARIAS

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TEORICO - PRÁCTICO UNIDAD 1: PRINCIPALES GRUPOS DE MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA AGRONÓMICA Introducción Bacterias, levaduras, hongos, algas, protozoarios integran un grupo de organismos que se asemejan entre sí por su tamaño pequeño y su sencillez de estructura y organización. A estos grupos de seres vivos, a pesar de pertenecer a categorías taxonómicas diferentes, se les denomina microorganismos, y son reagrupados para su estudio en la ciencia denominada Microbiología. El tamaño de los microorganismos además de incidir en su morfología, actividad y metabolismo, tiene consecuencias en sus intervenciones ecológicas y su manipulación en el laboratorio. Las células microbianas son de dos tipos diferentes. El tipo menos desarrollado es el de bacterias y cianobacterias que se denomina procariota. El tipo celular más desarrollado, eucariota, se halla en todas las demás formas biológicas: algas, protozoarios, hongos. Las bacterias típicas constituyen el grupo de organismos más abundantes de la naturaleza. Su tamaño varía entre 0,5 a 1 µm de ancho por 1 µm de largo, con forma variable. El número y actividad de las bacterias en un ambiente natural como suelo, leche, agua están afectados por las condiciones ambientales del hábitat en el que viven y las prácticas culturales. Los microorganismos eucariotas son seres vivos unicelulares o pluricelulares, pero nunca con diferenciación en tejidos (excepto en ciertos grupos de hongos), pudiendo ser coloniales, cenocíticos o miceliares, y cuyo pequeño tamaño obliga a emplear el microscopio para observarlos y analizar su estructura. El término algas se refiere a un conjunto grande y variado de organismos eucariotas que contiene clorofila y que llevan a cabo una fotosíntesis oxigénica. En contraste con las algas, los hongos carecen de clorofila. Es un grupo grande y variado de microorganismos eucariotas que se pueden agrupar en mohos, levaduras y setas. Los protozoos son microorganismos unicelulares que carecen de pared celular, y que por lo general son incoloros y móviles. Estos se distinguen de las bacterias por su tamaño mayor y su naturaleza eucariota. Normas de trabajo en el laboratorio de microbiología agrícola Para el trabajo en el laboratorio de microbiología es necesario tener en cuenta una serie de previsiones 1. Las guías de trabajos prácticos deben ser leídas atentamente antes de iniciado cada uno de los trabajos prácticos. Es necesario comprender los fundamentos que se tratan de poner de relieve con cada unos de los pasos a seguir. 2. Las operaciones efectuadas en microbiología: siembras, diluciones, aislamientos, repiques, etc. se realizan de forma que se evite toda posible contaminación. Trabajar en la zona de esterilidad que genera el mechero. 3. Antes de iniciar la actividad práctica y al finalizar la misma limpiar la superficie de la mesada con solución germicida. 4. Mantener la mesa libre de todo elemento que no sea imprescindible. 5. Deberá anotarse cuidadosamente toda la información de las observaciones de cada uno de los trabajos prácticos que se desarrollen. 6. Al final del trabajo práctico dejar ordenada la mesada. El material utilizado deberá lavarse con agua de canilla y enjuagado con agua destilada. Poner el material de vidrio utilizado en bandejas destinadas para este fin. Mantener el orden y la limpieza del laboratorio.

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7. Dar cuenta al docente de cualquier accidente tales como cortaduras, quemaduras o derramamiento de cultivos. Tomar todas las precauciones posibles para evitar estos accidentes.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 1 NORMAS GENERALES PARA LA PRÁCTICA EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE MICROORGANISMOS DE IMPORTANCIA AGRONÓMICA Objetivos

� Conocer las normas de manejo en el laboratorio de Microbiología Agrícola � Observar y reconocer los principales microorganismos de interés agronómico

Actividades 1. Observe los preparados de microorganismos proporcionados por la Cátedra utilizando el

microscopio óptico compuesto (ver práctico de microscopía Cátedra Biología) 2. Observe detenidamente las diferencias en lo que se refiere a: tamaño de células, tipo celular,

formas, agrupamientos y estructuras características. 3. Esquematice lo observado. 4. Indique el aumento empleado en cada observación.

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TEORICO - PRÁCTICO UNIDAD 7: ESTERILIZACION Esterilización se define como la destrucción o eliminación de cualquier forma de vida. Comprende aquellos tratamientos que dejan al objeto tratado libre de todo organismo vivo. Los métodos de esterilización pueden clasificarse de acuerdo al agente, ya sea físico o químico, que se emplee para eliminar los microorganismos.

MÉTODOS DE ESTERILIZACIÓN

a. Calor 1. Calor Seco 2. Calor Húmedo 3. Calor Directo b. Filtración c. Radiación d. Agentes químicos

Previo a la esterilización los objetos a esterilizar deben limpiarse y acondicionarse de manera adecuada. Limpieza y acondicionamiento del material a esterilizar Si bien en Microbiología Agrícola no se trabaja con microorganismos patógenos todo material sucio debe tratarse con precaución y en los casos de sospecha de presencia de patógenos se debe desinfectar antes de lavar. Es fundamental que todo el material de vidrio se lave y enjuague varias veces. La limpieza y desinfección del material sucio empleado en el laboratorio de microbiología debe ser tratado atendiendo las siguientes instrucciones. 1. Con precaución para evitar roturas. 2. Recogerlo en recipientes adecuados para su desinfección y posterior limpieza. 3. A las pipetas se las coloca en recipientes con solución desinfectante hasta el lavado. Previamente se les saca, valiéndose de un alambre, el trozo de algodón que ha actuado como filtro en el extremo superior. 4. Las cajas de Petri y los tubos de ensayo se destapan y se los coloca boca abajo, se los hierve en agua jabonosa a fin de que escurran todo el medio de cultivo que contienen. 5. Al material que tiene colorantes se lo separa del resto y se lo trata con soluciones especiales (HCl, HNO3 o mezcla sulfocrómica). El material propio del laboratorio de Microbiología Agrícola se presenta en la figura 1.

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Una vez limpio el material debe acondicionarse para que luego de la esterilización conserve esta condición hasta su uso. Las cajas de Petri se las envuelve en papel para. En el extremo superior de las pipetas se coloca un trozo de algodón que actúa como filtro y se las envuelve en papel en forma individual o se las coloca en estuches metálicos. A los tubos de ensayo se los tapa con tapones plástico autoclavables (tapones bacteriológicos) o con tapones de algodón. Métodos de esterilización Una vez que el material está limpio y acondicionado se procede a su esterilización. El método de esterilización que se empleará dependerá del material.

Caja de petri

Tubos de ensayo en gradilla

Figura 1. Materiales de laboratorio utilizados en el laboratorio de Microbiología Agrícola

Tubo de ensayo con medio de

cultivo

ansa en anillo espátula de

Drigalsky o “rastrillo”

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a.- CALOR Los objetos pueden ser esterilizados por calor seco en estufa, por calor húmedo que proporciona el vapor caliente en autoclave. La esterilización por calor seco requiere más tiempo e intensidad que la que utiliza calor húmedo por dos razones: - la conducción es más lenta y menos eficiente en el aire que en el vapor de agua - algunas bacterias pueden sobrevivir en estado de desecación. La estructura terciaria de las proteínas se estabiliza en parte por uniones puente hidrógeno entre restos de la cadena peptídica. Estas uniones pueden reemplazarse por uniones con moléculas de agua en un ambiente saturado de vapor de agua, lo cual facilita la desnaturalización de las proteínas. Esto explica por qué se requiere mayor temperatura para causar un daño irreversible cuando el material está seco que cuando está húmedo. Calor seco Se utiliza para esterilizar vidrios y materiales resistentes al calor. Los objetos envueltos en papel son colocados en estufa de esterilización (figura 2) a una temperatura de 170º C durante 90 minutos, observándose que el envoltorio de papel va adquiriendo un color ligeramente tostado al cabo del tiempo mencionado. La doble pared que tiene la estufa permite la circulación de aire caliente por formación de corriente convectiva. Calor Húmedo

Se utiliza para esterilizar soluciones acuosas como medios de cultivo, soluciones nutritivas y ciertos elementos que no resisten el calor seco, como ser portafiltros. El tratamiento se lleva a cabo en un autoclave (figura 3), en la que se genera un ambiente saturado de vapor de agua a una presión interna mayor que la atmosférica, lo que permite que la temperatura de ebullición del agua aumente. En el siguiente cuadro la presión es indicada como sobrepresión respecto de la presión atmosférica.

PRESION TEMPERATURA TIEMPO 1 atm 121ºC 15 min 3/4 atm 115ºC 20 min

Estas temperaturas sólo se logran en un ambiente saturado en vapor de agua por lo que al iniciarse la operación todo el aire debe ser expelido y reemplazado por vapor de agua. Si queda algo de aire, la presión parcial de vapor de agua será inferior a la que marca el manómetro y por lo tanto la temperatura lograda será inferior. Por eso conviene tener medidor de vapor de agua y temperatura independientes.

Figura 2 Estufa de

esterilización

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FUNCIONAMIENTO DEL AUTOCLAVE: Se coloca agua hasta el falso fondo (a) que se encuentra en su interior. Se coloca el material a esterilizar convenientemente preparado, se cierra la tapa (b) ajustando en cruz los tornillos (c) y se deja la espita (d) abierta. Se encienden los mecheros (e) y se calienta el autoclave hasta desprendimiento de vapor de agua en forma continua por la espita. Esto indica que todo el aire que contenía el autoclave ha sido eliminado, es decir que se ha “purgado” el aparato. Se cierra la espita. Se observa en el manómetro el aumento de presión, hasta que llega a la presión escogida a partir de la cual se controla el tiempo de esterilización. Luego se cierra la fuente de calor y se deja enfriar (el manómetro vuelve a cero). Recién ahora se puede abrir la espita y luego la tapa.

. Un caso del empleo del calor húmedo es el procedimiento conocido como tindalización. La tindalización es una forma de esterilización por autoclave que se aplica a soluciones que contengan sustancias que son afectadas por el calor (termolábiles). Por ejemplo la leche, cuyo azúcar la lactosa, se carameliza a 100ºC, a la vez que las proteínas se desnaturalizan. La tindalización consiste en el calentamiento discontinuo en autoclave a vapor fluente, es decir con la espita abierta. De esta manera la presión interna es igual a la atmosférica y la temperatura no supera los 100ºC. Esto se realiza durante 30 min. y en 3 días consecutivos. Estos lapsos de 24 h. permiten a las esporas germinar y luego estas células son destruidas en el siguiente calentamiento. Calor Directo Esta forma de esterilización consiste en exponer directamente el objeto a la acción de la llama como por ejemplo: esterilización de ansas (calentamiento al rojo), bocas de tubos (flameado) esterilización de morteros (alcohol encendido). b.- FILTRACION Se emplea para aquellas sustancias que son alteradas por el calor en sus estructuras y características físicoquímicas. Por ejemplo: sueros, soluciones de enzimas, toxinas bacterianas, etc. Este método es muy usado en la industria farmacológica. Los filtros pueden ser de porcelana, yeso, vidrio incrustado, siendo los más comunes los de membrana formado por una película de celulosa (figura 4)

Figura 3. Autoclave

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Los filtros se ubican en un portafiltros y la filtración se realiza por succión y succión más presión. Las bacterias son eliminadas de las soluciones debido al efecto de colador por el tamaño de los poros y por la adsorción a las paredes de estos por las diferencias de cargas eléctricas con los microorganismos.

Figura 4. Filtro de membrana

c.- RADIACION La región ultravioleta del espectro, entre 2400 a 3000 Aº, es la que tiene mayor acción sobre los microorganismos. El ADN tiene un pico de absorción a los 2650 Aº, y el efecto principal de la radiación sobre el material genético es que provoca la unión entre bases de pirimidina adyacentes y así se interfiere con la correcta replicación y función de la molécula de ADN. La consecuencia es que la célula bacteriana pierde la capacidad de dividirse. Este método de esterilización es empleado para desinfección de aire o superficies debido a que las radiaciones UV no tienen poder de penetración. Para emplear este método se utilizan lámparas germicidas. Otro tipo de radiaciones utilizadas son las radiaciones ionizantes que incluyen rayos de longitud de onda corta (rayos X, rayos cósmicos y rayos gamma). En contraste con la radiación UV, las radiaciones ionizantes penetran fácilmente a través del vidrio y de otros materiales, pero por ser más peligrosas y menos asequibles tienen un uso restringido como agente esterilizante. d.- AGENTES QUIMICOS Definiciones importantes El término compuesto antimicrobiano es usado para designar a cualquier sustancia capaz de destruir o inhibir el desarrollo de microorganismos. Las sustancias antimicrobianas pueden clasificarse de la siguiente manera: Germicidas: son sustancias que provocan la destrucción de las células vegetativas y las esporas de los microorganismos.

Filtro de membrana

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Cuando un germicida es específico para bacterias u hongos se los designa bactericidas o fungicidas respectivamente. Germistáticos: son sustancias que impiden el desarrollo de microorganismos muchos de los cuales mueren pero algunos quedan en vida latente pudiendo multiplicarse nuevamente cuando la acción del agente disminuye por cualquier razón. Cuando son específicos para bacterias u hongos se los llama bacteriostáticos y fungistáticos respectivamente. Antibióticos: son sustancias de acción germicida o germistática producida por ciertos microorganismos, o bien sintetizados en laboratorios especializados. Mecanismos de acción de las sustancias antimicrobianas Las células microbianas pueden ser inactivadas o desorganizadas de maneras muy diferentes. Algunos de los mecanismos de acción antimicrobiana son: a- Destrucción o alteración de estructuras celulares: como la pared celular, membrana celular (alterando la permeabilidad selectiva), proteínas (algunas sustancias actúan precipitándolas), ácidos nucleicos. b.- Inactivación de reacciones enzimáticas: como aquellas que inhiben la síntesis de la pared celular, la síntesis de ADN y ARN. Factores que influyen sobre la acción de compuestos antimicrobianos Tiempo: Una sustancia antimicrobiana debe estar en contacto con el material a desinfectar por un período de tiempo adecuado. La muerte de los microorganismos es un fenómeno gradual: la mayoría muere rápidamente y otros tienen mayor resistencia. Concentración: Los agentes químicos no tienen efecto mientras su concentración no llega a un determinado valor. Aumentándola gradualmente se observa primero un efecto germistático y luego germicida. Temperatura: La eficiencia en general aumenta con la temperatura. Humedad: La presencia de agua facilita la penetración del antimicrobiano a la célula. Naturaleza del medio: La presencia de materia orgánica en el medio disminuye la acción de los antimicrobianos porque actúa protegiendo al microorganismo. Naturaleza del microorganismo: Los microorganismos que tienen alguna forma de resistencia (bacterias que tienen cápsulas) son menos afectados por los antimicrobianos. Compuestos antimicrobianos empleados � Cationes inorgánicos: Las sales de Hg, Ag y Cu son usadas comúnmente como germicidas y germistáticos. Por ejemplo el SO4Cu es usado para impedir el desarrollo de algas o mezclado con Ca(OH)2 (Caldo Bordelés) para el control de hongos en agricultura. � Álcalis y detergentes: La acción de los álcalis se debe a la elevada concentración de OH-. Por ejemplo el HONa es usado para lavar tachos de leche, instalaciones de fábrica de productos lácteos etc. Los detergentes tienen la propiedad de limpiar superficies sucias mediante una acción mecánica de arrastre, inhiben mecanismos enzimáticos, además disminuyen la tensión superficial favoreciendo el ingreso de sustancias en los poros. Pueden ser: aniónicos, catiónicos y no iónicos. � Acidos inorgánicos y orgánicos: La acción de los ácidos minerales fuertes (FH) se basa en la acción de los iones H+. La acción de los ácidos orgánicos puede deberse a varios factores: bajo pH, acción de la molécula disociada o no disociada. Entre estos podemos mencionar: ácidos acético, propiónico, butírico, sórbico. � Alcoholes: El etanol es una de las sustancias más extensamente empleadas en el control de microorganismos. Utilizado al 70% aumenta su poder de penetración.

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� Fumigantes: son sustancias antimicrobianas usadas en forma gaseosa. Ej: óxido de etileno, bromuro de metilo, formaldehído, etc. � Halógenos y compuestos halogenados: Entre ellos los más empleados son Cl e I. Cloro: es usado en potabilización de aguas. Para uso corriente es empleado bajo la forma de hipoclorito de Na o Ca. Iodo: empleado en desinfecciones cutáneas. � Sustancias oxidantes: Es el caso del agua oxigenada que se emplea para desinfecciones cutáneas, cuya acción disminuye con la presencia de materia orgánica. � Fenol: su acción bactericida está basada en la actividad sobre proteínas. Se emplea en desinfección de instrumentos de laboratorio, recipientes de basura, etc. Bibliografia BIDOU, D y GRUPILLO, J. Fundamentos y Técnicas de esterilización. Editorial Médica Panamericana. 1977. BROOK, T. Biología de los microorganismos. 6ta ed. Omega S.A. Barcelona. 1991. SEELEY, H. y DEMARK, P. Microbios en acción. Manual de laboratorio de microbiología.

Ed.Blume. España. 1973.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 2 RECONOCIMIENTO DEL MATERIAL EMPLEADO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA. PREPARACIÓN DEL MATERIAL DE LABORATORIO PARA SU ESTERILIZACIÓN Objetivos � Reconocer el material de laboratorio y los elementos de limpieza empleados. � Conocer los métodos de esterilización más usados en un laboratorio de Microbiología Agrícola. � Comprender los fundamentos físicos y químicos de los métodos de esterilización. � Desempeñarse con higiene y precaución en el ámbito del laboratorio.

Actividades El práctico consistirá en el reconocimiento y acondicionamiento del material de vidrio que se utiliza en la rutina del laboratorio de Microbiología Agrícola.

a. Cajas de petri 1. Se pueden acondicionar en unidades individuales o en grupos de 2 o 3 cajas. 2. Se toma una hoja de papel de diario cuyo tamaño sea aproximadamente dos veces el tamaño de la caja de petri. 3. Se extiende el papel sobre la mesada y se coloca sobre el mismo la caja observando que la base de la misma quede hacia arriba. 4. Se envuelve la caja haciendo una muesca o doblez con el papel sobrante de la envoltura. 5. Se pliegan los extremos hacia el lado de la tapa.

b. Pipetas 1. Antes de proceder a su acondicionamiento se coloca un filtro de algodón en la boquilla con ayuda de un clip. 2. Cortar tiras de papel de diario de aproximadamente 6 cm de ancho. 3. Sobre la mesada colocar la pipeta sobre el papel en forma cruzada y envolver. 4. Plegar los extremos. 5. Hacer una flecha sobre el papel, indicando el extremo inferior de la pipeta y anotar el volumen de la misma.

c. Tubos de ensayo Confeccionar los tapones: 1. Tomar tiras de algodón 2. Plegar el algodón sobre si mismo de manera que se forme un tapón de aproximadamente 2,5 cm y de ancho que ajuste a la boca del tubo de ensayo. 3. Disponer los tubos en cestillas para su posterior esterilización.

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TEÓRICO - PRÁCTICO UNIDAD Nº 8: MEDIOS DE CULTIVOS Introducción Cualquier ser vivo, por su actividad vital (crecimiento, mantenimiento, reproducción) requiere continuos aportes de energía para reponer las pérdidas y para que todo su sistema pueda funcionar. La nutrición es el proceso por el cual los seres vivos toman del medio en el que habitan las sustancias químicas necesarias para crecer. Se denomina medio de cultivo al conjunto de sustancias nutritivas que permiten el crecimiento y multiplicación de los microorganismos. Para construir un medio de cultivo para un organismo o grupo de organismos deben conocerse las necesidades de los mismos. Las células microbianas pueden tener entre un 80 a 90% de agua. Su composición elemental, en base seca, está constituida por un 50% de C, mientras que el otro 50% se distribuye en elementos tales como O, N, H, P, S, K, Ca, Mg, Fe. Constituyentes de los medios de cultivo

Carbono (C): Este elemento aporta a los microorganismos esqueletos carbonados, de su catabolismo obtienen energía para su crecimiento y multiplicación. Puede ser suministrado a través de diferentes fuentes, las orgánicas como los hidratos de carbono (lactosa, sacarosa, maltosa, dextrosa, xilosa, manita, almidón, etc.), aminoácidos (aa), ácidos orgánicos, etc. La fuente inorgánica de C es el CO2.

Nitrógeno (N): Puede encontrarse en la naturaleza tanto en forma orgánica como inorgánica. En el primer caso los microorganismos lo obtienen de la descomposición y mineralización de aa y bases nitrogenadas y en el segundo caso se pueden suministrar como sales inorgánicas: NO3K, (NH4)2SO4. El nitrógeno gaseoso (N2) sólo sirve como fuente para las bacterias fijadoras de este elemento: Bradyrhizobium, Azotobacter, Anabaena, etc. Muchos medios de cultivo presentan en un solo compuesto las fuentes de nitrógeno y carbono; como aquellos que contienen peptonas, aminoácidos, o algunas proteínas como la caseína, etc.

Sales minerales: Son fuente de cationes y de aniones. Todas las bacterias necesitan captar una serie de elementos químicos que se pueden clasificar según las cantidades en los que son requeridos en macroelementos (K, Na, S, P, Ca, Fe) y microelementos (Mn, Zn, Co, Cu, Ni).

Factores de crecimiento: Son aquellos elementos esenciales para el desarrollo de los microorganismos, y que estos no los pueden sintetizar a partir de compuestos más simples. Ej.: vitaminas (biotina, tiamina, niacina), coenzimas, aminoácidos (arginina, asparagina, cisteína).

Indicadores de pH: Cumplen la función de visualizar fácilmente si en un medio hay o no crecimiento, o si acidifica o basifica el medio. Ej: azul de bromotimol, rojo neutro, rojo de fenol, púrpura de bromocresol, etc. Clasificación de los medios de cultivo Los medios de cultivo se clasifican de la siguiente manera:

De origen animal: leche, carne. naturales De origen vegetal: mosto de malta, agua de levadura,

papa, zanahoria, interiores de frutos.

Químicamente definidos: medios para nitritadores, Azotobacter, Czapeck’s.

Por su composición

artificiales: Mixtos: constituidos por sustancias químicamente definidas y sustancias naturales, como por ejemplo levadura glucosada, agar papa glucosado, caldo extracto de carne, caldo nutritivo, etc.

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generales: Son aquellos en cuales hay desarrollo de la flora microbiana mas variada. Ej.: agar nutritivo standard (ANS), agar papa glucosado (APG), caldo nutritivo.

diferenciales:

Son aquellos que debido a su composición química le dan características especiales a los diferentes géneros bacterianos por el aspecto de sus colonias. Ej.: PEMBA, Rojo congo, agar nutritivo almidón, medio tetrazolio (permite distinguir Pseudomonas solanacearum).

Por su función

selectivos

Son complejos, y sirven no solo para diferenciar entre géneros, sino que además tienen acción selectiva sobre otros microorganismos. Ej.: caldo nutritivo con ClNa 10%, agar nutritivo tamponado a pH 5.

Para hacer selectivo un medio de cultivo se puede proceder de la siguiente manera:

• Aportando los compuestos nutritivos que un determinado microorganismo necesita y no los que requieren otros.

• Inhibiendo el desarrollo de algunos microorganismos no deseados, a través del pH, que limite su desarrollo, o incorporando sustancias inhibidoras, como por ejemplo colorantes (eosina, azul de metileno), metales pesados (bismuto), agentes antimicrobianos (vancomicina, neomicina, cloranfenicol), sustancias químicas (sales en concentraciones que inhiben el desarrollo). Factores ambientales Además de los nutrientes apropiados es indispensable que los factores ambientales se ajusten apropiadamente a cada organismo cultivado. El establecimiento de un pH óptimo y su mantenimiento durante el crecimiento es de gran importancia, sobre todo para aquellos microorganismos que a pesar de producir ácidos no los toleran. De acuerdo a su pH óptimo los microorganismos se clasifican en: � Acidófilos: Dentro del pH 3.5 a 5.5 se encuentra la gran mayoría de los microorganismos. Ej.: hongos y levaduras, bacterias lácticas y acéticas. � Neutrófilos: Desarrollan dentro del rango de pH 6.5 a 7.5. Ej.: Bacillus, Azotobacter. � Basófilos: El pH óptimo de crecimiento y desarrollo es mayor a 7.5. Ej.: nitritadores, Micrococcus ureae, Bacillus pasteurii, Sarcina urea. Preparación de los medios de cultivo En general los requerimientos de nutrientes de los organismos son los mismos, la principal diferencia entre ellos radica en que algunos microorganismos requieren determinados nutrientes en forma específica. Se han proporcionado diferentes recetas de medios de cultivo en las que se presta atención a los aspectos de la nutrición del organismo que se cultiva. Los medios de cultivo se pueden preparar adicionando cantidades precisas de sustancias inorgánicas y/u orgánicas puras al agua destilada siguiendo un protocolo de preparación. Sin embargo muchos laboratorios comerciales dedicados al abastecimiento preparan medios de cultivo deshidratados que pueden reconstituirse al añadir H2O destilada (medios preformulados). Cuando se prepara un medio de cultivo es necesario tener en cuenta algunos aspectos tales como los que se mencionan a continuación. . Ajuste de pH Cuando se construye un medio de cultivo, se debe llevar el pH al óptimo para el desarrollo del microorganismo que nos interesa.

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Para ello el pH se corrige adicionando soluciones ácidas o básicas de acuerdo al punto al que deseemos llegar. Los medios de cultivo preformulados generalmente tienen un pH ajustado. . Solidificantes usados Los medios de cultivo se pueden preparar para ser usados en estado líquido o en estado de gel (semi-sólidos). Un medio de cultivo líquido es convertido en estado semisólido si se le añade un agente gelificante. Los medios de cultivo que contienen agentes gelificantes se pueden utilizar en placas de petri, donde las células microbianas pueden crecer y formar masas visibles llamadas colonias. � Agar: es un poligalactósido extraído de algas marinas, fluidifica a 85ºC. No modifica

sensiblemente el pH de los medios y no es atacado por la mayoría de los microorganismos. � Gelatina: es una sustancia proteica extraída de los huesos de pescado. Fluidifica a 28ºC y

solidifica a 20ºC. Es atacada por microorganismos proteolíticos. Su poder gelificante puede disminuir con pH inferior a 5.0 o cuando se calienta a mas de 100 ºC. Se emplea al 10 o 15 %. � Silicogel: es un gel acuoso del ácido silícico. Como está exento de materia orgánica se utiliza

para hacer medios estrictamente selectivos. Es muy empleado en microbiología del suelo. . Distribución en tubos Tubos en estría o pico de flauta: llevan de 7 a 8 ml de medio solidificable. Luego de ser esterilizados se los deja enfriar inclinados. Uso: para mantenimiento de cepas.

Tubos en punción: llevan de 10 a 15 ml de medio solidificable. Se dejan enfriar en forma vertical. Uso: para preparar cajas de petri, siembra en profundidad para microorganismos anaerobios facultativos.

. Esterilización de los medio de cultivo Antes de utilizar un medio de cultivo deben excluirse los organismos no deseados o contaminantes. Por consiguiente se debe esterilizar el medio de cultivo enseguida de su preparación. La forma más común es por calor utilizando el autoclave tal como se vio en el Trabajo Práctico Nº 2. Bibliografía BROCK, T. & M. MADIGAN. Microbiología. 6ta Edición. Prentice Hall Hispanoamérica S. A. México. 1993 STANIER, R. et al. Microbiología. Traducción de la 5ta Edición. Revert,. España. 1986.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 3 PREPARACIÓN Y DISTRIBUCIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO LÍQUIDOS Y AGARIZADOS Objetivos � Comprender el rol de los medios de cultivo en el estudio de microorganismos. � Identificar y reconocer las funciones de los constituyentes de los medios de cultivo. � Adquirir habilidad en la preparación de medios de cultivo.

Actividades El desarrollo del presente trabajo práctico estará basado en la preparación de algunos de los medios de cultivo utilizados durante el cursado de la asignatura.

1. Preparación de medios de cultivo preformulados a. Leer las instrucciones del marbete b. Calcular la cantidad de preformulado necesaria para la cantidad de medio de cultivo indicada c. Pesar la cantidad de medio de acuerdo al volumen a preparar d. Colocar en un recipiente de tamaño mayor al volumen a preparar e. Controlar el pH según indicación del marbete f. Si es preciso repartir en recipientes más pequeños será necesario disolver el agar en “baño

maría” o microondas para lograr una distribución uniforme del solidificante.

2. Construcción de medios de cultivo a. Leer el protocolo de preparación del medio de cultivo. (Ver Anexo) b. Calcular la cantidad de cada uno de los constituyentes necesaria para la cantidad de medio de cultivo indicada. c. Pesar los constituyentes de acuerdo al volumen a preparar. d. Colocar en un recipiente de tamaño mayor al volumen a preparar. e. Agregar un volumen de agua menor al calculado. No agregar el agar agar. f. Mover suavemente el recipiente para que se disuelvan las sustancias. La solución deberá ser clara. g. Llevar a volumen. h. Medir el pH y ajustar si es necesario utilizando HCl o OHNa i. Agregar el agar agar. El agar se disolverá calentando a baño de María o en microondas. j. Si es preciso repartir en recipientes más pequeños será necesario disolver el agar para lograr una distribución uniforme del solidificante.

3. Distribuir según las especificaciones del docente. 4. Acondicionar los recipientes para su esterilización, utilizando tapones y envolturas

apropiadas. 5. Analizar la constitución de los medios de cultivo. Evaluar las características de cada uno de

los medios de cultivo empleados en Microbiología Agrícola y en asignaturas afines.

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TEÓRICO PRÁCTICO UNIDAD Nº 9: CULTIVO DE MICROORGANISMOS. MÉTODOS DE SIEMBRA

Introducción La siembra o inoculación constituye una actividad de rutina en la práctica microbiológica, y consiste en introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio, con el fin de iniciar un cultivo microbiano. En este medio se deben encontrar los elementos necesarios para que los microorganismos lleven adelante sus actividades metabólicas y respiratorias, en condiciones adecuadas de temperatura y concentración de O2 o CO2. Ello se logra artificialmente utilizando los medios de cultivo, los que una vez sembrados se llevan a estufa para mantenerlos a la temperatura que permite el desarrollo y la multiplicación de los microorganismos. Según los objetivos que se persigan, es posible diferenciar dos tipos de siembras: � Métodos de siembra destinados al recuento de microorganismos cuando es necesario conocer la carga microbiana de un medio (leche, suspensión de suelo, cultivo líquido de microorganismos) � Método de siembra destinado a aislamiento cuando es necesario separar un microorganismo a partir de una población que puede contener varios tipos. Métodos de siembra destinados al recuento de microorganismos Las siembras para recuentos son aplicadas en la medición del crecimiento de los microorganismos, entre otros fines. Si bien la medición del crecimiento se puede hacer por varios métodos, en el presente práctico se hará especial hincapié en las determinaciones cuantitativas basadas en el recuento microbiano. En estos casos el contenido microbiano de un medio (leche, agua, suelo, alimentos, etc.) es de varios millones por gramo o mililitro de inóculo, y los recuentos en placa permiten la determinación de los microorganismos presentes en una muestra sobre la base de que se desarrollen en un medio de cultivo apropiado, en placa, formando colonias. Es decir, que en medio sólido cada viable dará origen a una colonia, de manera que se determinan por este método sólo las células microbianas viables en las condiciones de trabajo (nutrientes, temperatura, atmósfera). El método involucra, como primer paso, la dispersión de la muestra a contar, usando diluciones decimales de la muestra, tal como se muestra en la figura 5 , con el objetivo de obtener concentraciones apropiadas de células bacterianas en las placas, evitando obtener tanto placas repletas de colonias, como placas sin ninguna colonia, ya que ambos casos serían inútiles para el proceso de conteo.

Figura 5. Procedimientos para recuento de viables utilizando diluciones seriadas de la muestra.

O,1 gr o ml de la muestra por ml de dilución

Muestra para recuento

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Para hacer una dilución decimal (10-1), se mezcla 1 ml de la muestra con 9 ml del diluyente, o 0,5ml de la muestra con 4,5 ml de diluyente. Si se necesita una dilución centésima (10-2) se realiza una dilución decimal siguiente a la 10-1. En la mayoría de los casos se necesitan estas diluciones seriadas para lograr la dilución final deseada. Durante la ejecución es importante que se utilice una pipeta diferente para cada dilución, aún cuando sea de la misma muestra. Esto se debe a que la muestra inicial, que contiene la mayor cantidad de organismos, no expulsó a todos los organismos de la pipeta al expulsar el contenido de ésta. Los organismos que se adhieren a las paredes de la pipeta pueden ser arrastrados fuera en diluciones posteriores y ocasionar un serio error en la cuenta final. En el recuento en placa como las colonias pueden originarse tanto de una célula como de un grupo de células, se utiliza el término unidades formadoras de colonias (u.f.c.), y a los efectos de que todas las células que queden en una placa tenga una adecuada disponibilidad de nutrientes, y que los errores del método sean menores, se establece que las condiciones óptimas de conteo se dan cuando desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa, como lo muestra la figura 6.

Figura 6. Selección de placas para recuentos de unidades formadoras de colonias.

Hay dos formas de hacer la siembra de microorganismo para realizar un recuento en placa: el método de siembra en placa por extensión y el método de siembra incorporado (figura 7). En el método de siembra en placa por extensión se deposita en la superficie de las placas que ya contienen el medio de cultivo 0,1 ml de cada dilución. Luego de realizada la descarga de la muestra, se procede a extenderla sobre toda la superficie de las placas, usando un rastrillo estéril. Es importante que la superficie de la placa esté seca de modo que el líquido que se extienda se embeba. En el método de siembra incorporada o por inclusión se procede a depositar 1 ml de cada dilución en placas estériles, vacías y por duplicado. Posteriormente se agrega a cada placa 15 a 20 ml de medio de cultivo a emplear, previamente fundido y termostatizado a 45 ºC en baño de maría. Se agita moviendo la placa tapada sobre la superficie de la mesa con movimiento circular. Así, la muestra se mezcla con el medio de agar.

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Figura 7. Métodos para realizar el recuento en placa: a) en placa extendida; b) siembra por inclusión.

En cualquiera de los casos luego de la siembra es necesario llevar las placas a estufa para permitir el crecimiento de los microorganismos. Luego del tiempo de incubación en estufa se retiran las placas y se cuentan las colonias desarrollas por placa. Para calcular en número de microorganismos presentes en la muestra inicial es necesario hacer un promedio de las repeticiones de la dilución sembrada y se corrige el valor obtenido por un factor que contempla la dilución en la que se hace el recuento y el volumen sembrado. Método de siembra para aislamiento En el hábitat natural, raramente se encuentra a los microorganismos en forma pura (un solo tipo de microorganismo), y el tamaño de las células es tan pequeño como para permitir que se las tome individualmente. Ello obliga a disponer de un procedimiento que permita separar los diferentes tipos de microorganismos de una población mixta. El tipo de siembra que se aplica con este fin se denomina siembra para aislamiento por estría. En estos casos las células son separadas por agotamiento, al realizar estrías sobre la superficie del agar. El inóculo inicial tiende a diluirse progresivamente con cada sucesiva estría. Luego se incuban las placas en estufa para su desarrollo. Transcurrido el período de incubación se observa que las estrías iniciales proporcionan un crecimiento confluente, y a lo largo de las últimas estrías se van desarrollando colonias bien aisladas. Si se desea mantener el microorganismo aislado y su descendencia se hace un segundo tipo de siembra denominado repique, con el objetivo de conservar el microorganismo a través del tiempo. Este cultivo constituido por una sola clase de microorganismo se denomina cultivo puro, a partir del cual se pueden hacer diferentes estudios tales como pruebas bioquímicas, morfología, coloración, análisis genéticos, identificación taxonómica, etc. (figura 8).

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Figura 8. Método de siembra por estría para obtener cultivo puro: a) se toma del tubo con ansa el inóculo a sembrar; b) se

hacen estrías en una placa estéril de agar; c) apariencia de la placa estriada después de la incubación.

Bibliografía BROCK, T. & M. MADIGAN. Microbiología. 6ta Edición. Prentice Hall Hispanoamérica S. A. México. 1993

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 4 SIEMBRA EN MEDIOS DE CULTIVO SÓLIDOS Objetivos � Diferenciar los tipos de siembra y su aplicación práctica. � Desarrollar habilidades en la realización de las técnicas de siembra utilizadas en Microbiología.

Actividades Se dispondrá de una muestra a partir de la cual se realizarán los diferentes métodos de siembra, teniendo en cuenta de realizar como paso previo la preparación de las diluciones.

a. Preparación de las diluciones 1. Acondicionar la zona de trabajo esterilizando la mesada y prendiendo el mechero. 2. Preparar a partir de la muestra las diluciones seriadas partiendo de la muestra para la primer dilución. Realizar las diluciones sucesivas tomando 0,5 ml de muestra y trasvasarlo a 4,5 ml de diluyente. 1. Luego de preparada la dilución descartar inmediatamente la pipeta. 2. Cada vez que se prepare la dilución agitar con agitador vórtex. 3. Una vez preparada las diluciones sembrar dentro de los 15 minutos.

b. Siembra en placa extendida para conteo de microorganismos 1. Antes de preceder a la siembra rotular la base de las placas con los datos de la comisión. 2. Depositar 0.1ml de la dilución sobre la superficie de la placa que ya contiene el medio de cultivo. Se realizan duplicados para cada dilución. 3. Se comienza a sembrar por la mayor dilución y se emplea la misma pipeta para todas las diluciones 4. Extender el contenido depositado sobre toda la superficie de la placa con la ayuda de un rastrillo de vidrio o espátula de Drigalsky, en el mismo orden que la siembra. 5. Llevar a estufa por 48 hs., invirtiendo las placas. 6. Luego de la incubación elegir una dilución en la cual contar y afectar el resultado por la dilución correspondiente y el volumen sembrado.

Número de

colonias

Promedio Dilución

seleccionada Volumen sembrado

ufc por ml/g

Muestra

c. Siembras para el aislamiento de microorganismos 1. Cargar el ansa en anillo con el inóculo de la muestra. 2. Hacer estrías paralelas en la cuarta parte de la superficie de la placa. 3. Esterilizar el ansa. 4. Con el ansa fría se gira la placa 90º y se vuelve a estriar tocando 3 a 4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. 5. Se repite el procedimiento hasta agotar la superficie de la placa. 6. Llevar a estufa y luego de incubar las placas observar el desarrollo microbiano.

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TRABAJO PRÁCTICO Nº 5 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE SUELOS Objetivos � Comprender la importancia de los microorganismos del suelo y analizar el efecto de los

factores ecológicos sobre el desarrollo de los mismos. � Conocer algunos de los diversos enfoques que se pueden plantear para el estudio de los

microorganismos del suelo. � Desarrollar habilidades en las técnicas relacionadas a microbiología del suelo.

Introducción El análisis microbiológico del suelo plantea problemas muy particulares, que derivan del hecho de que la población microbiana coloniza un medio ambiente extremadamente heterogéneo, que varía en sus condiciones físicas y químicas de un punto a otro. El análisis microbiológico tradicional, que estudia las especies en cultivo puro en laboratorio informa sobre la morfología y propiedades fisiológicas, pero debe ser completado con estudios ecológicos que son los que nos informan sobre la actividad real de una población en su ambiente natural, la que resulta de interacciones con otras comunidades y con su medio ambiente. El conjunto de condiciones ambientales va a determinar la naturaleza cuali y cuantitativa de la población microbiana, la que a su vez interactuará y modificará el medio en el que se desarrolla. Toma de muestras Las muestras a tomar deben estar compuestas por 10 submuestras como mínimo. Esto es importante debido a la distribución heterogénea de los microorganismos en el suelo. Los instrumentos empleados normalmente son: palas, barrenos, muestreadores, etc. Tratamiento de Muestras Preincubación de las muestras

Si no es posible trabajar con muestras frescas (inmediatamente traídas del campo) éstas pueden ser conservadas hasta su procesamiento. Las condiciones de almacenaje o conservación son decisivas al evaluar la población microbiana ya que se genera un nuevo ambiente al cambiar las condiciones de temperatura, humedad, etc. que afectarán la actividad de los mismos. Los métodos más comunes de conservación y almacenamiento son: secado al aire, conservación en frío (heladera) ó congelación (freezer). Las muestras que han sido conservadas por alguno de los métodos citados requieren un pretratamiento para restablecer la población de microorganismos. Este tratamiento que se denomina pre incubación consiste en la incubación de las muestras por 5-10 días a temperatura de 25 ºC y humedad óptima de 65 % de la capacidad de campo antes de realizar el análisis microbiológico. En este trabajo práctico no se realizará la pre incubación de las muestras sino que se trabajará con las muestras de suelo frescas. Ejecución del análisis microbiológico de suelo A cada grupo de trabajo se le asignará una muestra de suelo proveniente de una situación agronómica. Sobre las muestras de suelo se evaluará: 1. Población global de microorganismos a través de:

Actividad respiratoria: con esta técnica se evalúa el CO2 desprendido absorbido en un álcali y se lo cuantifica por retrotitulación.

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2. Grupos funcionales:

a. Grupo funcional relacionado al Ciclo del Carbono: Celulolíticos (C). Este grupo funcional lleva a cabo la descomposición de la celulosa y comprende una variedad de microorganismos como: bacterias aeróbicas y anaeróbicas, actinomicetes y numerosos hongos.

b. Grupo funcional relacionado al Ciclo del Nitrógeno: Nitritadores (N). La mineralización del N consiste en dos procesos: la amonificación de compuestos orgánicos y la nitrificación que consiste en la oxidación del amonio hasta nitrito y nitrato. En este trabajo práctico se evaluará el grupo funcional nitritadores.

Los dos grupos mencionados serán evaluados a través de la técnica del Número Más Probable (NMP). Los resultados obtenidos para cada una de las situaciones agronómicas asignadas a los grupos de alumnos se analizarán en relación a las características físico químicas de los suelos. Análisis de Trabajos Científicos Cada grupo deberá leer, analizar y exponer un trabajo científico de la temática asignado por el docente. Presentación de informe Se deberá presentar y aprobar un informe escrito con los resultados obtenidos que seguirá el formato de un trabajo Científico (Ver instrucciones en anexo). Bibliografía ALEF, K. & NANNIPIERI, P. Methods in applied soil microbiology and biochemistry. Academic Press. Great Britain. 1995. ALEXANDER, M. Introducción a la Microbiología del Suelo. AGT Editor. México. 1980. BLACK, C. EVANS, D. WHITE, J. Methods of soil analysis Part II. Chemical and

Microbiological properties. ASA. USA. 1965. FRIONI, L. Ecología microbiana del Suelo. Universidad de la República. Montevideo. 1990. FRIONI, L. Procesos microbianos. Tomos I y II. Editorial Universidad Nacional de Río Cuarto. 1999. JENKINSON, D. & POWLSON, D. The effects of biocidal treatments on metabolism in soil. A method for measuring soil biomass. Soil Biol. Biochem. Vol. 8 pp 209 to 213. Pergamon Press. 1976. PAUL, E. & CLARK, F. Soil Microbiology and biochemistry. Academic Press. 1989. TATE, R. Soil Microbiology. Wiley & Sons. USA. 1995.

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Técnicas a emplear Para realizar el análisis microbiológico de suelo las muestras se conservarán en heladera, una vez traídas del campo. No se realizará la preincubación. 1- Población global de microorganismos Actividad respiratoria a) Incubación 1. Pesar 50 gr. de suelo y colocarlo en recipientes con cierre hermético. Hacer 4 repeticiones. 2. Colocar en cada uno de los recipientes un vasito de precipitado con 25 ml. de OHNa 0,2 N. 3. Preparar un recipiente que se denominará blanco y que llevará todos los de reactivos pero sin suelo. 4. Incubar en estufa por 7 días a 25 ºC.

b) Evaluación del CO2 desprendido luego de la incubación 1. Se trasvasa el OHNa a un erlenmeyer de 125 ml. 2. Agregar 4 ml. de Cl2Ba. al 20 % y 2 a3 gotas de timolftaleína. 3. Titular con H2SO4 0,1 N hasta llegar al punto final.

c) Cálculos mg C-CO2 en la muestra = 25 ml(b) - x ml a * N a * 1,2

N b a = ácido; b = base 1. Promediar las cuatro repeticiones de mg C-CO2 de las muestra de suelo. 2. Calcular la cantidad de mg C-CO2 contenida en el blanco. 3. Restar al promedio de la muestra la cantidad encontrada en el blanco. 4. Llevar los resultados a 100 gr. de suelo seco.

NaOH H2O

H2O

MUESTRA SUELO

BLANCO

NaOH

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2- Grupos funcionales Aislamiento y recuento de Celulolíticos aerobios por la técnica del NMP a) Analizar la función fisiológica de los componentes del medio de cultivo. Medio de cultivo K2HPO4 1gr NaNO3 0,5 gr MgSO4. 7H2O 0,5 gr KCl 0,5 gr FeSO4. 7H2O 0,01 gr H2O destilada 1000 cc b) Realizar la preparación de diluciones de suelo (Ver TP Nº 4) para la siembra. 1. Pesar 10 gr. de suelo. 2. Colocar en erlenmeyer con 95 ml de agua estéril. 3. Agitar 10 min. 4. Dentro de los 10 min siguientes agitar a mano vigorosamente por unos segundos. 5. En ambiente estéril transferir 1 ml del centro de la solución a 9 ml de solución fisiológica. Así se obtiene la dilución 10-2. 6. Homogenizar 7. Diluir hasta la dilución 10-5. Siembra Se trabajará en ambiente estéril 1. Sembrar 1 ml en medio para celulolíticos. 2. Sembrar 3 tubos por dilución para las diluciones 10-2 a 10-6 incluidos. 3. Incubar en estufa los tubos a 28 ºC por 21 días.

Recuento de Celulolíticos por el método del NMP 1. Después del período de incubación observar si en los tubos hay desintegración de papel, cambio

de color, etc. en cuyo caso el tubo se considerará positivo. 2. Contar el número de tubos por cada dilución en la que existe crecimiento.

Determinación del Nº característico y cálculo del NMP de Celulolíticos por el método de Mac Grady La lectura de los resultados consiste en contar por cada dilución el número de tubos positivos. Por ej.:

Diluciones 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 Nº de tubos (+) 3 1 0 0 0

El número característico se lee así: 1. La última dilución donde todos los tubos o la mayoría son positivos es la primera cifra del número característico. Las dos siguientes son aquellas del número de tubos positivos para cada una de las diluciones siguientes. Ej. : 310 para la dilución 10-1. 2. Se busca en la tabla del NMP de Mac Grady (ver Anexo) el número más probable de gérmenes contenidos en el volumen sembrado de la dilución correspondiente a la primera cifra característica. Para el ej. : 310 corresponden a 4,5 gérmenes / ml de la dilución 10-1. 3. Llevar el número de gérmenes por gramo de suelo seco. En la figura 9 se muestra un esquema de un recuento de viables en medio líquido por la técnica del Numero Mas Probable.

- Controlar pH = 7,5. - Distribuir 9 ml por tubo. - Papel de filtro (tiras de 1 x 9 cm en cada tubo).

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Aislamiento y recuento de Nitritadores por la técnica del NMP a) Analizar la función fisiológica de los componentes del medio de cultivo. Medio de cultivo H2O destilada 1000 cc SO4 ( NH4 )2 0,5 gr K2HPO4 1,0 gr NaCl 0,3 gr Mg. SO4 7 H2O 0,3 gr Fe SO4 7 H2O 0,03 gr CaCO3 7,5 gr -Distribuir 3 ml por tubo

Siembra Se trabajará en ambiente estéril. 1. Sembrar 0,5 ml. en medio para Nitritadores. 2. Sembrar 3 tubos por dilución desde 10-1 a 10-5 incluido. 3. Incubar en estufa a 28º C por 21 días. Recuento de Nitritadores por el método del NMP Después del período de incubación visualizar la presencia de Nitritadores agregando a cada tubo unas gotas de Reactivo de Griess, el cual indica la presencia de NO2

-. Así: color rojo (+) � NO2-

⇒⇒⇒⇒ Existen Nitritadores Determinación del Nº característico y cálculo del NMP de Nitritadores por el método de Mac Grady La lectura y la expresión de los resultados es similar a la de Celulolíticos.

Figura 9. Esquema de un recuento de microorganismos en un medio líquido por la técnica del Número Más probable

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TEÓRICO PRÁCTICO UNIDAD Nº 16: FIJACIÓN BIOLÓGICA SIMBIÓTICA DE NITRÓGENO Introducción La Fijación Biológica del Nitrógeno (FBN) es realizada por un grupo de procariontes que poseen la enzima nitrogenasa que reduce el N2 a NH4

+. Las bacterias simbióticas de mayor importancia agronómica que poseen esta propiedad son aquellas pertenecientes a los géneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Sinorhizobium y Azorhizobium. Las cepas de estas bacterias pueden no estar en cantidad suficiente en un suelo o no ser eficientes en la FBN para satisfacer la demanda del cultivo de leguminosa con el que se asocian simbióticamente, por lo que la inoculación es la práctica de campo por la cual los microorganismos son incorporados a las semillas de especies de leguminosas (soja, alfalfa, lotus, etc.). No todos los organismos de estos géneros nodulan a todas las leguminosas por lo que se hace necesario inocular con los microorganismos específicos para cada grupo de leguminosas.

Género Especie Huésped Rhizobium leguminosarum biovar trifoli Trifolium leguminosarum biovar viceae Pisum, Vicia

leguminosarum biovar

phasseoli

Phaseolus vulgaris

etli Phaseolus vulgaris

tropici Phaseolus vulgaris, Leucaena

loti Lotus tenuis

Lotus corniculatum ciceri Cicer arietinum

mediterraneum Cicer arietinum

Bradyrhizobium elkani Glycine max

japonicum Glycine max spp (Vigna), (Lopinus), etc Vignia, Arachis, Lupinus, Lotus,

etc. Shinorhizobium fredii Glycine max

meliloti Medicago, Melilotus, Trigonella

Azorhizobium caulinodans Sesbania rostrata

Los inoculantes son fertilizantes biológicos de origen industrial que contienen bacterias seleccionadas por infectividad, efectividad, etc. vehiculizadas por un portador denominado “carrier”. El carrier o soporte puede ser líquido ó sólido. Dado que se trata de un producto industrial existen requerimientos de identificación en el marbete que están estipulados en la legislación argentina por la Resolución 310/94 de la SAGyP (en Material complementario CD). En la práctica existen diversas formas de realizar la inoculación de las semillas, cada una de las cuales presenta ventajas y desventajas. Producida la germinación de las semillas inoculadas, las bacterias colonizan y penetran los pelos radiculares formando los nódulos en los que se producen la fijación de nitrógeno gaseoso. Los rizobios sufren cambios morfológicos, fisiológicos y bioquímicos en los nódulos en las zonas de activa fijación transformándose en bacteroides, mientras que las bacterias se encuentran en la zona meristemática del nódulo y en activa división celular. Los bacteroides se presentan en grupos aislados, encerrados en envolturas membranosas originadas por la planta (siombiosomas). No se dividen y aparecen con las formas características de X, Y ó de clava como se muestra en la figura 10.

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Evaluación a campo de la nodulación en plantas inoculadas Una vez implantado el cultivo se puede evaluar el estado de la nodulación de las plantas realizando controles periódicos del sistema radicular. Esta práctica es muy importante por cuanto permite ver cómo va el cultivo en cuanto al establecimiento de los nódulos que se forman a partir de las bacterias introducidas por el inoculante, e inferir las consecuencias sobre la nutrición nitrogenada. La primera evaluación de nodulación puede realizarse aproximadamente a los 14 días de germinadas las plantas realizando el conteo de nódulos. En sucesivos muestreos se pueden evaluarar los parámetros: abundancia, tamaño, ubicación y coloración al corte. La máxima expresión de la nodulación se observa en floración (R6 en soja). En cuanto al tamaño los nódulos efectivos son generalmente grandes. En la abundancia se registra el número de nódulos y existen escalas para las distintas especies de leguminosas. Un parámetro que surge de la relación entre estos dos es la densidad nodular que es el cociente entre el masa total de los nódulos y el número total de ellos. La distribución de los nódulos entre la raíz primaria y las raíces secundarias es un parámetro importante que nos indicaría de qué tipo de cepas provienen dichos nódulos. Los nódulos que se encuentran en las raíces secundarias e incluso en los extremos, se supone que provienen de cepas nativas del suelo los que se encuentran en raíz principal o cercanos a ella se suponen provienen del inoculante. En cuanto a la coloración al corte los nódulos efectivos son grandes y tienen un color rosado intenso en el interior. Si los nódulos se presentan blancos no están fijando N, los nódulos verdes son los que se encuentran al principio de la nodulación. En ciertas leguminosas se puede observar nódulos que presentan simultáneamente regiones blancas, rojas y negras. Las blancas corresponden a áreas de crecimiento nodular y no existe fijación y las áreas negras a zonas de senescencia. Bibliografía FRIONI, L. Ecología microbiana del suelo. Universidad de la República. Montevideo. 1990 POSGATE, J. Nitrogen fixation. Edward Arnold. 1978 VINCENT, J. Manual práctico de rhizobiología. Hemisferio Sur. Bs. As. 1975 CIAT. Simbiosis leguminosa - rizobio. Manual de métodos de evaluación, selección y manejo

agronómico. Colombia.1998

Figura 10. Bacteroides

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Trabajo Práctico Nº 6 FIJACIÓN BIOLÓGICA DE NITRÓGENO Objetivos � Conocer las prácticas de inoculación de semillas de leguminosas. � Aplicar la técnica de evaluación de la nodulación en plantas de leguminosas. � Observar bacterias fijadoras de nitrógeno a partir de nódulos de leguminosas.

Actividades a) Inoculación a.1.Leer las indicaciones del marbete de la bolsa del inoculante. Realizar la inoculación de semillas según las indicaciones del marbete. a.2. Analizar la Resolución 310/94. b) Evaluación visual de plantas noduladas b.1. De las muestras de plantas disponibles, lavar las raíces eliminando la tierra y cuidando que no haya desprendimiento de nódulos. b.2. Evaluar visualmente la nodulación según los parámetros y la respectiva escala que se presenta en el siguiente cuadro.

ABUNDANCIA TAMAÑO UBICACIÓN COLOR AL CORTE Nula 0 Chicos Raíz principal Blancos Escasa 1 - 10 Medianos Raíz secundaria Verdes Regular 11 - 20 Grandes Rosados Buena 21 - 40 Muy Buena + 40 b.3.Concluir sobre el tipo de nodulación evaluada. c) Observación de bacteroides c.1. Observar al microscopio con objetivo de inmersión los bacteroides a partir de los frotis que suministra la Cátedra. c.2. Caracterizar los mismos.

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TEÓRICO - PRÁCTICO UNIDAD Nº 18: MICROBIOLOGÍA DE LA LECHE Introducción La calidad de la leche tiene incidencia directa en la salud, en los procesos tecnológicos de transformación, como así también en su conservación, siendo además una de las pautas de pago de este producto a los tamberos. El concepto de “calidad de leche” abarca dos aspectos: la calidad físico-química y la calidad higiénico-sanitaria. La primera está relacionada con la calidad y cantidad de los componentes químicos, como son grasa butirosa, proteínas, lactosa, etc. La segunda tiene que ver con el grado de contaminación de las bacterias u otros elementos extraños. Hacen a la misma: a) el excesivo número banales o la contaminación por gérmenes patógenos. b) la presencia de sustancias químicas extrañas como residuos de plaguicidas, desinfectantes, detergentes, antibióticos, etc. c) el contenido de células somáticas superiores a los normales, indicador del estado de sanidad de la ubre. Respecto al primer punto, que es el que trataremos en el curso, existen numerosos y diversos método que permiten apreciar la calidad bacteriológica de la leche. Estos se pueden clasificar en métodos directos e indirectos. Los métodos directos son precisos y significativos ya que permiten la enumeración de los gérmenes, pero también son más largos y delicados, exigiendo que se realicen en laboratorios bien equipados. Entre estos métodos podemos citar el recuento de bacterias mesófilas aerobias y grupos microbianos de importancia desde el punto de vista higiénico y técnico, como: coliformes, termorresistentes, esporulados, psicrófilos, bacterias lácticas, etc. El recuento de bacterias mesófilas aerobias permite estimar la población microbiana total, lo que indica el nivel de medidas higiénicas adoptadas durante la producción y el cuidado puesto en el manejo del producto. Para hacer el recuento se siembran diluciones, ya que el número de microorganismos por ml de leche suele ser alto, utilizándose como medio de cultivo Plate Count Agar (PCA). Este es un medio rico en factores de crecimiento para el desarrollo de bacterias lácticas. El término bacterias coliformes se utiliza para designar las enterobacteriacias. Este grupo de bacterias son huéspedes normales del intestino de los mamíferos, y su presencia en la leche o el agua puede atribuirse a una contaminación fecal. Tienen importancia desde el punto de vista higiénico, porque varias de las especies son responsables de enfermedades infecciosas, y desde el punto de vista tecnológico por la propiedad bioquímica de algunas de ellas de fermentar azúcares con formación de gas y ácidos. Los géneros de mayor significancia son Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Salmonella, Shigella, etc. El recuento de las mismas (colimetría) es uno de los medios más significativos para la apreciación de la calidad higiénica de la leche y de la eficiencia del saneamiento a la que se la somete. Para su conteo se utilizan medios selectivos azucarados, como el Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV), que contienen sales biliares, que inhiben la mayor parte de otros grupos bacterianos. Las bacterias esporuladas tienen importancia tecnológica en lo se refiere a la conservación del producto alimenticio, debido ha que las esporas en condiciones apropiadas pueden dar lugar a la generación de bacterias contraproducentes al mantenimiento de la calidad del producto. A temperaturas relativamente bajas, entre 5 y 15 ºC, predomina la flora psicotrofa constituida principalmente por bacterias Gram (-) muy diversas, entre las cuales se encuentran proteolíticos y lipolíticos, que pueden alterar las propiedades de la leche pasteurizada y conservada a temperatura de refrigerador.

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Las bacterias termodúricas corresponden a aquellos microorganismos que sobreviven a la pasteurización, teniendo por lo tanto una incidencia directa sobre los productos manufacturados. El recuento se debe realizar luego de la pasteurización en cajas de Petri. conteniendo PCA. La presencia de bacterias lácticas no es un índice de mala calidad, ya que son agentes indispensables de la transformación de la leche en diversos productos lácteos. En la tabla Nº 1 se muestran algunos valores indicativos de la calidad higiénico sanitaria de la leche. Entre los métodos indirectos se han ensayado pruebas simples y rápidas cuyo valor es relativo. Se pueden citar las pruebas basadas en la reducción de indicadores que se fundamentan en que el tiempo de decoloración de un indicador de la oxidorreducción. Esta prueba da una medida del grado de contaminación de la leche, ya que existe una relación entre la importancia del desarrollo microbiano y el descenso del potencial redox. Esta relación no considera el número de gérmenes, sino su actividad reductora. Un ejemplo de ella es la prueba de la reductasa, que se basa en medir el tiempo que tarda en reducirse el indicador azul de metileno (azul en estado oxidado e incoloro al estado reducido). Cuanto mayor es la actividad de los microorganismos, más rápida es la reducción del indicador. Otro tipo de pruebas son aquellas basadas en el desarrollo de la flora acidificante. Se puede citar la prueba del alcohol. Consiste en mezclar partes iguales de alcohol (70%) y leche, y observar si existe floculación (resultado positivo), por la formación de grumos en las paredes del tubo de ensayo. La correspondencia de esta prueba con la estabilidad coloidal está basada en que la acidez natural de la leche (13 - 14 º D) aumenta por acción microbiana llegando hasta valores de 40 - 45 ºD, produciéndose la desestabilización del complejo caseínico por aumento de la acidez a temperatura ambiente o por acción de otro agente desestabilizante como el alcohol. Que un tambo produzca leche de buena calidad higiénica no supone, que produzca leche sin microorganismos. Sino que la carga bacteriana inicial sea mínima, pues de lo contrario, ni el enfriamiento, ni la posterior pasteurización van a lograr mejorar este aspecto de la calidad. La pasteurización es el método de saneamiento que se le efectúa a la leche en la industria. Se trata de un tratamiento en el que se combinan tiempo de exposición y temperatura. Persigue una doble finalidad: ← la destrucción de gérmenes patógenos para el hombre y ↑ la reducción de la flora banal con el fin de mejorar la conservación. En la gráfica Nº 1 se puede observar los principios del método. La recta del medio define las normas recomendables para conseguir una pasteurización eficaz. En estas condiciones el aspecto físico no se modifica en lo que se refiere a la “capa de crema” (factor atractivo par el consumidor), además existe un margen de seguridad suficiente para la destrucción del patógeno Mycobacterium tuberculosis. Este fue el germen patógeno que se tomó como indicador para establecer los tiempos y temperaturas de exposición.

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Pasteurización de leche

50

55

60

65

70

75

80

-1 -0,5 0 0,5 1 1,5 2

Log del tiempo en minutos

Tem

peratura (ºC) Línea de crema

Muerte M.Tuberculosis

Pasteurización

Por lo tanto según las normas fijas de la pasteurización se puede afirmar que se destruye los gérmenes patógenos para el hombre. Estas normas corresponde a dos puntos señalados en el diagrama: * 62 º C durante 30 minutos: pasteurización baja. * 72º C durante 15 segundos: pasteurización alta, que ha reemplazado en los últimos tiempos a la primera. Luego de la pasteurización, la leche contiene aún bacterias termorresistentes y esporas, pudiendo estas desarrollar, si las condiciones les son favorables, influyendo en la conservación de la leche pasteurizada. La eficiencia del proceso de pasteurización es del 99%, es por ello la importancia de que la carga bacteriana inicial sea lo más baja posible, siendo más persistente el grado de contaminación cuanto mayor es el número de microorganismos iniciales. Bibliografía ALAIS, CH. “Ciencia de la leche”. Comp. Editorial Continental. México. 1980 GIRARD ROUGIEUX, J. “Técnicas de Microbiología Agrícola”. Ed. Acribia. Zaragoza. 1964

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Tabla Nº 1: Algunos valores indicativos de la calidad higiénico - sanitaria de la leche Control Objeto Standard Causas Remedios Recuento total Medición del

número de organismos en la leche.

Menos de 500.000 bacterias por ml.

Higiene, limpieza y/o enfriamiento pobres. Leche vieja.

Usar métodos de higiene y limpieza recomendables. Adecuado control de la temperatura del tanque de enfriamiento.

Termodúricos Guía sobre la higiene de la ordeñadora y el tanque.

Menos de 10.000 bacterias por ml.

Formación de piedra de leche, material de caucho en mal estado, limpieza e higiene pobres.

Usar métodos de higiene y limpieza recomendables. Asegurar buena calidad del agua. Reemplazar material de goma defectuoso.

Coliformes Como medida de higiene del ordeñe.

Menos de 100 bacterias por ml.

Contaminación por estiércol, higiene pobre, agua contaminadas, residuos de leche en depósitos.

Usar métodos de higiene y limpieza recomendables y agua de buena calidad. Lavar las ubres y evitar el contacto de las pezoneras con estiércol.

Recuento de células somáticas

Indica el nivel de mastitis en la leche.

Menos de: 2.105 excelente 3.105 muy buena 4.105 buena 6.105 aceptable 8.105 pobre mas- muy pobre

Insuficiente control de las posibles contaminaciones. Irritación de la ubre.

Desinfección de las pezoneras, tratamiento de los animales, control anual de la ordeñadora. Eliminación de animales si es necesario.

Antibióticos Detección de antibióticos en la leche.

No debe haber. No haber separado la leche de vacas tratadas.

Seguir los períodos de retención recomendados.

Adulteraciones Detectar el grado de materiales solubles, como leche en polvo o lactosa

No debe haber. Se penaliza con la suspención de las entregas sin plazo determinado por la autoridad competente.

Orientación Láctea - (43) - Diciembre 1994

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TRABAJO - PRÁCTICO Nº 7 ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO DE LECHE Objetivos � Conocer los análisis más comunes relacionados a la calidad bacteriológica que se realizan

sobre la leche cruda � Apreciar el efecto de la pasteurización sobre la calidad bacteriológica de la leche � Desarrollar habilidad para llevar adelante marchas analíticas

Actividades Se trabajará con leche cruda de un tambo de la zona. Parte de la muestra se someterá al proceso de pasteurización

a. Pasteurización 1. Se coloca en un tubo de ensayo la leche a baño de María 2. Controlar que alcance 72 ºC manteniendo durante 15 segundos (pasteurización alta)

b. Análisis bacteriológicos Se evaluará, tanto en leche cruda y pasteurizada, mesófilos aerobios totales y coliformes 1. Para realizar el recuento se preparan diluciones de la muestra usando solución fisiológica (medio isotónico) (ver Trabajo Práctico Nº 4) 2. Para realizar el recuento de mesófilos aerobios totales a. Sembrar en placa extendida 0.1ml de una dilución conveniente empleando como medio de cultivo Plate Count Agar (PCA) b. Incubar a 30 ºC durante 48 hs

3. Para realizar el recuento de coliformes a. Sembrar 1ml de leche sin diluir en caja de petri y verter Agar Bilis Rojo Violeta (ABRV) fluidificado y mantenido a una temperatura de 40 a 45 ºC (siembra por inclusión) b. Homogeneizar el medio con la dilución según las normas dictadas en el práctico c. Dejar solidificar en posición horizontal. Luego incubar a 30 ºC durante 48 hs

c. Resultados

1. Hacer el recuento de las placas eligiendo aquellas cajas que tienen entre 30 y 300 colonias 2. Comparar los resultados obtenidos para leche cruda y leche pasteurizada completando el cuadro

Muestra Análisis bacteriológico

Número promedio de

colonias

Dilución contada

Volumen de siembra

ufc por ml de leche

MAT Leche Cruda Coniformes

MAT Leche pasteurizada Coliformes 3. Calcular la eficiencia de pasteurización

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ANEXO

Medio Rojo Congo

Manita ó Manitol 10 gr (reemplazable por 12,5 g de glicerina (10,16 ml))

PO4K2H 0.5 gr

SO4Mg.7H2O 0.1 gr

ClNa 0.2 gr

Fe Cl3. 6 H2O 0.01 gr

Cl2Ca 0.15 gr

Extracto de levadura 0.5 gr

Rojo Congo (sol ác. 1/400) 10 ml

H2O destilada 1000 ml

Agar agar 15 gr

Llevar a pH= 7

Tabla de Mc Grady (3 tubos por dilución)

Nº

Característico Nº de

microbios Nº

Característico Nº de

microbios Nº

Característico Nº de

microbios 000 0.0 201 1.4 302 6.5 001 0.3 202 2.4 310 4.5 010 0.3 210 1.5 311 7.5 011 0.6 211 2.0 312 11.5 020 0.6 212 3.0 313 16.0 100 0.4 220 2.0 320 9.5 101 0.7 221 3.0 321 15.0 102 1.1 222 3.5 322 20.0 110 0.7 223 4.0 323 30.0 111 1.1 230 3.0 330 25.0 120 1.1 231 3.5 331 45.0 121 1.5 232 4.0 332 110.0 130 1.6 300 2.5 333 110.0 200 0.9 301 4.0 140.0

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Pautas generales para la presentación de informe (Instructivo) Mediante esta guía se sugieren algunas pautas para facilitar la realización de los informes de trabajos prácticos. El informe debe ser impreso en hojas blancas, tamaño A4. Con letra tamaño 11 o 12 e interlineado simple o intermedio (1,5). Márgenes (medidas aconsejadas): derecho 1,5; izquierdo; 2,5; superior 3; inferior 2,5 cm. El trabajo deberá estar debidamente paginado y presentarse anillado, troquelado, o en carpetas plásticas. En la portada deberá constar la siguiente información:

- Institución - Nombre de la asignatura - Título del trabajo - Alumnos - Año

El resto del trabajo constará de las siguientes partes:

Introducción Metodología Resultados (ó Resultados y Discusión) Conclusiones (ó Consideraciones Finales) Anexos Bibliografía

Algunas cuestiones prácticas a tener en cuenta al momento de redactar el trabajo: • Utilizar tipos de letras agradables a la vista del lector (Times New Roman, Arial, Tahoma, por

ejemplo). Las letras muy recargadas cansan la vista del lector. • No confiar en el corrector ortográfico y de redacción de la computadora ya que pasa por alto

algunos errores. • En la portada se pueden incluir fotos, dibujos u otros materiales que estén relacionados con el

tema del trabajo. Orientaciones para la presentación de la bibliografía

1

La bibliografía utilizada para la realización del trabajo debe presentarse ordenada alfabéticamente. En su presentanción debe constar la siguiente información básica, en el orden presentado:

Con letra mayúscula: apellido del/os autor/es, inicial del nombre (cuando hay más de dos autores se separan con punto y coma). Con letra minúscula: año de edición (puede ir entre paréntesis). Título de la obra (en letra itálica cuando se trata de un libro). Editorial. Ciudad en que se editó. Número de la edición. Volumen. Capítulo. Páginas.

Esta es la información básica que debe presentarse cuando se elabora la sección Bibliografía. Existen algunas diferencias de forma, en la presentación, según se trate de libros, artículos científicos publicados en revistas especializadas, trabajos presentados en congresos, tesis, etc. Estos aspectos se tratan a continuación con ejemplos. 1 Se debe tener en cuenta que no existe una única forma de presentar la bibliografía, por lo general cada institución, editorial, revista, etc. adopta una forma o estilo de presentación que debe ser respetada por los que autores que quieran publicar sus obras en ellas.

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Ejemplos: Cuando se trata de un libro: el título siempre se escribe con letra itálica. EVANS, L. T. 1983. Fisiología de los Cultivos. Buenos Aires. Ed. Hemisferio Sur S.A. Cap. 6. Cuando el libro está editado en inglés: el título se escribe en el mismo idioma (inglés) con letra itálica. MONGE, P. R. y CAPELLA, J. N. 1980. Multivariate techniques in human communication

research. Nueva York. Academic Press. Cuando se trata de un trabajo presentado en un congreso: el título no va en letra itálica y no se cita la ciudad en que se editó la revista, ni la editorial. Los autores se separan con punto y coma, cuando son más de dos. ESCANDE, A. R.; PEDRAZA, M. V. ; RUFFINENGO, S. PALACIO, A. PEREYRA,V.R. y LAICH, F.S. 1997. Manejo de la podredumbre del capítulo del girasol (Sclerotinia sclerotiorum) en el campo mediante Trichoderma spp. dispersado por abejas melíferas. IX CONGRESO LATINOAMERICANO DE FITOPATOLOGÍA. Montevideo. Resúmenes. p. 215 Artículos publicados en revistas, en castellano y en inglés: el título del trabajo no va escrito en letra itálica y no se cita la ciudad en que se editó la revista, ni la editorial. MONTEALEGRE, J. R. y HENRÍQUEZ, J. L. 1990. Posibilidades de control integrado de Sclerotium rolfsii Sacc. mediante hongos del género Trichoderma y fungicidas. Rev. Fitopatología. Nov. 25 (2):68-74. PAPAVIZAS, G. C. y LEWIS, A. 1989. Effect of Gliocladium and Trichoderma on damping-off and blight of snapbean caused by Sclerotium rolfsii in the greenhouse. Plant Pathology. 38: 277-286. Artículos en los que no figura el autor: se coloca una línea y a continuación el título del material y toda la información que se posea del mismo. . 2003. Publicación periódica “El Diario”. Artículo información nacional, 1º sección. “Obtienen hormona humana de vacunos clonados”. Paraná. 3 de octubre de 2003. Bibliografía extraída de internet: Trabajo presentado en un congreso en Brasil extraído de la página de internet que figura en el final, entre paréntesis. CIAN, D.; STERREN, M.; BENINTENDE, M. y BENINTENDE, S. 2000. Ajuste de la tasa de mineralización de las capas subsuperficiales por distribución de microorganismos en profundidad. FERTIBIO 2000. 22 al 26 de octubre. Santa María. Brasil. (En: www.ufsm.br/fertibio2000) Cuando no aparece el nombre del autor ni ninguna otra información, se coloca solamente la página de internet. La información extraída en estos casos carece de todo sustento científico y por lo tanto no debe ser la que predomine en el trabajo de investigación.