발 간 등 록 번 호

11-1480523-001198-01

NIER-SP2012-176

산화아연 나노물질의 설치류에 대한

독성동태 연구

2012년 11월

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발 간 등 록 번 호

11-1480523-001198-01

NIER-SP2012-176

산화아연 나노물질의 설치류에 대한

독성동태 연구

동덕여자대학교 산학협력단

박광식

Studies on the toxicokinetics of zinc oxide nanoparticles in rats

Kwangsik Park

Industry-Academic Collaboration Foundation

Dongduk Women's University

2012년 11월

- iii -

제 출 문

국립환경과학원장 귀하

본 보고서를 “산화아연 나노물질의 설치류에 대한 독성동태

연구”과제의 최종보고서로 제출합니다.

2012. 11. 30

연구기관 : 동덕여자대학교 산학협력단

- iv -

참여연구진

총괄책임연구자 박 광 식 동덕여자대학교

연구원 이 연 진 동덕여자대학교

최 종 혜 동덕여자대학교

GLP 시험기관 ㈜ 켐온

측정분석기관 한국기초과학지원연구원

- v -

<요약문>

o 나노산업의 발전에 따라 제조나노물질에 대한 소비자, 생산자 및 연구자들에

대한 노출기회가 증가하게 되었으며 이에 따라 사회적 관심과 국가차원의 나노

물질 관리필요성이 증대함

o 나노물질의 노출경로는 경구, 경피, 흡입 등 매우 다양하며 동일 용량에 노출되

더라도 노출경로에 따라 체내 노출량(internal dose)은 달라 질 수 있음. 나노물질

의 체내 노출량에 따라 유해성의 정도는 달리 나타날 것으로 예상됨

o 따라서 체내 노출량과 나노물질 유해성의 관계를 평가하기 위해서는 흡수, 분포,

배설 등에 관한 독성동태학적 자료의 생산이 필요함

o 본 연구 사업은 화장품 등 일반 소비제품 뿐만 아니라 산업용 소재로 다양하게 이용

되는 산화아연 나노물질에 대한 독성동태 및 건강영향 자료를 생산하여 국내 산화아

연나노 독성연구의 인프라구축 및 나노안전관리정책 수립에 기여하고자 함

1. 연구의 범위

가. 시험물질

o 산화아연나노물질 (Product Number 721077, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였

으며 물리화학적 특성을 규명

나. 산화아연나노물질의 독성시험 연구동향 조사

o 산화아연나노물질의 최근 연구동향조사, 분석 및 정리

다. 독성동태시험

o 독성 시험계에서 나노물질의 안정성 확인 시험 수행

- 크기 분포, 형태, 제타포텐셜, 응집, 표면 화학 등 산화아연나노의 독성시험에 필요한

안정성 확인자료 제시

o 독성동태 시험 항목은 OECD에서 규정한 화학물질 시험지침(Test Guideline

417)과 국립환경과학원 “화학물질 유해성시험방법(고시 제2010-29호, 별표 5 제

4장 17항)”을 기준으로 실시

- vi -

- 나노물질 흡수, 분배, 대사 및 배설에 대한 분석

· 경구투여, 정맥투여 등에 의한 생체이용율 분석

· 간, 신장, 폐, 뇌, 생식기관, 비장 등 주요 목표장기에 대한 생체농축

· 대변, 소변배설 등

- 임상화학, 혈액분석 및 조직병리학적 분석

· 혈청지표 변화 분석, 혈액지표 변화 분석

· 주요 목표장기에 대한 조직병리학적 변화 분석

o 주요 노출 조직에 대한 나노물질의 분석

- 전자현미경(SEM/TEM 등)을 이용한 시각적 나노물질의 분석

o 표준 작업 수순서 작성(SOP) 제시

- 동물의 사육관리 및 시료투여, 샘플링 등 시험의 주요과정에 대한 SOP제시

o 시험자료 및 검체 관리

- 병리조직 등 검체는 시험기관에서 보관 또는 국립환경과학원에 이관

라. 향후연구 및 정책추진방향 제안

o 금번 연구결과와 국외 유사 연구결과를 비교․분석하여 정책․과학적 시사점 도출,

제한사항, 향후 정책․연구 추진방향 등 제시

마. 나노물질의 인체건강영향 연구에 관한 이해관계자 워크숍 개최

o 본 연구과제의 주요 내용인 나노물질 독성동태연구 등을 포함하여 국내·외 현황,

향후 발전 및 정책방향 등 논의

바. OECD 나노물질 안전성사업 국가보고서(Dossier) 갱신

o 우리나라의 OECD 제조나노물질작업반(WPMN) 지원사업(Sponsorship programme)에

참여하는 5개 나노물질에 대한 국내·외 자료를 조사하여 OECD 제출양식에 맞게

영문보고서 갱신

2. 주요 연구결과

가. 시험물질

o 산화아연나노물질 (Product Number 721077, Sigma-Aldrich, USA)을 사용하였

으며 물리화학적 특성을 규명함

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o 산화아연 나노물질을 100 ppm, 1,000 ppm, 10,000 ppm, 15,000 ppm농도로

글루코스 5% 용액에 분산시켰을 때 산화아연나노물질의 입경은 각각 18.4±10.6

nm, 23.2± 10.8 nm, 11.9±6.9 nm, 14.4±8.1 nm 수준을 유지하였음을 확인.

[그림 S-1] 산화아연 나노물질의 글루코스 5 %에서의 사이즈 분석

나. 산화아연나노물질의 독성시험 연구동향 조사

o 산화아연나노물질의 최근 연구동향을 조사하여 총 28건의 주요 핵심사항의 연

구결과를 분석·정리하여 제시함

[표 S-1] 산화아연나노물질의 최근 연구동향 (2012. 11)

Key words Publications

(searched by PubMed)

zinc oxide nanoparaticles 885

zinc oxide nanoparticles + toxicity 212

zinc oxide nanoparticles + toxicokinetics 33

zinc oxide nanoparticles + toxicity +

toxicokinetics11

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다. 독성동태시험

(1) 혈중농도

o 혈중 아연 농도 분석결과 3 mg/kg (저용량), 30 mg/kg (고용량)으로 산화아연

나노물질을 경구 투여 시에 나노물질은 거의 흡수되지 않았으며 정맥주사로 투여

할 경우 혈중에서 빠르게 조직으로 분포되거나 배설되어 2일 안에 혈중농도는 정

상수준으로 회복됨

Blood p.o 7day

0 1 2 3 4 5 6 7

0

10

20

30

40

503 mg/kg30 mg/kgControl

Time (day)

Zn ( m

g/m

l)

[그림 S-2] 산화아연나노물질 경구투여 후 혈중 아연 농도 변화

Blood i.v 7day

0 1 2 3 4 5 6 7

0

10

20

30

40

50

Control

3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (m

g/m

l)

[그림 S-3] 산화아연나노물질 정맥투여 후 혈중 아연 농도 변화

- ix -

(2) 조직분포

o 산화아연나노물질의 조직분포를 조사한 결과 경구투여의 경우, 대부분의 조직에서

산화아연나노물질이 대조군과 유사한 수준으로 검출되었는데 이는 산화아연나노물

질의 경구투여 흡수율이 낮기 때문으로 판단됨

o 정맥주사의 경우 저용량 및 고용량 1일차에서 간 조직중의 아연 농도가 각각

37.68±4.01 μg/g, 88.22±4.86 μg/g으로 대조군(26.82±5.34 μg/g)에 비해 현저히

상승하였으며 신장과 비장 조직 중에는 고용량 1일차에서 각각 34.68±2.89 μg/g,

30.51±3.56 μg/g으로 대조군(19.25±1.41 μg/g)에 비해 유의하게 아연이 축적됨이

관찰되었음

o 폐의 경우 정맥주사 고용량군의 1일차 조직에서 아연함량이 391.23±84.99 μg/g 으로

높게 측정되어 산화아연은 폐에 특이적으로 높게 축적되는 것으로 사료됨

[표 S-2] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 각 장기별 분포현황

(3) 배설

(가) 뇨배설

o 경구 또는 정맥으로 투여 (30 mg/kg) 후 뇨 중 배설량을 조사한 결과, 경구투여

의 경우 뇨를 통한 아연의 배설이 7일 동안 대조군과 유사한 수준임. 정맥주사의

- x -

경우 1일 차 고용량군의 뇨 중 아연 농도는 4.47±0.70 μg/ml 수준이었으며 이틀 후

부터는 배설량이 다소 감소되어 7일 차에는 대조군과 유사한 수준으로 배설되는 것

으로 확인됨

Urine p.o

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (m

g/m

l)

Urine i.v

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (m

g/m

l)

[그림 S-4] 산화아연 나노물질의 뇨 배설

(나) 대변 배설

o 경구투여 고용량군의 경우, 1일 차에 263.08±57.96 μg/g의 농도로 배설되었으며 이

틀 후부터는 배설량이 점차 감소하여 4일차에는 대조군과 유사한 110.96±17.24 μ

g/g 의 농도로 배설. 경구투여 저용량의 경우 관찰기간 7일 동안 대조군과 비슷한

- xi -

수준으로 아연이 검출됨

o 이러한 결과로 보아 경구로 투여된 산화아연 나노물질은 거의 대부분 흡수되지

않으며 장관을 통해 바로 변으로 배설되는 것으로 판단됨

o 정맥투여 고용량 및 저용량에서는 변으로의 배설이 점점 증가하여 3일 차에 최고

농도로 배설되었으며 그 후 점차 감소하다가 6일차에 다시 증가한 후 다시

감소하는 양상을 보임. 고용량군의 3일, 6일차에 변으로 배설되는 아연의 농도는

각각 249.20±54.79 μg/g, 186.61±86.66 μg/g 이었음

o 정맥주사를 통한 산화아연 처리군에서 변을 통한 배설이 3일, 6일에 증가하는 것은

담즙을 통해 장관으로 분비되어 변과 함께 배설되기 때문인 것으로 판단됨

Feces p.o

1 2 3 4 5 6 7

0

100

200

300

400Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

/ml)

Feces i.v

1 2 3 4 5 6 7

0

100

200

300

400Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

/ml)

[그림 S-5] 산화아연 나노물질의 변 배설

- xii -

(4) 일반독성

o 투여용량에서 시험물질과 관련된 일반증상의 이상이나 사망동물은 관찰되지

않았으며 체중변화도 관찰되지 않음

o 혈액학적 지표 및 혈청생화학적 지표에서는 시험물질 투여군 (특히 정맥투여

고용량)에서 일부지표의 통계학적 차이가 관찰됨. 용량반응 등 보다 세부적인

시험이 필요함

o 조직병리학적 검사결과 정맥 고용량 투여군의 간장에서 간세포의 핵분열상의

수가 미약하게 증가되었으며 폐의 폐포벽 모세혈관 내 암색의 침착물과 그를

둘러싸고 있는 폐실질의 손상이 관찰되었고 아울러 신장에서는 사구체신증 등이

관찰됨. 상대적으로 경구투여의 경우 병리조직학적 소견은 미약함

o 비장, 뇌, 가슴샘, 고환 등에서는 특이적 소견을 관찰하지 못함

o 전자현미경소견결과 간장에서 산화아연나노물질의 응집체가 확인됨

3. 향후 연구추진방향

o 생체이용율을 고려한 독성평가 연구를 수행하여야 함

- 생체이용율(Bioavailability)은 독성시험의 용량반응에 영향을 크게 미치는 중

요한 인자이며 본 연구결과 산화아연나노물질을 경구투여 할 경우 그 흡수율

은 매우 낮은 것으로 나타남

- 경구투여에 의한 산화아연나노물질의 반복투여독성 연구 시에는 실제 투여량

에 해당하는 용량을 정확하게 반영하지 못할 것으로 판단됨. 대부분의 투여량

이 위액과 반응하여 침전되므로 나노입자크기를 유지하지 못하게 되고 따라

서 나노입자로서 체내에 흡수되는 것은 매우 어려움

- 따라서, 산화아연나노물질의 독성평가는 생체이용율을 높여 독성물질의 표적

장기에 시험물질이 도달할 경우의 독성을 평가하여야 하며 이를 위해서는 정

맥투여 방법 등에 의한 노출경로를 모색하여야 함

- 산화아연나노물질의 나노입경이 유지되면서 생체이용율을 최대한 높일 수 있

는 정맥투여경로를 이용하여 독성시험을 수행할 때 산화아연나노물질이 본래

- xiii -

부터 가지고 있는 고유한 독성을 평가할 수 있게 되므로 이에 관한 연구를 수행

하여야 함

o 노출경로 별 독성값에 근거한 나노물질의 위해관리 정책 수립이 필요

- 병원성 미생물이 혈액을 통해 직접 인체에 도달할 경우 거의 대부분은 질병발

생으로 이어지나 병원성 미생물이 경구적으로 노출되어 위장관에 도달할 경우

대부분의 미생물은 위산의 살균작용에 의해 사멸하며 따라서 질병을 유발하지

못함

- 나노제품으로부터 유리되는 나노물질이 경구를 통해 인체에 노출될 경우 위산

에 의해 응집현상이 발생할 가능성이 매우 높음. 응집이 발생할 경우 나노입

자로서의 생체이용율은 매우 낮게 되며 따라서 나노독성을 발현하기는 어려

움

- 따라서 경구로 노출되는 경우 나노물질이 위산에서 응집되어 체내에 들어가지

않으므로 위해의 정도는 낮아지며 위해관리의 우선순위는 낮게 평가될 수 있

음. 아울러 경구로 노출되는 나노물질의 위해관리는 흡입, 혈관(정맥 등) 등에

의해 노출되는 나노물질의 위해관리와는 다른 관점에서 위해관리의 정책수립

이 필요할 것으로 판단됨

4. 기대성과 및 활용방안

가. 독성시험용 산화아연 나노물질의 물리화학적 성질 및 안정성 규명기법 개발

- 현재까지 국제적 학술지에 발표된 산화아연 나노물질의 독성논문을 조사해보면

아직까지 거의 대부분의 연구가 시험환경에서의 나노물질에 대한 물리화학적 특

성을 제대로 규명하지 않은 상태에서 시험을 수행한 것이 많음

⇒ 본 연구과제에서는 독성동태시험에 필수적인 경구투여, 정맥주사의 독성시험 용

매 (vehicle)에서의 안정성 등을 평가하고 그 안정성을 유지할 수 있는 방법론을

제시하였음

⇒ 본 연구의 나노물질 독성시험매체에서의 안정성에 관한 표준화 작업은 향후

OECD 나노시험표준화 작업반 등에 국가자료로 제출할 수 있음

- xiv -

나. 물리적 특성과 안정성이 규명된 산화아연 나노물질의 유해성자료 생산에 기

여

- 독성동태시험을 수행한 결과 산화아연나노물질의 경구투여 생체이용율은 매우

낮으므로 향후 경구 반복투여독성시험 등을 수행할 경우는 이를 고려하여 노출

시나리오를 설정하여야 함. 본 연구결과는 향후 산화아연나노물질의 독성시험에

적용될 노출경로, 용량 등에 대한 기본 정보를 제공할 수 있게 됨

다. 국내 나노독성연구기반 확충

- GLP시험기관과의 공동연구사업을 통해 GLP기관에서의 나노독성 수행능력을 향

상시킴으로써 향후 나노제품에 대한 국가 간 유해성/위해성평가 역할분담 수행능

력 기반을 마련

라. 환경부주관 범부처「나노안전관리종합계획」이행 및 안전관리정책 자료 제공

- 나노안전관리 종합계획의 주무부처인 환경부는 각 부처 사업을 주도적으로 선도

할 책임이 있으며 이를 위해서는 유해성자료 생산에 관한 환경부/국립환경과학원

의 주도적인 역할이 중요

- 아울러 독성동태 결과는 체내노출량 결정, 투여경로에 따른 체내흡수율 정보제공

등 나노안전관리에 필수적인 독성정보를 제공하게 되므로 환경부는 이를 바탕으

로 산화아연나노물질의 안전관리 정책을 제시할 수 있음

- xv -

Abstract

Toxicokinetics of zinc oxide nanoparticles (Sigma-Aldrich, Cat. No 721077, average size: <35 nm) was studied in rats through a single intravenous injection and through a single oral administration (3 mg/kg and 30 mg/kg), respectively. Serum concentrations of zinc were monitored for 7 days and tissue distribution were determined in liver, kidney, testis, spleen, thymus, lung and brain, respectively. For the excretion of zinc oxide nanoparticles, zinc in the urine and feces were measured for 7 days. General toxicities induced by zinc oxide nanoparticles were also investigated including serum biochemistry, hematology, histopathology and electron microscopic observation. Zinc oxide nanoparticles were hardly absorbed in gastrointestinal tract after oral administration and most of the administered nanoparticles were excreted through feces. When the nanoparticles were intravenously injected by 30 mg/kg dose, it reached peak concentration at 5 minutes (41.01±7.16 μg/g) but return to the normal ranges within 2 days. Zinc oxide nanoparticles distributed mainly to liver (88.22±4.86 μg/g), kidney (34.68±2.89 μg/g), spleen (30.51±3.56 μg/g), and lung (391.23±84.99 μg/g) at 1 day after intravenous injection of 30 mg/kg and the distributed level was significantly decreased to normal level till 7 days. Low bioavailability after oral adminstration supported the excretion of the nanoparticles through feces. Both urine excretion and feces excretion were observed in the rats treated by intravenous injection. The feces excretion after injection means the bile excretion of zinc oxide nanoparticles. No treatment-related toxicities were found by a single oral adminstration of zinc oxide nanoparticles based on the serum biochemistry, hematology and histopathology, while liver and lung damages were found by histopathological analysis after intravenous injection. In summary, bioavailability of zinc oxide nanoparticles in oral treated rats were very low and they showed no toxicity in a treated level (3, 30 mg/kg), while intravenous injection showed liver and lung damages. Zinc oxide nanoparticles were distributed to organs but it seemed that most were removed from the deposited organs within 7 days.

- xvi -

- 목 차 -요약문AbstractI 서론 ·········································································································· 1II 연구내용 및 방법 ····················································································· 2 1. 연구사업의 범위 및 세부과제내용 ······································································· 2

2. 연구방법 ··················································································································· 4 가. 시험물질(산화아연나노물질) ········································································ 4 나. 산화아연나노물질의 독성시험 연구동향 조사 ············································ 5 다. 독성동태시험 ··································································································· 6 (1) 독성시험계에서의 산화아연의 안정성 ···················································· 6 (2) 독성동태시험 ······························································································ 6 (3) 혈액, 뇨, 변,, 주요 노출조직에 대한 나노물질의 분석 ····················· 15 (4) 표준작업수순서 (SOP) 작성 ································································· 27 (5) 시험자료 및 검체관리 ············································································ 27 라. 향후연구 및 정책추진방향 제안 ································································ 28 마. 나노물질의 인체건강영향연구과련 워크숍개최 ······································· 30 바. OECD 나노물질안전성사업 국가보고서 갱신 ·········································· 30

Ⅲ 연구 결과 및 고찰 ················································································· 31 1. 대상노출경로에 대한 독성동태 시험법 ······························································· 31 2. 산화아연나노물질의 독성시험 연구동향 조사 ···················································· 31 3. 독성동태시험 ········································································································· 55 가. 독성시험계에서의 산화아연의 안정성 ···························································· 55 나. 독성동태시험 ····································································································· 59

- xvii -

다. 표준작업수순서 (SOP) 작성 ··········································································· 93 라. 시험자료 및 검체관리 ······················································································ 93

4. 향후연구 및 정책추진방향제안 ············································································ 94 5. 나노물질의 인체건강영향연구관련 워크숍개최 ·················································· 95 6. OECD 나노물질안전성사업 국가보고서 갱신 ····················································· 97

Ⅳ 결론 ······································································································· 100 1. 결론 ························································································································ 100 2. 기대성과 및 활용방안 ························································································· 106

V 참고문헌 ·································································································· 108

VI 부록 ······································································································· 111 1. 표준작업수순서(SOP) ·························································································· 112 2. 국외출장보고서 ··································································································· 125

- xviii -

- 그림 목차 -

[그림 S-1] 산화아연 나노물질의 글루코스 5 %에서의 사이즈 분석 ·················· ⅶ[그림 S-2] 산화아연나노물질 경구투여 후 혈중 아연 농도 변화 ························ ⅷ[그림 S-3] 산화아연나노물질 정맥투여 후 혈중 아연 농도 변화 ························ ⅷ[그림 S-4] 산화아연 나노물질의 뇨 배설 ·································································· ⅹ[그림 S-5] 산화아연 나노물질의 변 배설 ·································································· ⅺ[그림 2-1] 산화아연 나노물질의 전자현미경 사진 및 모식도 ································ 4[그림 2-2] 산화아연 나노물질의 전자현미경 사진 ···················································· 5[그림 2-3] ICP 기본 분석에서 사용되는 각각의 원소의 특정 방출선의

에너지와 파장간의 관계 ············································································ 16[그림 2-4] ICP 분석에서 사용되는 플라즈마의 온도 분포 ··································· 17[그림 2-5] ICP-AES ····································································································· 18[그림 2-6] Schematic diagram of the Elan 5000 ICP-MS Spectrometer ···· 19[그림 2-7] Structure of ICP and Sampling Interface ·········································· 21[그림 2-8] Ion optic system ······················································································· 22[그림 2-9] 관리차트의 요소 ························································································· 23[그림 2-10] 향후연구 및 정책추진방향 제안의 흐름도 ··········································· 29[그림 3-1] Baek 등의 연구결과. 산화아연 나노물질 경구투여 후의 혈중

동태 및 조직분포 ························································································ 34[그림 3-2] Fiona 등 의 연구 모식도 ········································································· 35[그림 3-3] Sharma 등의 연구 결과. 산화아연 나노물질을 처리한 마우스의

간과 신장에서의 조직병리학 ···································································· 36[그림 3-4] Yang 등의 연구결과. A549 세포의 산화아연 나노물질로 인한

세포 변형 ······································································································ 37[그림 3-5] Kao 등의 연구결과. 산화아연 나노물질의 독성학적 메커니즘 ······· 38[그림 3-6] Pasupuleti 등의 연구 결과. 나노사이즈의 산화아연을 처리한

군의 혈 중 ALT, AST, Ca 농도가 증가함 ·········································· 39[그림 3-7] Li 등의 연구결과. 산화아연 복강주사 및 경구투여 후의

혈중아연농도 변화 ······················································································ 41[그림 3-8] Surekha 등의 연구결과. 피부의 콜라겐 함량 ····································· 42[그림 3-9] Hackenberg 등의 연구 결과. 산화아연 나노물질로 인한 세포

손상의 메커니즘 모식도 ············································································ 43

- xix -

[그림 3-10] Kool 등의 연구 결과. 산화아연 나노입자, 나노입자가 아닌 산화아연, ZnCl2의 Folsomia candida 28일 노출에 대한 LC50, EC50, EC10 ······························································································· 44

[그림 3-11] Song 등의 연구결과. 산화아연 나노입자 및 ZnCl2에 노출 된 Ana-1 세포의 IC50 ················································································· 48

[그림 3-12] Hooper 등의 연구 결과. 산화아연이 지렁이 체내에 축적됨 ·········· 49[그림 3-13] Heng 등의 연구결과. 산화아연 농도가 증가함에 따라

BEAS-2B 세포 생존률 감소 ································································· 51[그림 3-14] Xia 등의 연구결과. RAW274.7 세포에서의 CeO2, ZnO,

TiO2의 산화적 스트레스 연구 ······························································· 52[그림 3-15] Sharma 등의 연구 결과. A431세포의 산화아연 나노물질

처리에 따른 olive tail moment 증가 ··················································· 53[그림 3-16] Franklin 등의 연구 결과. Pseudokirchneriella subcapitat 의

ZnCl2, Bulk ZnO, 산화아연 나노입자에 대한 72h-IC50 ············· 54[그림 3-17] 산화아연 나노물질의 정맥주사용 제제에서의 분산성 ····················· 55[그림 3-18] 산화아연 나노물질의 초순수 증류수에서의 입경분포 ····················· 56[그림 3-19] 산화아연 나노물질의 글루코스 5 %에서의 사이즈 분석 ················· 57[그림 3-20] 글루코스 5%에 현탁된 산화아연 나노물질의 Fetal Bovine

Serum(FBS)에서의 사이즈 분석 ························································· 58[그림 3-21] 산화아연 나노물질의 인공위액에서의 응집현상 ································· 59[그림 3-22] 산화아연 나노물질 경구투여 후 혈중 아연 농도의 경시변화 ········· 61[그림 3-23] 산화아연 나노물질 정맥주사 후 혈중 아연 농도의 경시변화 ········· 62[그림 3-24] 산화아연 나노물질의 간조직 분포 현황 ··············································· 65[그림 3-25] 산화아연 나노물질의 신장분포 현황 ····················································· 66[그림 3-26] 산화아연 나노물질의 비장 분포 현황 ··················································· 67[그림 3-27] 산화아연 나노물질의 가슴샘 분포 현황 ··············································· 68[그림 3-28] 산화아연 나노물질의 고환 분포 현황 ··················································· 69[그림 3-29] 산화아연 나노물질의 뇌 조직 분포 현황 ··········································· 70[그림 3-30] 산화아연 나노물질의 폐 조직 분포 현황 ············································· 71[그림 3-31] 정상 시험동물군(랫드 등)의 아연 함량 ··············································· 72[그림 3-32] 산화아연나노의 폐 축적 ········································································· 72[그림 3-33] 산화아연 나노물질의 뇨를 통한 배설 ················································· 75[그림 3-34] 산화아연 나노물질의 뇨를 통한 총 배설량 (누적량) 그래프 ······· 76[그림 3-35] 산화아연 나노물질의 변을 통한 배설 ··················································· 79

- xx -

[그림 3-36] 산화아연 나노물질의 변을 통한 총 배설량 (누적량) 그래프 ········· 80[그림 3-37] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 간 조직병리 ··· 88[그림 3-38] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 신장 조직병리 89[그림 3-39] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 폐 조직병리 ··· 89[그림 3-40] 산화아연나노물질을 정맥투여한 후 전자현미경으로 관찰한

랫드의 간조직 ···························································································· 91[그림 3-41] 나노입자 독성동태연구의 현황 및 위해성평가 워크숍 리플렛 ······· 95[그림 3-42] 워크숍 기념사진 ························································································· 96[그림 3-43] OECD 포유류 은나노 독성 보고서의 예시 ········································ 97[그림 3-44] NAPIRAhub Server 화면 ······································································ 98[그림 4-1] 산화아연나노물질 경구투여 후 혈중 아연 농도 변화 ····················· 100[그림 4-2] 산화아연나노물질 정맥투여 후 혈중 아연 농도 변화 ····················· 100[그림 4-3] 산화아연 나노물질의 뇨 배설 ······························································· 102[그림 4-4] 산화아연 나노물질의 변 배설 ······························································· 103

- 표 목차 -[표 S-1] 산화아연나노물질의 최근 연구동향 ·························································· ⅶ[표 S-2] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 각 장기별

분포현황 ············································································································ ⅸ[표 2-1] 산화아연 나노물질 Product Number (721077 : Sigma Aldrich) ······· 4[표 2-2] 독성동태시험에 사용한 시험동물의 정보 ···················································· 7[표 2-3] 독성동태 시험군의 구성현황 ·········································································· 9[표 2-4] 혈액 및 조직 시료의 현황 ··········································································· 14[표 2-5] ICP 분석에 요구되는 QC의 예 ··································································· 26[표 2-6] 검체관리 및 적출 조직 현황 ······································································· 28[표 3-1] 산화아연나노물질의 학술논문 현황 ··························································· 31[표 3-2] 산화아연 나노물질 경구 및 정맥투여 후 혈중 아연 농도 변화 ········· 60[표 3-3] 산화아연 나노물질 경구투여 및 정맥주사 후 독성동태지표 ··············· 63[표 3-4] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 각 장기별

분포현황 ············································································································ 64

- xxi -

[표 3-5] 산화아연 나노물질의 경구투여 및 정맥주사 후 날짜별 뇨를 통한 배설량 ················································································································ 74

[표 3-6] 산화아연 나노물질의 뇨를 통한 배설 비율 (%) ···································· 76[표 3-7] 산화아연 나노물질의 변을 통한 배설 ······················································· 78[표 3-8] 산화아연 나노물질의 총 투여량 중 변을 통한 배설 비율 (%) ·········· 80[표 3-9] 산화아연나노물질에 의한 랫드의 체중 변화 ··········································· 81[표 3-10] 산화아연 나노물질에 의한 뇨(urine)량의 변화 ······································ 82[표 3-11] 산화아연 나노물질의 변(stool) 량의 변화 ·············································· 82[표 3-12] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈액학적 검사결과 (1일 째) ··· 83[표 3-13] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈액학적 변화결과 (7일 째) ··· 84[표 3-14] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈청생화학적 변화 결과

(1일 째) ··········································································································· 85[표 3-15] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈청생화학적 변화결과

(7일 째) ········································································································· 85[표 3-16] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 장기 중량 변화 (1일 째) ········· 86[표 3-17] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 장기중량 변화 (7일 째) ··········· 87[표 3-18] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 간세포의

핵분열상 수 ······································································································ 88[표 3-19] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 조직병리학 결과 90[표 3-20] Plasma CAL Reference Standard ····························································· 93[표 4-1] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 각 장기별

분포현황 ········································································································ 101

- 1 -

I. 서론1. 연구사업 개요

o 사업명 : 산화아연 나노물질의 설치류에 대한 독성동태 연구

o 예산액 : 150백만원

o 용역기간 : 2012. 4. 5 –2012. 11. 30

o 추진기관 : 국립환경과학원 위해성평가연구과

2. 연구사업 추진배경

o 나노산업의 발전에 따라 제조나노물질에 대한 소비자, 생산자 및 연구자들에 대한

노출기회가 증가

o 나노물질의 노출경로는 경구, 경피, 흡입 등 매우 다양하며 동일 용량에 노출되더라

도 노출경로에 따라 체내 노출량(internal dose)은 달라 질 수 있음

o 나노물질의 체내 노출량에 따라 유해성의 정도는 달리 나타날 것으로 예상되며 체내

노출량과 나노물질 유해성의 관계를 평가하기 위해서는 흡수, 분포, 배설 등에 관한

독성동태학적 자료의 생산이 필요함

3. 연구사업 목표

o 나노물질 안전관리 대책수립에 필요한 산화아연나노물질의 독성동태 및 인체독성 건강

영향자료 확보

- 나노물질 위해성평가 체계 구축 추진에 활용

o 범부처 나노안전관리 종합계획 (‘11.10) 및 나노물질 안전관리 중장기로드맵 (’12.1, 환

경부)에 따른 나노안전성 평가 기반구축

- 2 -

II. 연구내용 및 방법1. 연구사업의 범위 및 세부과제 내용가. 사업의 범위

o 국내·외에서 수행된 나노물질의 독성동태 건강영향 평가방법 조사

o 나노물질의 유해성인자 조사(물리화학적 특성 등)

o 산화아연나노물질의의 독성동태시험 수행

o OECD 나노물질 안전성사업 국가보고서(Dossier) 갱신

나. 세부내용

(1) 시험물질

o 산화아연나노물질

- 대상 물질의 사용 및 폐기에 관한 전 과정은 국립환경과학원에서 규정한 "나노

물질 사용 및 폐기에 관한 지침"을 준수

- 모든 시험 항목은 수행 전 관련된 물리화학적 특성 확인을 실시

(2) 산화아연나노물질의 독성시험 연구동향 조사

o 산화아연나노물질의 최근 연구동향조사, 분석 및 정리

(3) 독성동태시험

(가) 독성 시험계에서 나노물질의 안전성 확인 시험 수행

o 크기 분포, 형태, 제타포텐셜, 응집, 표면 화학 등 산화아연나노의 독성독성동태 시험에 필

요한 안정성 확인자료 제시

(나) 독성동태 시험 항목은 OECD에서 규정한 화학물질 시험지침(Test Guideline

417)과 국립환경과학원 “화학물질 유해성시험방법(고시 제2010-29호, 별표 5 제4장

17항)”을 기준으로 실시

1) 나노물질 흡수, 분배, (대사) 및 배설에 대한 분석

o 경구투여, 정맥투여 등에 의한 생체이용율 분석

o 간, 신장, 폐, 뇌, 생식기관, 비장 등 주요 목표장기에 대한 생체농축

o 대변, 소변배설 등

2) 임상화학, 혈액분석 및 조직병리학적 분석

o 혈청지표변화 분석, 혈액지표 변화 분석

o 주요 목표장기에 대한 조직병리학적 변화 분석

- 3 -

(다) 주요 노출 조직에 대한 나노물질의 분석

o 전자현미경(SEM/TEM 등)을 이용한 시각적 나노물질의 분석

(라) 표준 작업 수순서 작성(SOP) 제시

o 동물의 사육관리 및 시료투여, 샘플링 등 시험의 주요과정에 대한 SOP제시

(마) 시험자료 및 검체 관리

o 병리조직 등 검체는 시험기관에서 보관 또는 국립환경과학원에 이관

(4) 향후연구 및 정책추진방향 제안

o 금번 연구결과와 국외 유사 연구결과를 비교․분석하여 정책․과학적 시사점 도출, 제

한사항, 향후 정책․연구 추진방향 등 제시

(5) 나노물질의 인체건강영향 연구에 관한 이해관계자 워크숍 개최

o 본 연구과제의 주요 내용인 나노물질 독성동태연구 등을 포함하여 국내·외 현황,

향후 발전 및 정책방향 등 논의

(6) OECD 나노물질 안전성사업 국가보고서(Dossier) 갱신

o 우리나라의 OECD 제조나노물질작업반(WPMN) 지원사업(Sponsorship programme)에

참여하는 5개 나노물질에 대한 국내·외 자료를 조사하여 OECD 제출양식에 맞게

영문보고서 갱신

- 4 -

2. 연구방법가. 시험물질 (산화아연 나노물질)

o 시험물질은 시그마-알드리치사에서 판매하는 다양한 아연 나노 중에 물에 분산시킨

형태의 Zinc oxide nanoparticles를 구입하여 사용하였으며 제조사에서 제공한 산화

아연나노의 물리적 특성은 아래와 같음

[표 2-1] 산화아연 나노물질 Product Number (721077 : Sigma Aldrich)

농도 50 wt. % in H2O 입경 <100 nm (DLS)

평균입경 <35 nm (APS) pH 7±0.1(for aqueous systems)

밀도 1.7 g/ml±0.1 g/ml at 25 °C 표면 화학 cationic 3- aminopropyl triethoxysilane

o 합성아연나노의 응용사례 (provided by Sigma-Aldrich)

[그림 2-1] 산화아연 나노물질의 전자현미경 사진 및 모식도

- 5 -

[그림 2-2] 산화아연 나노물질의 전자현미경 사진

나. 산화아연나노물질의 독성시험 연구동향 조사

o 아래 학술검색엔진을 포함하여 국제기구, 대학, 연구소의 네트워킹을 활용하고 국

립환경과학원의 협조 하에 국외 나노물질 sponsor country의 자료를 최대한 조사

하였음

- 본 과제에서 이용한 화학물질 주요 인터넷사이트

http://www.oecd.org/chemicals

http://www.epa.gov/oppt/nano/

http://www.fda.gov/ScienceResearch/SpecialTopics/Nanotechnology

http://www.nanotech-now.com

http://www.nano.gov

http://www.nanochemistry.tistory.com

http://www.nature.com/nnano

http://www.crnano.org/whatis.htm

http://www.zyvex.com/nano

http://toxnet.nlm.nih.gov (Toxnet)

http://www.epa.gov/ecotox (ECOTOX)

http://acswebconntent.acs.org (미국화학 물질관리 협회)

http://toxprof.crcpress.com (CRC, Toxicological profile online)

http://www.atsdr.cdc.gov (ATSDR)

http://www.cdc.gov/niosh (NIOSH)

http://chem.unep.ch (UNEP)

http://www.chemfinder.com (Chemfinder)

http://www.icca-chem.org (ICCA)

- 산화아연나노물질에 대한 최근의 주요 학술지에 발표된 연구논문을 분석하고 요약

정리함

- 6 -

다. 독성동태 시험

(1) 독성시험계에서의 산화아연의 안정성

o 본 시험은 독성동태시험으로서 경구투여와 정맥투여에 의한 흡수율 비교 등을 통

해 생체이용율을 산출하여야 하며 아울러 배설 및 대사, 조직 분포 등에 대한 사

항을 평가하여야 함

o 따라서, 본 연구의 시험계인 랫드의 경구투여와 정맥투여를 위한 용제에서 산화아

연은 나노형태가 유지되어야 함. 특히, 정맥주사의 경우 등장성이 유지되면서 나

노입경이 유지되어 산화아연나노물질의 안정성이 훼손되어서는 아니 됨

o 본 연구에서는 경구투여용제, 정맥주사용 용제에서의 안정성을 평가하며 탈이온정

제수, 5% 글루코스용액, 혈청, 인공 위액 등에서의 산화아연나노물질의 안정성을

평가하였음

(2) 독성동태시험

(가) 투여시험물질 조제

o 정맥주사용

- 3 mg/kg, 30 mg/kg, 투여액량 2 ml/kg 으로 설정하여 저용량군은 22.5 mg/15 ml

에 시험물질 50 wt % 및 비중 1.73 g/ml(성적서)을 계산하여 시험물질 0.013 ml

+ 부형제 5 % 글루코스 14.987 ml로 희석하였음. 고용량군은 225 mg/15 ml 에 시

험물질 50 wt % 및 비중 1.73 g/ml(성적서)을 계산하여 시험물질 0.13 ml + 부형

제 5 % 글루코스 14.87 ml로 희석하였음

o 경구투여용

- 3 mg/kg, 30 mg/kg, 투여액량 10 ml/kg 으로 설정하여 저용량군은 30 mg/100 ml

에 시험물질 50 wt % 및 비중 1.73 g/ml(성적서)을 계산하여 시험물질 0.017 ml

+ 부형제 5 % 글루코스 99.983 ml로 희석하였음. 고용량군은 시험물질 0.069 ml +

부형제 5 % 글루코스 39.931 ml로 희석하였음

(나) 시험계 및 사육환경

1) 시험계

o 동물정보

- 7 -

[표 2-2] 독성동태시험에 사용한 시험동물의 정보

종 및 계통 특정병원체 부재(SPF) 랫드, Hsd:Sprague Dawley®™SD®™

생산자 및 공급원 코아텍(경기도 평택시 진위면 동천리 406)

선정사유본 시험에 사용한 랫드는 크기가 작고, 다루기가 쉬우며, 공급체계가

확립되어, 약물동태시험에 널리 사용되고 있어 선택하였다.

성별 수컷

동물 수

입수 시 68

투여 시 65

주령

입수 시 7

투여 시 8

투여 시 체중범위 평균체중(g)의 ±20 % 이내

잔여동물의 처리 안락사 처리하였다.

o 검역 및 순화

- 입수 후 5 일간 시험을 실시하는 동물실내에서 순화시키고, 매일 1회 이상 일반증

상을 관찰하였음

o 식별

- 개체식별은 순화기간에는 적색, 투여 및 관찰기간에는 흑색 매직을 이용한 미부표

시법을 사용하고, 개체별로 다른 색상의 개체식별카드를 부착하며, 사육상자대에

는 고유번호를 부착하였음. 사육실 입구에는 동물실 사용기록지를 부착하였음

o 동물실험 윤리규정

- ㈜켐온 전임상연구센터의 동물윤리위원회에 의해 승인됨(일련번호: 12-R105)

2) 사육 환경

o 환경조건 및 측정

- 동물은 온도 23±3 ºC, 상대습도 55±15 %, 환기횟수 10-20 회/hr, 조명시간 12 시

간(오전 8 시 점등-오후 8 시 소등) 및 조도 150-300 Lux로 유지되는 ㈜켐온 전임

- 8 -

상연구센터 제2동물사육구역 13 호실에서 사육함

- 온도와 상대습도는 매시간 컴퓨터 시스템을 이용하여 측정하였고, 환기횟수 및 조

도는 정기적으로 측정

- 실험기간 동안 동물실의 온도는 21.5-22.4 ºC, 상대습도는 58.0-60.9 % 였고, 시험

결과에 영향을 줄만한 이상은 없었음

o 사료 및 물 오염물질 검사

- 사료는 TEKLAD CERTIFIED IRRADIATED GLOBAL 18 % PROTEIN

RODENT DIET (2918C, Harlan Co. LTD., USA)를 ㈜두열바이오텍(서울특별시

서초구 양재동 153번지 성보프라자 107 호)으로부터 공급받아 급이기를 이용하여

자유섭취 하도록 함. 사료성분 분석 성적서를 검토한 결과 사료조성 및 오염물질

등에서 시험에 악영향을 줄만한 요인은 없었음

- 물은 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 지하수를 폴리카보네이트제 음수

병에 넣고 자유섭취 하도록 하였음. 수질검사는 경기도보건환경연구원(경기도 수

원시 장안구 파장동 324-1)에서 수행하였고, 먹는물 수질기준에 적합

o 사육상자 및 사육밀도

- 동물은 모든 시험기간 동안 스테인레스제 망 사육상자(W 215 x L 355 x H 200

mm)에서 3 마리 이하/사육상자로 수용하며, 채뇨 및 채변 대상 동물은 Metabolic

cage에서 1 마리/사육상자로 수용함

o 군분리

- 순화기간 중 건강한 것으로 판정한 동물의 체중을 순위화하고, 각 군의 평균체중

이 균일하게 분포하도록 시험군 구성표와 같이 무작위 분배

- 9 -

(다) 시험군 구성, 투여량 설정 및 투여

1) 시험군의 구성

[표 2-3] 독성동태 시험군의 구성현황

군 성 별 투여경로동물수

(마리)동 물 번 호

투여액량

(ml/kg)

투여량

(mg/kg)

G1a) M p.o. 4 1-4d) 10 0

G1a)

M p.o. 4 5-8e)

10 0

G1a)

M p.o. 4 9-12f)

10 0

G1k) M i.v. 4 13-16k) 2 0

G2b)

M p.o. 4 17-20g)

10 3

G2b)

M p.o. 4 21-24h)

10 3

G2b) M p.o. 4 25-28i) 10 3

G3b) M p.o. 4 29-32d) 10 30

G3b)

M p.o. 4 33-36h)

10 30

G3b)

M p.o. 4 37-40j)

10 30

G4c) M i.v. 4 41-44g) 2 3

G4c) M i.v. 4 45-48h) 2 3

G4c)

M i.v. 4 49-52i)

2 3

G5c)

M i.v. 4 53-56d)

2 30

G5c) M i.v. 4 57-60h) 2 30

G5c) M i.v. 4 61-64j) 2 30

G6a) M i.v. 1 65l) 2 0

a) 경구투여 부형제대조군, b) 경구투여 시험물질투여군, c) 정맥내투여 시험물질투여군

d) 혈액 및 혈액생화학적 검사(1일차), 조직채취(1 일차, 조직병리학적검사, 조직슬라이드제작 및 사진촬영)

e) 의뢰자용 채혈(투여전 및 7 일차)

f) 채뇨 및 채변(1 일차 및 7 일차), 혈액 및 혈액생화학적 검사(7 일차), 조직채취(7 일차)

g) 조직채취(1 일차), h) 채혈

i) 조직채취(7 일차), 채뇨 및 채변(1, 2, 3, 4, 5 , 6, 7 일차)

j) 혈액 및 혈액생화학적 검사(7 일차), 조직채취(7 일차), 채뇨 및 채변(1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 일차)

k) 채혈(정맥내투여 대조군, 투여전 및 7 일차)

l) 투여 후 1 일차에 전자현미경 검사용 검체 채취용

- 10 -

2) 투여량의 설정

o 예비투여 결과 100 mg/kg 정맥 내 투여군에서 사망이 관찰되어, 부형제 투여군,

3 mg/kg (저용량군) 및 30 mg/kg (고용량군)으로 설정

3) 투여

o OECD Test Guideline 417에 따라 용량 선택

- 예비 시험 시 단회 투여하며 용량은 무독하나 대사체가 배설물에서 확인되어야

함. 본 시험 시 단회 투여의 경우 최소 두 용량이상 선택하는 것이 좋음

- 하나의 용량만 선택했을 경우 그 용량은 무독성이어야 하나 대사체가 배설물에서

확인되어야 함. 두 가지의 용량을 선택했을 경우 저용량에서는 무독하나 고용량에

서는 독성동태학적인 변화나 독성이 관찰되어야 함

- 단회 투여에 의한 독성동태 및 조직 분포 자료는 축적 및 지속성을 보기에 적절하

며 낮은 독성을 가지는 물질의 경우, 최대용량을 1,000 mg/kg 로 제한

o 투여경로

- 경구 및 정맥투여

o 투여횟수 및 기간

- 1 회/일, 단회

o 투여액량 산출

- 투여일에 측정한 체중을 기준으로 투여액량을 산출

o 투여방법

- 경구투여 : 투여 전 하룻밤 절식시켜 위 내용물을 비운 후, 경구투여용 존데를 장

착한 주사관을 이용하여 위내에 직접 투여. 투여 후 3-4 시간째에 사료를 다시 급

여

- 정맥투여 : 보정틀을 이용하여 랫드를 고정한 후, 좌측 또는 우측의 미정맥 내에

1 회용 주사기를 이용하여 약 2 ml/min의 속도로 투여. 투여 전에는 70 % 소독용

알코올을 이용하여 투여부위를 소독

(라) 관찰 및 검사

1) 일반증상

o 투여 후 채혈이 종료되는 기간 동안 사망여부, 일반증상의 종류, 발현일 및

증상의 정도를 관찰하고, 개체 별로 기록. 투여일을 Day 0 로 설정

2) 체중

o 모든 동물에 대하여 입수 시, 군 분리 시, 투여개시일(Day 0, 경구투여 동물은

- 11 -

절식체중), 부검 전(Day 6, 부검전일 절식하고 부검 전까지 절식상태를 유지),

부검일(Day 7)에 측정

(마) 약물동태

1) 채혈

o 채혈 방법

- 채혈은 경정맥에서 주사기를 이용하여 정해진 시간에 혈액 약 200 μl를 채혈. 채혈

한 혈액은 헤파린 처리된 tube(1000 IU/ml 액 5 μl)에 넣고 혼합 후 분리과정 없

이 전혈로 -50 ℃이하로 설정되어 있는 Deep freezer에 보관

- 각 튜브 상당과 측면에 '시험번호-군-동물번호-채혈시각(예:264N, G1, 1-1hr)'의

내용이 기재된 초저온보관용 라벨을 부착. 이때 정확한 채혈량을 기록

o 채혈 시간

- 부형제대조군 : 투여전 (p.o. - 4 마리, i.v. - 4 마리), 투여후 7 일차 (8 마리) 총

16 sample

- 시험물질투여군 : 투여전, 투여 후 5, 10, 30 분, 1, 2, 6, 12, 24 시간, 2, 3, 4, 5, 6,

7 일 (15 points), 총 240 샘플

2) 채뇨, 채변 및 부검

o 채뇨

- 24 시간 동안 수집한 요의 볼륨을 측정한 후 균질화하여 1 ml을 취하여 냉동보관

하였다. 8 일간 수행하였으며, 일일 총 배설 뇨량을 기록

(부형제대조군: 1, 7 일, 시험물질투여군: 1-7 일)

o 채변

- 24 시간 동안 수집한 변의 무게를 측정한 후 10 배 볼륨의 탈이온수로 균질화하여

1 ml을 취하여 냉동보관. 8 일 간 수행하였으며, 일일 총 배설 변량을 기록. (부형

제대조군: 1, 7 일, 시험물질투여군: 1-7 일)

o 부검

- 임상병리를 위한 채혈 후 복대동맥 및 후대정맥을 절단하여 방혈/치사 시 킨 후

체표, 피하, 두부, 흉강 및 복강의 모든 장기에 대해 부검소견을 관찰하여 부검소

견기록지에 기록

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(바) 임상병리

1) 채혈

o 동물은 채혈 전에 하룻밤 동안(16-24 시간) 절식(물은 제공)

o 부검일에 동물을 Isoflurane으로 흡입마취하고, 마취가 확인되면 개복하여

후대정맥에서 주사기를 이용하여 채혈을 실시

o 검사항목

- 일반혈액검사 : 혈액 약 1 ml, 튜브 : EDTA-2K CBC bottle

- 혈액생화학적검사 : 혈액 약 2 ml 이상, 튜브 : Clot activator vacutainer tube

2) 혈액학적 검사

o 아래 항목에 대해 혈액검사를 실시

적혈구(RBC) 적혈구분포폭(RDW) 호중구(NEU)헤마토크리트치(HCT) 헤모글로빈분포폭(HDW) 림프구(LYM)혈색소량(HGB) 평균혈소판용적(MPV) 단핵구(MONO)평균적혈구용적(MCV) 혈소판수(PLT) 호산구(EOS)평균적혈구헤모글로빈량(MCH) 망상적혈구(RET) 호염기구(BASO)평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC) 백혈구(WBC) 대형비염색성세포(LUC)

3) 혈액생화학적 검사

o 아래 항목에 대해 혈액생화학적 검사를 실시

아스파테이트 아미노기전이효소(AST) 총콜레스테롤(TCHO) 크레아티닌(CRE)

알라닌 아미노기전이효소(ALT) 중성지방(TG) 무기인(IP)알칼라인 포스파타제(ALP) 총단백(TP) 칼슘(Ca2+)크레아틴인산활성효소(CPK) 알부민(ALB) 나트륨(Na+)총빌리루빈(TBIL) 알부민/글로불린 비(A/G) 칼륨(K+)당(GLU) 혈액요소질소(BUN) 염소(Cl-)

(사) 장기적출 및 장기중량 측정

o 적출장기는 간, 신장, 폐, 뇌, 비장, 가슴샘, 고환(7장기/마리)이며, 부형제대조군과

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시험물질 투여군 (저용량 및 고용량)은 1, 7 일에 각 군당 4 마리씩에 대하여

장기를 적출하고, 모든 적출장기의 중량을 측정하였으며, 양측성 장기는 각각

측정

o 조직 내 분포측정을 위한 검체는 개체별 해당 장기의 동일부위에서 약 200

mg씩의 시료(280 sample)를 취하여 냉동보관. 이 때 실제 적출된 습중량을 측정.

또한 투여 후 1 일과 7 일째의 부검 동물 중 정맥내투여 부형제대조군 1 마리,

고용량군 3 마리의 간장 일부를 전자현미경적 검사를 실시하기 위해 따로 준비된

고정액에 고정하여 검사기관에 송부(대상동물의 순서는 각 군의 생존동물 앞번호 순)

(아) 조직병리학적 검사

o 투여 후 2 일째에 부형제대조군과 고용량군의 각 군당 4 마리씩에 대하여 적출한

장기를 10 % 중성완충포르말린용액에 고정한 후 조직병리학적 검사를 실시 (7

장기×3 slide×12마리, 총 252 sample)

o 제작한 slide 중 병변이 확인된 조직과 부형제대조군에 대해서만 사진촬영을

실시. 단, 신장과 고환 중 우측은 측정 분석용으로 사용하고, 좌측은

조직병리학적 검사를 실시

(자) 통계 분석

o 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되는 통계 패키지인 SPSS 10.1K를

이용하였으며 유의수준은 p<0.05로 설정

o 체중, 혈액학적 및 혈액생화학적 자료, 뇨량, 분변 및 장기중량에 대하여는 자료의

정규성을 가정하고 모수적인 일원분산분석(One-way ANOVA)을 적용. 분산의

동질성은 Levene test로 검정

o ANOVA 결과가 유의하며 등분산인 경우 Duncan multiple range test (표본수

같음) 로, 이분산인 경우는 Dunnett T3 test로 사후검정을 실시하여

부형제대조군과 유의한 차이를 나타내는 군을 확인

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[표 2-4] 혈액 및 조직 시료의 현황

　그룹 blood samples organs (Seven organs) urine feces Total

대조군2 pts (0, 7d)

x 4 rats x 2 (p.o., iv) = 16

2 pts (p.o., 1d, 7d) x 7 organs x 4 rats + 1

point (iv, 7d) x 7 organ = 84

7 pts (1d-7d) x 4 rats = 28 7 pts (1d-7d) x 4 rats = 28 156

처리군0 (투여전)

2 pts (H, L) x 2 pts (p.o., iv) x 4

rats = 16- - - 16

5 min (투여후) 16 - - - 1610 min 16 - - - 1630 min 16 - - - 161 hr 16 - - - 162 hrs 16 - - - 166 hrs 16 - - - 1612 hrs 16 - - - 16

1 day 162 pts (H, L) x 1 point

(1d) x 2 pts (oral, iv) x 7 organs x 4

rats = 112

2 pts (H, L) x 2pts (oral, iv) x 4 rats = 162 pts (H, L) x 2pts (oral, iv) x 4 rats = 16

160

2 day 16 - 16 16 483 day 16 - 16 16 484 day 16 - 16 16 485 day 16 - 16 16 486 day 16 - 16 16 48

7 days 162 points (low, high

dose) x 1 point (7d) x 2 points (oral, iv) x 7 organs x 4 rats = 112

16 16 160

total 256 208 140 140 844

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(3) 혈액, 뇨, 변 및 주요 노출조직에 대한 나노물질의 분석

(가) 아연분석용 시료 전처리

o 샘플링 시료는 분석 전까지는 -70 ℃로 냉동보관. 시료 중 나노물질의 분석을 위해

일정량의 시료를 취한 후 산분해를 실시. 산 분해는 각 시료 (조직 및 대변의 경

우 습중량으로 200∼300 mg 내외, 뇨 및 혈액의 경우 약 0.2 ml에 해당하는 양)

에 7 ml의 70% 질산과 1 ml의 H2O2 용액을 넣고 마이크로웨이브 시스템을 이용

하여 고온고압상태에서 가수 분해

o 가수분해 시료 일정부분을 취해 탈이온수로 250배 희석시킨 후 ICP-AES로 아연

성분을 측정 (측정시료에 따라 희석배율은 조절함). 혈액은 전혈 1 ml 중에 함유

된 아연나노(또는 아연)의 중량으로 표시하고 (단위: μg/ml, ng/ml), 조직의 경우

1 그람중에 함유된 아연 μg 중량으로 표시 (μg/g, ng/ml). 뇨의 경우 1 ml 에 함

유된 아연성분을 중량으로 평가하며 대변의 경우 1 그람 중에 함유된 아연성분을

중량단위로 산출

(나) Toxicokinetic parameter 결정

o 혈중 아연 농도변화에 따른 생체이용율 계산은 식품의약품안전청의 지원을 받아 경

희대학교 생물약제학 교실 이영주 교수팀이 개발한 BA Calc 2006 프로그램을 사용.

혈액농도변화로부터 AUC (Area Under the Curve)를 구하고 아울러 Cmax, Tmax,

T1/2 등을 산출

(다) 유도결합 플라즈마 분석

1) 유도결합 플라즈마 방출분광법 (ICP-AES, Inductively Coupled Plasma Atomic

Emission Spectroscopy)

o 유도결합플라즈마 방출분광법은 아르곤 가스를 6000K이상의 초고온 상태로 만들

어 아르곤 플라즈마를 생성시키고, 그 속에 수용액 시료를 분무 도입시켜 초고온

의 플라즈마 속에서 에너지를 받아 발광하는 빛을 광전증배관으로 검출하여 물질

속의 특정 원소의 함량을 측정하는 기기임

o 유도결합플라즈마 방출분광법에서 사용하는 플라즈마는 이온화된 아르곤기체로

이온과 전자, 그리고 중성입자로 구성된 대단히 이온화 된, 전기적으로 중성인 기

체를 말함

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o 좀 더 자세히 서술하면 분석하고자 하는 원소의 바닥상태의 원자를 고온의 플라

즈마를 이용하여 충분한 에너지를 받아 들뜬상태(excited state)로 되었다가 다시

바닥상태(ground state)로 전이하면서 방출하는 원자 각각의 고유방출 스펙트럼

을 이용하여 환경오염 물질로 구분되는 중금속 등의 무기원소의 정성 및 정량분

석 (파장의 위치; nm, 파장의세기; intensity) 에 응용하는 방법임

o 이밖에도 원자분광법에는 스펙트럼의 측정방법에 따라 방출(emission), 흡광

(absorption), 형광(fluorescence)분광법 등으로 구분. ICP에 사용되는 에너지원은 Ar

기체가 이온화된 plasma로 1970년대 중반이후 무기원소 분석분야에서 널리 사용되고

있는 분석방법이 되었음

o 다음의 [그림 2-3]에서는 ICP 기본 분석원리를 설명한 것으로 각각의 원소에서 방

출선의 에너지와 파장간의 관계를 설명한 것임. 또한 [그림 3-2]는 plasma 불꽃

의 온도 구간을 구분하여 나타낸 것임

h = Plank's constant, 6.63 × 10-27 erg secν = frequencyc = speed of light, 2.99 × 1010 cm sec-1λ = wavelength,

Atom line transitionsElements (E=hc/l) wavelength

excitation potential (eV) (nm)S 6.85 180.73Zn 5.79 213.86Cu 3.81 324.75 Na 2.10 589.59K 1.61 769.90

[그림 2-3] ICP 기본 분석에서 사용되는 각각의 원소의 특정 방출선의 에너지와 파장간의

관계

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[그림 2-4] ICP 분석에서 사용되는 플라즈마의 온도 분포

o 생성된 플라즈마의 온도 분포는 위의 [그림 2-4]에서 나타낸 그림과 같으며 시료

분석 영역의 온도는 대략 6000K-8000K 정도. 플라즈마 발생 장치는 냉각용 아르

곤가스 (cooling Ar gas)와 보조 아르곤가스 (auxiliary Ar gas)를 torch에 공급

o 이들 두 기체는 각각 석영관의 접선방향으로 유입되어 나선형으로 회전하면서

torch의 위쪽으로 진행. 이때, 고주파 유도 코일에 40.68MHz 의 고주파 전류를

흘려보내면, 코일 주위에 자기장이 형성

o 플라즈마에 전자밀도가 어느 정도 증가하면 자기장의 자력선속 주위에 전류가 과

다하게 흐르게 되고, 이로 인해 전자들이 가속됨. 이때 Ar 원자와 이러한 가속전

자가 충돌하면 Ar이 전자를 잃고 Ar＋로 이온화되고 여기서 생성된 전자가 계속

해서 다른 전자를 이온화시킴. 이러한 이온화 과정이 지속적으로 되풀이 되면서

전자밀도(～1015 cm-3)가 큰 유도결합 플라즈마가 생성되고 점화가 가능해 짐

o 유도결합플라즈마 방출분광법을 이용하여 중금속 등 무기원소의 정량분석을 하는

경우 사용하는 플라즈마 (plasma)로부터 얻을 수 있는 스펙트럼이 바탕 값이 낮

고 분해능이 좋기 때문에 동위원소의 분석, 미량원소의 검출 등에 이용되고 있으

며, 또한 시료 용액을 일정한 속도로 분무시켜 안정한 불꽃을 얻을 수 있어서 재

현성이 뛰어난 정량분석을 할 수 있음

- 18 -

o 그리고 불활성 기체인 아르곤 플라즈마를 사용하므로 화학적 방해영향이 작으며,

검정 곡선에서 104-105의 분석범위를 가지고 동시에 다 원소 분석이 가능. 또한,

주기율표상의 거의 모든 원소(약 80여 종)에 대해 수십 ppb정도의 극미량함량까지

검출이 가능하며, 분석오차는 약 1% 정도

o 10 cc 정도의 소량으로도 측정이 가능하고, 원소 1개당 분석 시간은 2-3분 정도로

신속. 안정한 플라즈마 불꽃을 유지할 수 있어서 재현성이 좋은 결과를 얻을 수

있음. 본 연구에서 사용하는 ICP-AES는 [그림 2-5]와 같음

[그림 2-5] ICP-AES

2) 유도결합 플라즈마 질량분석기 (ICP-MS, Inductively Coupled Plasma Mass

Spectrometer)

o 유도결합 플라즈마 질량분석법 (ICP/MS)은 이온생성장치인 ICP와 생성된 이온

을 검출하는 질량분석기로 이루어져 있으며, 70여 원소를 sub-ppb 수준까지 정

성은 물론 정량까지 할 수 있는 분석방법. 이 분석법은 ICP에서 생성된 singly

charged analyte ion을 추출해서 mass spectrometer로 측정하는 기술임

o 분석영역은 ICP/MS 및 Electro thermal atomic absorption spectrometer

(ETAAS)의 분석 영역과 겹쳐지며 다른 분광분석기기와 비교하여 높은 감도, 깨

끗한 background spectra를 제공하므로 대부분의 금속원소에 대하여 ppb 수준의

낮은 검출한계를 가짐

o ICP-MS는 시료를 이온화 시키는 ICP부분과 ICP로부터 생성된 이온들을 구별해

- 19 -

내는 Mass Spectrometer를 연결시켜주는 경계 영역으로 이루어져 있음. [그림

2-6]은 Perkin Elmer-Sciex사의 Elan 5000 ICP-MS의 전체적인 구조를 나타낸

것임

[그림 2-6] Schematic diagram of the Elan 5000 ICP-MS Spectrometer

o 분석하고자하는 시료는 ICP에 도입되어 원자화와 이온화 과정을 거치게 됨. 기화

된 시료는 플라즈마 지역에 도달하여 약 6000 K 정도의 Kinetic를 가지게 되며

이 지역에서 약 2 ms 정도의 시간동안 머물면서 원자화 또는 이온화됨

o 극미량 원소 분석에서 탁월한 능력을 가진 ICP-MS는 ICP-AES보다 100배 내지

1000배 정도로 검출한계가 낮음. ICP-MS로 측정할 수 있는 원소들의 대부분은

0.5-㎍/L 정도의 검출한계를 갖고 있음. 특히 희토류 원소들은 ICP-AES보다 스

펙트럼이 간단할 뿐 아니라 검출한계가 훨씬 낮음

o ICP-MS 의 검출한계는 대분분의 원소들에 대해 ETAAS보다 10배에서 100배

낮으며 정밀도가 좋고 분석속도가 빠름. 또한 질량분석을 할 수 있으므로 동위원

소비를 측정할 수 있으며, isotope tracer 실험이나 동위 원소 희석법을 이용한

원소분석을 할 수 있음

o m/e의 값이 80 이상인 경우 background의 방해영향이 매우 작기 때문에 정확한

분석을 할 수 있음. 하지만 가용성 물질(TDS)의 양이 1000 ppm 이상이면 signal

의 drift 가 일어날 수 있으므로 정밀도가 떨어질 수 있음. 반드시 100 ppm 이하

- 20 -

로 TDS가 존재하는 용액을 시료로 해야 함

o 또한 분석 성분에 미칠 수 있는 polyatomic ion의 영향을 고려해야 하고 물이나

질산은 거의 같은 background를 주지만 염산이나 황산은 polyatomic ion을 만들

거나 복잡한 background를 주므로 염산이나 황산의 사용은 피해야 함

o ICP-MS는 시료주입장치, sampling interface, ion optics, quadrupole 및 검출기로

이루어져 있음. 시료를 ICP에 효율적으로 또한 재현성 있게 주입하는 것은 매우

중요한 일이며 시료의 형태는 용액이 가장 많기 때문에 가장 보편적으로 이용되

는 방법은 시료 용액을 안개상태로 만들어서 ICP에 넣어주는 것임

o 이것을 nebulization 이라고 하는데 크게 pneumatic nebulization과 ultrasonic

nebulization 의 두 가지로 나눌 수 있음. pneumatic nebulizer 는 가장 간편하고 자동화

하기 쉬워서 많이 이용되지만 시료 주입 효율이 낮음. 한편, ultrasonic nebulizer는

TDS의 양이 많아 nebulization 에 영향을 미치는 경우 nebulization에 효과적이라고 알

려져 있음

o 대부분의 시료 용액은 TDS의 양이 1% 이하이어야만 하지만 1%를 넘는 경우가

많음. 이러한 경우 여러 가지 간섭을 일으키므로 nebulizer 대신 electro thermal

vaporizer(ETV)를 이용하여 시료를 플라즈마 안에 넣어 이러한 단점들이 제거됨

o ETV의 기본 원리는 1-10㎕ 의 시료 용액을 금속 혹은 graphite filament에 넣고

약한 전류를 흘려 용매를 증발 시킨 다음 강한 전류를 흘려 filament위에 남은 고

체를 휘발시켜 ICP에 넣어 주는 원리. 따라서 ㎕의 시료 용액을 분석할 수 있으

며 물 혹은 유기 용매를 먼저 증발시켜 버리므로 물에 의한 spectral interference

와 유기 용매에 의한 carbon 의 흡착, ICP의 불안정한 문제점이 근본적으로 해결

o ICP가 가지는 시료의 증발, 원자화, 이온화, 들뜸 효율의 효율성과 질량 분석기가

가지는 우수한 선택성 및 감도 특성이 결합되기 위해서는 대기압 상태에서 생성

된 이온을 약 10-6 torr 정도의 진공 상태인 질량 분석기로 도입하기 위한 구조가

필요

o sampler 와 skimmer cone은 열전도율이 좋으며 부식이 잘되지 않는 순도 99.5%

이상의 nickel, aluminum 혹은 백금으로 만드는데, 용액 중의 nickel을 분석할 때

- 21 -

에는 aluminum cone을 사용하며 반대로 aluminum을 분석할 때에는 nickel로 만

든 cone을 사용

o 다음 [그림 2-7]은 interface의 구조를 나타낸 것으로 질량 분석부의 진공을 유지

하기 위한 두 개의 pumping stage가 있고 각각이 stage는 약 0.5㎜ 내지 1.0㎜의

작은 구경을 갖는 sampling cone과 skimmer cone으로 나누어져 있음. sampler

와 skimmer cone은 열전도율이 좋으며 부식이 잘되지 않는 순도 99.5% 이상의

nickel, aluminum 혹은 백금으로 만드는데, 용액 중의 nickel을 분석할 때에는

aluminum cone을 사용하며 반대로 aluminum을 분석할 때에는 nickel로 만든

cone을 사용

o Skimmer cone을 통과한 이온들은 약 10-4torr의 첫 번째 진공용기로 들어오면서

초음속의 속도를 가지고 확산. 따라서 이들 확산하는 이온들을 효율성 있게 또는

재현성 있게 질량분석기 안으로 모아서 넣어줄 수 있는 렌즈들이 필요. 이를 위한

electrostatic lens system을 [그림 2-8]에 나타내었음

[그림 2-7] Structure of ICP and Sampling Interface

- 22 -

[그림 2-8] Ion optic system

3) 표준분석 작업의 정도관리

o 정확한 데이터를 얻는다는 것을 입증하기 위해서는 매일같이 체계적인 체크를

통하여 실험결과가 재현성이 있다는 것과 방법론적으로 각각의 시료에 대한 양이

실제적으로 측정되어야 한다는 것을 보여주어야 함. QC은 시료채취와 함께

시작되며 QC는 분석자 그리고 현장에서 시료를 채취하는 사람 모두에게 반드시

필요한 사항임

o 출력된 데이터값 X1, X2, ....Xn는 산술평균 X와 같은 정확성과 범위 R값 또는

표준편차 S와 같이 정밀성을 측정하는데 사용되었음. 이러한 통계학은 다음과

같은 식으로 계산

S =∑n

i= 1X 2

i- ( ∑n

i= 1X i)

2

/n

n-1

R = the largest of the Χi - the smallest of the Χi

X =∑n

i= 1X i

n

o 이러한 통계학은 관리도표에 점을 찍어 평가하는 것으로 사업을 정확히 관리하는

유사한 통계학들로부터 발전된 것임. 그러한 관리도표와 공통된 요소들은 [그림

2-9]에 나타내었음

- 23 -

0

50

100

0 5 10 15 20

SAMPLE NUMBER

VA

LU

E O

F T

HE

STA

TIS

TIC

LOWER CONTROL LIMIT

CENTRAL LINE

UPPER CONTROL LIMIT

[그림 2-9] 관리차트의 요소

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4) 분석공정에서의 정도관리

o 환경실험실안의 유사한 시스템 변수는 매개변수, 기구류 그리고 분석자임.

환경실험실에서는 일상적으로 산업적인 견지와는 다른 변수를 가지고 있음. 즉

조사된 매개변수에 따른 실제 농도 수준은 샘플에 따라 상당히 많이 변할 수

있으며 불행히도 산업구조에서 잘 사용되었던 통계학은 환경적인 실험에서

통용되는 실제 농도의 다양성에 따라 민감함

o 예를 들어 통계상의 가치값인 산술평균X와 범위 R값은 농도가 증가함에 따라

대체로 증가. 이러한 실제농도의 다양성은 일상적으로 샘플을 선택하기 위한

기대치를 얻지 못하는 것을 의미. 따라서 정확한 실험방법은 스파이크와

스탠다드의 회수율을 통하여 간접적으로 평가되어야 함

o 결론적으로 환경적인 실험을 산업적인 QC에 만족스럽게 적용하기는 어려움.

실제 농도수준의 변화를 해결하기 위한 두 가지 가능한 접근방법이 있는데 그

하나는 이러한 변화에 민감하지 않은 통계를 이용하는 것과 다른 하나는 제한된

농도 범위 안에서만 산업적인 기술을 적용하는 것임. 명백히 실질적인 문제를

해결하고 각각의 매개변수를 위한 일련의 도표를 유지하고 발전시킬 필요가 없기

때문에 전자 쪽이 더 좋은 방안

o 정확도를 위한 QC Charts

- Shewhart X 도표를 대신할 수 있는 두가지 방안이 일련의 다른 스탠다드와

스파이크의 회수율을 평가하기위해 제안되어 왔음. 하나는 관측치와 참값 사

이의 차를 제곱하여 누적도표에 이용하는 것이고 다른 하나는 산술평균 X를

대신하여 회수율을 고전 Shewhart 기술에 이용하는 것임. 스탠다드의 회수

율은 다음과 같은 계산에 의해 구해지며,

P = 100 × observed / known

자연수를 바탕값으로 한 스파이크의 회수율은 다음과 같은 방법으로 계산

P = 100 × (observed - background) / spike

- 회수율과 기지농도(스탠다드와 스파이크) 사이의 선형적인 관계는 최근

EPA에서 수은 분석을 통해 연구 보고된 것에 의해 정확한 도면으로 증명.

두 가지 접근방법 모두 환경적인 실험의 변화에 기초를 두고 사용되고 있음

- 25 -

o 정밀도를 위한 QC 도표

- 농도의 변화에 따라 통계적 범위가 바뀌는 성질 때문에 일상적인 시료 분석

의 정확성을 평가하기 위해 환경적인 실험에서는 Shewhart의 R도표를 대신

하여 두 가지 대안을 이용하고 있음

- 한 가지 대안은 일상 샘플을 무작위로 선택하는 반복된 결론 사이의 차이를

제곱한 값을 더하는 누적도표를 이용하는 것. 반복분석을 위한 범위 R값이

그들 사이의 차이와 같기 때문에 누적통계는 범위 R2값의 합과 같음

- 그러나 R값이 농도수준의 변화에 따라 중대하게 변화한다면 R2값은 더욱 더

큰 영향을 미칠 것이며 따라서 시스템의 정확성이 받아들일만한 것인지 안

한지를 판단하는 기준으로 좋지 못함. 다른 대안은 R도표와 유사한 도표를

이용하는 것임 [표 2-5]

100(CV) = 100SX

= 100R/ 2

(A+B)/2

= 1002

2

RA+B

=2002

|A-B|A+B

=200I

2

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[표 2-5] ICP 분석에 요구되는 QC의 예

QC 절차 빈도 판단기준

초기보정

Initial calibration (IC)분석 초기에 사용 해당 없음

초기보정 검정

Initial calibration verification

(ICV)

초기보정 후 바로 사용 실제농도의 90～110%

초기보정 공시료

Initial calibration blank (ICB)초기보정 검정 후 바로 사용

연구사업에서 제시하는

검출한계 보다 낮도록 한다.

고농도 표준물 검정

High standard verification (HSV)초시보정 공시료 분석 후에 실제농도의 95～105%

간섭점검용 표준물질

Interference check standard (ICS)

고농도 표준물질 검정

매 8시간마다 분석이 끝나는 시점실제농도의 80～120%

연속보정 검정

Continuing calibration verification

(CCV)

첫 번째 시료 분석전과 매 10개

시료 분석마다, 그리고 분석이

끝나는 시점에 사용

실제농도의 90～110%

연속보정 공시료

Continuing calibration blanks

(CCBs)

각 연속보정 검정 후 분석 연구사업에서 제시하는

검출한계 보다 낮도록 한다.

시약 공시료

Reagent blank (RB)

40개 시료당 1개

1 batch 당 최소 1번

연구사업에서 제시하는

검출한계 보다 낮도록 한다.

실험실 Control 스파이크용액

Laboratory control spike (LCS)

20개 시료당 1개

1 batch 당 최소 1번

회수율 80～120%

Ag 및 Sb 제외

중복 또는 스파이크한 중복시료

Duplicate and/or spike duplicate시료 batch 당 1번 RPD 20% 이하

매트릭스 스파이크 시료

Matrix spike (MS)시료 batch 당 1번 회수율 75～125%

연속 희석

Serial dilution시료 batch 당 1번 희석하지 않은 시료 90～110%

시료 희석

Sample dilution

보정범위 상한선 바로 아랫부분에

오도록 희석, 최소 MDL의 5배필요시

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(4) 표준작업수순서 (SOP) 작성

o GLP시험기관에서 수행한 동물의 관리, 샘플링 및 조직병리 등에 대한 사항을 표준작

업수순서로 재정리하여 제출. 단, 기업의 비밀보호와 관련한 사항은 제외

o 측정분석 등 Non-GLP시험에 대해서는 시험과정을 상세히 기술한 시험방법으로 표

준작업수순서를 대체함

o 사전확인이 필요한 필수 물리화학적 성질목록, 시료준비, 용량설정, 시험방법, 보고서

작성 등 연구 수행 중 필요한 세부항목에 대해 표준작업수순서 작성 및 제출

o 표준작업수순서의 예

(5) 시험자료 및 검체관리

◦ raw data (사본 가능) 및 시험 과정 및 조건을 상세히 기록한 기록지(사본

가능)를 보고서의 붙임자료로 과학원에 제출

- 시험 수행 중 얻어진 모든 검체는 과학원에 반환

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◦ 조직 적출 후 일부를 개별 보관하여 과학원에 제출

- 해당 장기 : 간, 비장, 신장

- 보관조건

[표 2-6] 검체관리 및 적출 조직 현황 ( 0 : 실행하였음을 의미)

중성 포르말린 용액에 보관

액체 질소 동결 후 -70oC 이하에서 보관

간 0 0비 장 0 0신 장 0 (좌, 우) 0 (좌, 우)

폐 0 0뇌 0 0

고환 0 (좌,우) 0 (좌, 우)흉선 0 0

⇒ GLP시험의 경우 각 GLP시험기관의 SOP에 따라 검체 및 기초자료 보관,

보관된 검체 및 기초자료는 과학원의 요청에 따라 이관

⇒ NON-GLP시험의 경우 각 세부 연구책임자의 감독 하에 필요한 검체 및 기초자료,

보관된 검체 및 기초자료는 과학원의 요청에 따라 이관

라. 향후연구 및 정책추진방향 제안

(1) 본 연구결과의 검증

o SCI국제학술지에 투고함으로써 본 연구결과에 대한 국제저명전문가의 검토를 받

을 예정임 음 (연구종료 후 2년 이내 학술논문 게재를 목표로 함)

- 연구결과의 완전성을 국제적으로 인정받은 후 본 연구에서 수행되지 못한 분야

에 대해서는 향후 연구로 도출하였음

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(2) 나노물질 독성동태시험의 기술적 문제점 도출

o 동일 성분이라 하더라도 화학물질과 나노 입자는 체내에서 각각 특이적 체내 동

태와 생체반응을 가질 것으로 예상되므로 워크숍에서 이른 논의하여 의견 도출하

였음

o 현재, 체내에 존재하는 나노입자에 대한 정량성을 확보할 수 있는 기술은 미진한

바 국제적으로는 이 부분에 대한 논의가 심도 있게 논의하여 의견도출 하였음

(예, 금속의 경우 입자측정이 아니라 총 이온 측정으로 평가)

⇒ 입자의 체내 내적용량을 정확히 평가하고 입자성분의 노출량 평가를 바탕으로

위해성평가가 이루어 질 수 있는 연구와 이를 바탕으로 나노관리 정책이 수립

되도록 연구방향을 도출하였음

(3) 연구방향 및 정책추진방향 제안

o 생산과정, 소비자제품, 폐기 등의 라이프사이클에서 노출경로는 달라질 수 있으며

노출경로에 따라 체내노출량이 달라 질 수 있으므로 노출량에 따른 나노물질관리

정책이 수립되어야 함

⇒ 경구노출의 경우 위장관에서의 흡수율이 낮을 경우 실제 위해성은 낮게 나타나

며 따라서 흡입노출을 유발하는 제품과는 관리의 정책이 달라야 함. 이를 위해

학술논문, 연구보고서, 워크숍에서의 토론 등을 통해 정책추진방향을 도출하였음

[그림 2-10] 향후연구 및 정책추진방향 제안의 흐름도

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마. 나노물질의 인체건강영향 연구에 관한 이해관계자 워크숍개최 o 국내외 전문가가 참여하는 워크숍을 개최 바. OECD 나노물질안전성 국가보고서 갱신(1) 갱신대상 나노물질

- 은나노, MWCNTs, 티타늄나노, 실리카나노, 금나노

(2) OECD 안전성사업(SIDS)방식에 준하는 나노물질안전성평가 문서작성

(가) SID 사업수행절차

o OECD는 회원국간 대량생산화학물질을 중심으로 기존화학물질 안전성평가사업을

수행중이며 우리나라는 2000년부터 Acetanilide를 비롯한 다수의 대량생산화학물

질에 대한 안전성평가를 수행하여 OECD에 제출

- 주관 : 위해성평가가 SIDS팀 (Screening Information Data Sheet)

o 안전성평가는 평가대상 화학물질에 대한 기존의 유해성자료의 신뢰도를 평가하여

유해물질의 안전관리에 활용할 목적으로 수행되며 그 기본 개념도는 아래와 같음

⇒ 국립환경과학원 주관의 IUCLID 입력 작업에 연구원이 참여하여 건강영향부

분에 대한 독성자료 입력 및 검토

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Ⅲ 연구 결과 및 고찰1. 대상노출경로에 대한 독성동태 시험법 다양한 검색엔진을 통해 산화아연나노물질의 독성동태시험법에 대한 조사를 실시하였다. OECD 등 국제기구에서 진행되는 나노물질 시험법, 미국, EU, 일본 등 주요 국가 및 산업계에서 추진하고 있는 시험법 등을 조사하였으며 그 결과 나라별, 국제기구별, 산업계별로 독특한 새로운 시험법이 존재하기 보다는 나노물질의 독성동태연구의 시험법으로는 OECD 독성동태시험법 TG417에 준하되 나노물질의 물리화학적 특성을 규명하는 것이 중요하다는 결론에 도달하였다. 따라서 본 연구에서도 경구투여, 정맥주사 투여 등 투여경로에 따른 나노물질의 안정성을 규명하였으며 특히, 산화아연나노물질이 경구로 투여될 경우 위장액에서의 안정성, 정맥으로 투여될 경우 혈청에서의 안정성을 규명한 후 독성동태시험을 수행하였다.

2. 산화아연나노물질의 연구동향조사 다양한 검색엔진을 통해 산화아연나노물질의 독성 및 독성동태에 관한 연구결과를 조사하였다. 그 결과 연구결과의 신뢰성이 높고 본 연구목적에 맞는 산화아연나노물질의 in vivo, in vitro독성 및 독성동태에 관한 연구자료를 가장 풍부하게 검색할 수 있었던 검색DB는 미국국립의학도서관에서 제공하는 PubMed였으며 2012년 11월 현재 학술논문에 등재된 연구결과현황은 아래와 같다

[표 3-1] 산화아연나노물질의 학술논문 현황 (2012. 11)

Key words Publications

(searched by PubMed)

zinc oxide nanoparaticles 885

zinc oxide nanoparticles + toxicity 212

zinc oxide nanoparticles + toxicokinetics 33

zinc oxide nanoparticles + toxicity +

toxicokinetics11

본 연구에서는 산화아연나노물질 연구에 관한 다양한 자료 중에서 우선 독성 및 독성동태에 관한 논문을 중심으로 검토하였으며 그 가운데서도 논문자료의 양적 질적 자료가 우수한 연구결과를 선정하여 아래와 같이 정리하였다.

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(1) Nano-sized cosmetic formulations or solid nanoparticles in sunscreens: a risk to human health? (나노크기의 화장품 제형 또는 자외선차단제의 고체 나노입자가 인간 건강에 위해한가?)

o 출처 : Arch Toxicol. 2012 Jul;86(7):1063-75. Epub 2012 Mar 31, Nohynek G. J. et al.

o 연구내용 : 개인 미용 및 위생 용품(Personal care products, PCP)에는 나노에멀젼 또는 미세가루 같은 마이크로 또는 나노 사이즈의 제형이 종종 사용된다. 많은 연구에서 이러한 미세 입자들이 각질층을 통과하지 못한다고 발표하였다. 나노 사이즈의 미용제형은 피부로의 흡수를 다소 증가 또는 감소시킬 수 있다. 자외선차단제는 자외선 차단에 효과적인 불용성의 이산화티타늄(TiO2) 또는 산화아연(ZnO) 나노입자를 사용한다. 많은 연구들이 이러한 나노입자들이 피부를 통과하지 못한다고 하였다. 몇몇 연구들은 in vivo 독성 테스트에서 이산화티타늄 및 산화아연 나노물질이 무독함을 보였다. 이산화티타늄 및 산화아연 나노물질에 대한 세포독성, 유전독성, 광-유전독성, 일반독성, 발암성 연구들에서 독성이 없음을 보였고 마이크로 사이즈, 나노 사이즈에 따른 독성 변화가 없다고 하였다. 비록 소수의 in vitro 연구에서 나노사이즈에서 세포 uptake, 산화적 스트레스, 유전독성이 증가함을 발표하였으나 이런 데이터는 마이크로사이즈에서도 역시 나타난 결과이므로 해석에 주의가 필요하다. 수술기구나 MRI 조영제로 사용되는 나노입자에 대한 독성 연구에서 이들의 독성은 작은 입자 크기 때문이 아니라 입자의 화학작용에 따른 것이라고 발표하였다. 결론적으로, 선크림에 사용되는 불용성의 나노입자는 인간 건강에 위해가 없으며 오히려 자외선 차단 역할을 함으로써 피부노화나 암을 예방하는 유익한 역할을 하는 것으로 보여 진다.

(2) Dermal toxicity of ZnO nanoparticles: a worrying feature of sunscreen? (산화아연나노물질의 피부독성: 선크림에 사용하기에 적합한가?)

o 출처 :　Nanomedicine(Lond). 2012 Apr;7(4):461-3. Hackenberg S, Kleinsasser N.o 연구내용 :

각질층이 산화아연 나노입자의 침투를 막는 것으로 보인다. 선크림이 자외선차단을하는 기능이 있긴 하지만, keratinocyte에서 면역성을 유발하는등 발암, 세포독성, 유전독성이 있음이 in vitro 연구를 통하여 밝혀졌다. 따라서 산화아연

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나노물질 독성연구는 먼저 피부 투과 메커니즘을 규명하여야 한다. 이후의 연구들은 나노입자 크기, 표면 특성과 피부 투과에 대한 연구가 필요하다.

(3) Pharmacokinetics, tissue distribution, and excretion of zinc oxide nanoparticles. (산화아연 나노물질의 약물동태, 조직분포, 배설)

o 출처 : Int J Nanomedicine. 2012;7:3081-97. Epub 2012 Jun 26. Baek M. et al.o 연구내용 :

이 연구는 산화아연나노물질의 입자 사이즈에 따른 랫드에서의 약물동태, 조직 분포, 배설을 보기 위하여 수행되었다. 두가지 서로 다른 크기의 (20, 70 nm) 산화아연 나노입자를 수컷 및 암컷 랫드에 경구투여 후 AUC, 조직분포, 배설을 분석하였다. 그 결과, 혈중 산화 아연 농도는 두 사이즈 모두 24시간 동안 용량 의존적으로 증가하였으며 입자 크기나 성별에 관계 없이 주로 간, 폐, 신장 조직에 72시간 내에 축적되었다. 투여된 산화아연 나노입자 중 소량만이 뇨로 배설이 되었으며 대부분 변으로 배설되었다. 전자투과현미경과 x-ray 흡수 스펙트럼 연구를 통해 조직 내에서 산화아연이 보이지 않았으나 Zn-S 본드가 관찰되었다. 결론적으로 나노입자의 크기에 상관없이 경구로 단회 투여한 산화아연 나노물질은 혈액으로 흡수되기가 어려웠으며 간, 폐 신장이 타켓 장기로 보였다. Zn-S 본드가 형성된 것으로 보아 산화아연 나노물질은 입자 형태 보다는 이온의 형태로 흡수되는 것으로 보였으며 주로 변으로 배설되었다. 그리고 작은 입자의 산화아연이 큰 입자 보다 빨리 배설되었다. 300 mg/kg 이하의 용량군에서는 장기로 분포된 후 24시간 안에 배설되었다. 이러한 결과는 급성 및 만성독성 연구시 산화아연 나노물질의 잠재적 표적 장기에 대한 중요한 정보를 제공한다.

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[그림 3-1] Baek 등의 연구결과. 산화아연 나노물질 경구투여 후의 혈중 동태 및 조직분포

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(4) Tracing Bioavailability of ZnO Nanoparticles Using Stable Isotope Labeling (산화아연 나노물질의 안정한 동위원소 표지법을 사용한 생체이용률을 주적)

o 출처 : Environmental science&Technology. 2012, 46, 12137-12145, Fiona et al.o 연구내용 :

[그림 3-2] Fiona 등 의 연구 모식도

산화아연 나노물질은 상업 제품에 널리 사용되고 있으며 그 환경학적 거동을 아는 것은 생태계보호를 위하여 중요하다. 본 연구에서는 산화아연 나노물질을 합성하고 안정한 동위원소 68Zn로 표지하여 노출된 산화아연만을 민감하고 선택적으로 검출할 수 있도록 하였다. 높은 정확성을 가진 동위원소 측정법과 쑥(mudshrimp)과인 Corophium volutator에 68ZnO 나노입자, bulk 68ZnO, 68ZnCl2를 흙 존재 하에 물에 노출시켜 흡수를 보는 바이오이미징 기술을 사용하였다. C. volutator는 강으로 나노입자가 배출되어 축적되기에 해안가 생태계 독성 연구에 적합하다. 연구 결과, 산화아연 나노물질로부터 유래된 아연이온이 C.volutator에 흡수되었다. 아연은 주로 분해되어 수계 및 흙에서 흡수되었다. 흙의 아연에 대한 높은 흡착력은 산화아연에서 유래된 아연을 빠르게 흡착시켰다.

(5) Induction of oxidative stress, DNA damage and apoptosis in mouse liver after sub-acute oral exposure to zinc oxide nanoparticles (산화아연 나노물질 아만성 경구 노출로 인한 마우스 간의 산화적 스트레스, DNA손상, 세포사멸 유도)

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o 출처 : Mutat Res. 2012 Jun 14;745(1-2):84-91. Epub 2011 Dec 17. Sharma V. et al.

o 연구내용 :

[그림 3-3] Sharma 등의 연구 결과. 산화아연 나노물질을 처리한 마우스의 간과 신장에서의 조직병리학

산화아연 나노물질은 화장품, 음식 포장, 이미징기술 등 다양한 영역에서 사용되고 있다. 이로써 피부, 호흡기, 경구로 산화아연 나노물질의 노출이 증가하고 있다. 최근 수행된 산화아연 나노물질의 독성 연구들은 주로 in vitro 연구로, 세포-세포, 세포-세포간극에서의 상호작용 및 호르몬 영향이 무시된 경우이므로 이를 보완하기 위해서는 in vivo 연구가 필요하다. 본 연구에서는 마우스에 산화아연 나노물질을 경구 투여하여 독성 연구를 수행하였다. 산화아연 나노물질을 14일간 300mg/kg 으로 투여한 결과 산화아연 나노물질은 주로 간에 축적되어 세포 손상을 일으켰다. 이는 혈청의 alanine aminotransferase(ALT), alkaline phosphatase(ALP) 증가와 간의 병리학적 병변으로 확인되었다. 또한 산화아연 나노물질은 지질 과산화를 통하여 산화적 스트레스를 유발하였다. 간과 신장에서의 DNA 손상을 Fpg-modified Comet assay를 통해 연구한 결과, DNA 손상이 간에서 산화적 스트레스로 인해 유의하게 증가함이 확인되었다. TUNEL assay를 통해 간에서 세포자살이 유도됨을 확인하였다.

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결론적으로, 아만성적으로 경구노출된 산화아연 나노물질은 간에 주로 축적되어 DNA 손상과 세포자살을 통하여 산화적 스트레스를 일으킴을 알 수 있었다.

(6) Real-Time Investigation of Acute Toxicity of ZnO Nanoparticles on Human Lung Epithelia with Hopping Probe Ion Conductance Microscopy (Hopping probe 이온전도 현미경을 이용한 인간 폐 상피의 산화아연 급성 독성 실시간 연구)

o 출처 : Chem Res Toxicol. 2012 Feb 20;25 (2):297-304, Yang X. et al.o 연구내용 :

[그림 3-4] Yang 등의 연구결과. A549 세포의 산화아연 나노물질로 인한 세포 변형

최근 연구결과 산화아연 나노물질이 폐 상피세포에 염증반응, 세포 호흡 독성을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 하지만 그 메커니즘에 관한 연구결과는 불명확하다. 따라서 본 연구에서 인간 폐 상피세포 A549에 산화아연을 처리한 후 초기 반응을 무접촉 hopping probe 이온 전도 현미경(HPICM)을 통하여 알아보았다. 그 결과, 100μg/ml 농도의 처리 시 급성 세포막 손상이 1.5시간 내에 일어났다. 세포막 손상과 함께 lactate dehydrogenase(LDH)가 유의하게 증가하였으며 이온채널도 방해를 받았다.

(7) Pulmonary toxicity of inhaled nanoscale and fine zinc oxide particles: Mass and surface area as an exposure metric (산화아연입자의 흡입 폐 독성: 중량과 표면적으로 노출 측정)

o 출처 :　Inhal Toxicol. 2011 Dec;23(14):947-56, Ho M. et al.

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o 연구내용 : 총 표면적은 불용성 나노입자의 폐독성을 예측하는데 효과적이다. 하지만 나노입자가 빠르게 분해된다면, 중량이 독성과 관계있다. 최근 연구에서 산화아연 나노입자의 독성은 아연이온의 방출 때문임이 밝혀졌다. 따라서 중량이 산화아연 나노입자의 노출과 관계가 있다고 가정하였다. 건강한 SD 랫드에 저용량, 중용량, 고용량의 35, 250 nm 의 산화아연 나노입자를 흡입 노출시켰다. 기관지폐포세척액을 모아 폐 염증반응, 손상, 산화적스트레스를 알아보았다. 그 결과, 중량이 중성구의 유도와 연관성이 있었다. 유사하게, 표면적 또한 중성구 유도와 연관이 있었다. 결론적으로 이전에는 표면적만이 나노물질의 폐 독성과 연관이 있다고 알려졌으나 본 연구를 통하여 중량과 표면적이 산화아연 나노물질의 폐 독성을 예측하는데 효과적임이 밝혀졌다. 그리고 산화아연 나노물질의 아연 이온 방출이 독성을 유도하는데 중요한 역할을 함 또한 밝혔다.

(8) Zinc oxide nanoparticles interfere with zinc ion homeostasis to cause cytotoxicity(산화아연 나노입자는 아연 이온 항상성을 방해하여 세포독성을 일으킨다.)

o 출처 : Toxicol Sci. 2012 Feb;125(2):462-72. Epub 2011 Nov 23, Kao Y.Y. et al.o 연구내용 :

[그림 3-5] Kao 등의 연구결과. 산화아연 나노물질의 독성학적 메커니즘

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산화아연 나노물질의 독성 연구가 증가하고 있다. 산화아연 나노물질의 독성이 분해와 관련이 있다고 알려져 있지만, 세포질의 아연 이온 항상성에 영향을 주는 산화아연 나노물질의 메커니즘은 아직 불분명하다. 본 연구에서는 FluoZin-3, RhodZin-3을 이용하여 세포질과 미토콘드리아의 아연 이온 농도를 in vivo 및 in vitro 환경에서 측정하였다. 인간 leukemia Jurkat 세포와, 폐세포(H1355)에 산화아연 나노물질을 처리하였을 때 세포질과 미콘드리아내의 아연 이온 농도가 증가하였다. H1355 세포에서는 미토콘드리아 막의 탈분극, caspase-3 활성, Lactic dehydrogenase 유리가 일어났다. in vivo 시험에서는 랫드에 산화아연 나노물질을 처리하였을 때 Broncho-alveolar lavage(BAL)세포와 백혈구의 세포질 및 미토콘드리아 내 아연 이온 농도가 증가하였으며, LDH도 증가하였다. 결론적으로 산화아연 나노물질의 독성 메커니즘은 산화아연의 분해로 세포질 내의 아연 이온농도 증가하고 그에 따라 미토콘드리아 내 아연이온 농도가 증가하여 미토콘드리아 기능 장애, caspase 활성화, 세포사멸이 일어나는 것으로 보인다.

(9) Toxicity of zinc oxide nanoparticles through oral route (산화아연 나노입자의 경구독성)

o 출처 : Toxicol Ind Health. 2012 Sep;28(8):675-86. Epub 2011 Oct 27, Pasupuleti S.

o 연구내용 :

[그림 3-6] Pasupuleti 등의 연구 결과. 나노사이즈의 산화아연을 처리한 군의 혈 중 ALT, AST, Ca 농도가 증가함

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나노사이즈의 산화아연(20 nm)과 마이크로 사이즈의 산화아연을 SD 랫드에 경구투여 후 급성독성시험을 하였다. 실험동물은 수컷, 암컷 8, 9주령의 SD 랫드를 사용하였으며 용량은 5, 50, 300, 1000, 2000 mg/kg 용량으로 산화아연 물질을 경구로 투여하였다. 투여 14일 후에 혈액학적, 혈액생화학적 검사를 시행하였으며 장기들에 대한 조직병리학적 검사를 실시하였다. 용량에 역으로 의존적으로 나노 사이즈의 산화아연 처리군에서 혈 중 ALT, AST 농도가 증가하였으며 응고시간에도 영향을 주었다. 현미경으로 간, 췌장, 심장, 위의 병변을 관찰한 결과 나노입자 처리군의 경우 고용량에서보다 저용량의 나노입자 처리군에서 병변이 많이 나타났다. 하지만 마이크로 사이즈의 산화아연 처리군에서는 고용량일수록 병변이 많이 나타났다. 결론적으로 산화아연 나노입자는 낮은 용량에서 높은 독성을 나타냄을 알 수 있었으며 기존의 in vivo 시험 시 용량 의존적인 독성이 나타나는 것과는 차이가 있었다.

(10) Solubility of nano-zinc oxide in environmentally and biologically important matrices (환경적, 생물학적으로 중요한 산화아연 나노입자의 용해성)

o 출처 : Environ Toxicol Chem. 2012 Jan;31(1):93-9, Reed R. B.o 연구내용 :

나노입자의 활용이 커짐에 따라 나노입자가 환경으로 유출되어 생물에 노출될 가능성이 높아지고 있다. 특히 산화아연의 경우, 산화아연 나노입자 자체, 산화아연에서 유리된 아연이온, 또는 그 둘이 동시에 작용하는 것인지는 불명확하나 독성이 있다. 따라서 본 연구는 상업적으로 이용 가능한 산화아연, 직접 합성한 산화아연에 대하여 환경학적 거동, 생물학적 독성 연구에 사용되는 매질에서의 상대적 가용성을 알아보았다. nanopure water, RPMI-1640에서 산화아연의 분해가 나타났으며 DMEM 배지에서는 분해가 더욱 활발히 일어났다. 경수의 경우 Zn carbonate 침전의 형성으로 아연의 용해성이 낮았다. 결론적으로, 시험 환경에 따라 산화아연 분해가 촉진될 수 있음을 알 수 있었다.

(11) Organ biodistribution, clearance, and genotoxicity of orally administered zinc oxide nanoparticles in mice (아연나노의 마우스 경구투여 후 조직분포, 배설 및 유전독성에 관한 연구)

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o 출처 : Nanotoxicology. 2012 Nov;6:746-56, Li C. H. et al.o 연구내용 :

대만의 Li 등은 2011년에 Nanotoxicology에 마우스에 경구투여 한 아연나노의 조직분포와 배설, 유전독성에 관한 연구를 수행하였는데, 나노입자 (50 nm 수준)와 마이크로 입자(1200 nm 수준)의 아연입자를 경구투여와 복강투여의 두가지 경로로 투여한 후 혈중 농도를 비교하였다. 두 가지 형태의 입자 모두 투여 후 30분 후에는 혈중으로 흡수되는 것이 확인되었으며 간, 비장, 신장 등으로 분포되는 것이 확인되었다. 혈중농도는 큰 차이를 보이지 않으나 경구투여의 경우보다는 복강투여시 혈중에 머무르는 시간이 길게 나타났으며 조직 중으로의 보다 용이하게 분포되는 것이 확인되었다. 나노입자는 마이크로입자에 비해 흡수율과 조직분포가 높게 나타나는 것이 확인되었으며 경구투여된 아연나노의 대부분은 간조직에 분포되는 것으로 나타났다. 아울러 간조직의 손상이 초래되었다. in vitro 시험에서는 활성산소종을 생성하여 세포독성을 발현하는 것이 확인되었다.

[그림 3-7] Li 등의 연구결과. 산화아연 복강주사 및 경구투여 후의 혈중아연농도 변화

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(12) Reapeated dose dermal toxicity study of nano zinc oxide with Sprague-Dawley rats (SD랫드에서의 아연나노의 반복투여 경피독성연구)

o 출처 : Cutan Ocul Toxicol. 2012 Mar;31(1):26-32, Surekha P. et al.o 연구내용 :

인도의 Surekha 등은 피부경로를 통해 현실적으로 노출 가능한 용량에서의 아연나노의 위해성을 규명해보고자 연구를 수행하였다. 입경 약 20nm 아연나노를 75, 180, 360 mg/kg용량으로 주 5일 28일간 투여하였다. 이때 투여용량은 태양광선차단제 화장품을 바르는 횟수 양 등을 사람의 체중에 고려하여 현실적으로 노출 가능한 용량을 기반으로 선정하였다. 투여한 후 피부 콜라겐 양을 측정하였다. 그 결과 아연나노를 처리한 그룹에서는 용량반비례로 콜라겐 함량이 감소되는 것을 확인할 수 있었다.

[그림 3-8] Surekha 등의 연구결과. 피부의 콜라겐 함량

(13) Repetitive exposure to zinc oxide nanoparticles induces DNA damage in human nasal mucosa mini organ cultures (산화아연 나노입자 반복 노출로 인한 인간 코점막 조직의 DNA 손상 유도 )

o 출처 :　Environ Mol Mutagen. 2011 Aug;52(7):582-9, Hackenberg S. et al.o 연구내용 :

산화아연 나노입자의 독성 연구는 아직 불충분하다. 산화아연 나노입자는 흡입 또는 경구로 인간에 노출될 수 있다. 본 연구의 목적은 3차원적인 인간 코 점막 mini odrgan cultures(MOCs)를 통하여 산화아연 나노입자를 반복 노출시켜 유전독성을 알아보는데 있다. 10명의 환자의 코 점막 MOC와 산화아연 나노입자를 1주일간

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배양한 후 전자 현미경을 통해 관찰하였다. 점막 MOC는 배양 1주일 후 섬모로 덮여 있었으며 산화아연 나노입자는 세포질과 핵에 노출 되었다. MOC 는 0.1 또는 5 μg/ml농도의 산화아연에 1시간씩 1회,2회 또는 3회 노출된 후 세포독성 및 유전독성을 평가하였다. trypan blue exclusion, caspase-3 활성 연구에서 산화아연은 유의성이 이는 세포독성 또는 세포자살을 나타내지 않았다. 하지만, 단회 투여에 비하여 반복 투여된 고용량군에서 DNA 손상, DNA fragmentation이 나타났다. 따라서 산화아연 나노입자는 낮은 농도로 반복 투여되었을 때 DNA 손상을 나타낼 수 있음을 알 수 있었다.

[그림 3-9] Hackenberg 등의 연구 결과. 산화아연 나노물질로 인한 세포 손상의 메커니즘 모식도

(14) Zinc oxide nanoparticles induced genotoxicity in primary human epidermal keratinocytes (일차 배양 사람 각질세포에서 아연나노의 유전독성 발현)

o 출처 : J Nanosci Nanotechnol. 2011 May;11(5):3782-8, Sharma V. et al.o 연구내용 :

사람의 피부 (표피)에서 가장 높은 비율로 존재하는 각질세포 (Human Epidermal Keratinocytes, HEK)를 일차배양하고 아연나노의 독성을 평가하였다. 세포 투과 정도를 전자현미경으로 관찰하여 피부투과성을 평가한 결과 14 μg/ml 농도의

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아연나노를 처리한 6시간 후에 아연나노입자는 세포 안으로 유입되는 것이 확인되었다. MTT assay에 의하면 아연나노는 노출시간에 따라, 농도증가에 따라 세포독성을 증가시키는 것으로 확인되었으며 8, 14 μg/ml 농도 수준으로 아연나노를 6 시간동안 처리할 경우 Comet assay에 의해 평가한 결과 DNA손상이 나타나는 것이 확인되었다. 따라서 화장품 등 소비제품에서 아연나노를 사용할 경우 인체 위해성에 주의하여야 한다.

(15) Chronic toxicity of ZnO nanoparticles, non-nano ZnO and ZnCl2 to Folsomia candida (Collembola) in relation to bioavailability in soil (Folsomia candida (톡토기)의 산화아연 나노입자, 나노입자가 아닌 산화아연, ZnCl2에 대한 만성 독성 연구)

o 출처 : Environ Pollut. 2011 Oct;159(10):2713-9, Kool P.L. et al.o 연구내용 :

산화아연 나노입자(ZnO-NP)의 Folsomia candida 에 대한 만성 독성 연구를 토양에서 실시하였다. 입자 크기, 아연 이온과 나노입자 독성 비교를 위하여 나노입자가 아닌 산화아연(non-nano ZnO), ZnCl2에 대한 독성 또한 연구하였다. 토양의 농도가 증가할수록 물의 아연 농도가 Freundlich sorption constants Kf 값에 따라 증가하였다. Folsomia candida의 생존률은 산화아연 나노입자, 나노입자가 아닌 산화아연의 6400 mg/kg 농도까지 영향이 없었다. 생식능은 용량 의존적으로 감소하였다. 이때 28d EC50은 ZnO-NP, non-nano ZnO, ZnCl2에서 각각 1964, 1594, 298 mg/kg 이었다. 결론적으로 산화아연 입자의 크기 보다는 나노입자에서 유리된 아연 이온이 독성에 더 큰 영향을 미치는 것을 알 수 있었다.

[그림 3-10] Kool 등의 연구 결과. 산화아연 나노입자, 나노입자가 아닌 산화아연, ZnCl2의 Folsomia candida 28일 노출에 대한 LC50, EC50, EC10

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(16) Cytotoxicity and uptake of zinc oxide nanoparticles leading to enhanced inflammatory cytokines levels in murine macrophages: comparison with bulk zinc oxide. (설치류 대식세포에서 산화아연 나노입자로 유도된 세포독성으로 인한 염증반응: 마이크로사이즈 산화아연과 비교)

o 출처 : J Biomed Nanotechnol. 2011 Feb;7(1):110-1, Roy R. et al.o 연구내용 :

나노기술의 발전에 따라 안전성에 관한 문제가 대두되고 있다. 면역계는 host를 외부 물질로부터 방어하는 주요 역할을 하는데 그 중 대식세포의 활성은 외부 물질의 입자 크기에 의존적이다. 따라서 본 연구는 산화아연 나노입자와 벌크한 산화아연 나노입자의 설치류 마크로파지세포에 대한 세포독성 및 세포 uptake 비교 연구를 실시하였다. 그 결과, 나노입자가 더 강하게 pro-염증반응 cytokine을 자극하였다.

(17) Zinc oxide nanoparticles induce oxidative stress and genotoxicity in human liver cells (HepG2) (산화아연 나노물질은 인간 간세포(HepG2)에 산화적 스트레스와 유전 독성을 유도한다.)

o 출처 :　J Biomed Nanotechnol. 2011 Feb;7(1):98-9, Sharma V. et al.o 연구내용 :

인간은 산화아연 나노물질에 다양한 경로로 노출되기에 간에 노출될 것으로 보인다. 따라서 본 연구는 산화아연 나노물질의 인간 간세포(HepG2)에 대한 세포 독성 및 유전독성 연구를 실시하였다. MTT, neutral red uptake assay 연구 결과 용량(14, 20μg/ml) 및 시간(12, 24h) 의존적으로 독성이 증가하였다. Olive tail moment(OTM), comet assay를 통하여 DNA 손상을 확인할 수 있었다. 세포 내 ROS 생성으로 산화적 스트레스를 통해 DNA 손상이 일어나 세포 독성을 가져온 것으로 보인다.

(18) Safety evaluation of sunscreen formulations containing titanium dioxide and zinc oxide nanoparticles in UVB sunburned skin: an in vitro and in vivo study (UVB에 노출된 피부의 이산화티타늄과 산화아연 나노입자를 포함하는 선크림 제형을 사용했을 때의 안전성 평가 : in vivo, in vitro 연구 )

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o 출처 : J Biomed Nanotechnol. 2011 Feb;7(1):98-9, Sharma V. et al.o 연구내용:

이산화티타늄 및 산화아연 나노입자가 UVB를 피부에서 보호하는 작용을 가지고 있기에 선크림에 많이 사용하고 있다. 돼지에 UVB를 노출시켰을 때 피부화상이 생겼다. in vitro 연구에서는 flow-through diffusion 세포에 24시간동안 네가지 선크림 제형을 처리하였다(10% coated TiO2 in o/w, 5% coated ZnO in o/w, 5% uncoated ZnO in o/w). Scanning electron microscopy(SEM), transmission electron microscopy (TEM), time-of-flight secondary ion mass spectrometry(TOF-SIMS) 로 피부를 관찰하였다. TEM 관찰 결과, TiO2는 각질층을 통과하였으나 ZnO는 표면에 남아있었다. TOF-SIMS 관찰 결과, TiO2, ZnO 모두 표피를 통과하였다. ICP-MS를 통해 측정 결과 적은 량만이 피부를 통과함을 알 수 있었다. in vivo 연구에서는 피부에 24, 48시간에 각각의 제형을 노출 시킨 결과 TiO2 NP in o/w 는 UVB 노출된 피부에서는 각질층을 13 층을 통과한 반면 정상 피부에서는 7층을 통과하였다. TiO2 in w/o 의 경우 더 깊이 침투하였다. ZnO의 경우 1~2층까지 침투하였다. SEM 관찰 결과 나노입자가 피부에서 응집되는 것으로 보였다. 요약하면, UVB에 의해 손상된 피부는 쉽게 TiO2 또는 ZnO 나노입자가 각질층에 침투하였으나 모두 표피를 통과하지는 못했다.

(19) A novel approach reveals that zinc oxide nanoparticles are bioavailable and toxic after dietary exposures (산화아연 나노물질은 음식으로 노출되었을 때 생물학적으로 이용가능하며 독성이 있다.)

o 출처 :　Nanotoxicology. 2011 Mar;5(1):79-90, Croteau M.N. et al.o 연구내용:

음식을 통한 나노물질의 노출에 대한 연구는 거의 없다. 본 연구에서 동위원소로 변형된 (67)ZnO 나노 입자를 음식과 함께 달팽이에 노출시켰다. 산화아연나노입자에서 유래된 (67)Zn은 토양을 통해 생물 체내로 흡수되었다. 산화아연의 응집에 의해 생체이용률이 줄어들거나 독성이 감소하지 않았다. 산화아연을 섭취함으로써 소화 장애가 왔다: 달팽이의 먹는 양, 대변 양이 적었고, 효과적으로 음식을 소화시키지 못했다. 하지만 이것이 산화아연 나노물질의 영향인지 아연의 영향인지에 대해서는 알 수가 없다. 추후에 연구가 더 필요하다.

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(20) Acute toxicity of ferric oxide and zinc oxide nanoparticles in rats. (랫드에서 철나노, 아연나노의 급성독성)

o 출처 : J Nanosci Nanotechnol. 2010 Dec;10(12):8617-24, Wang L. et al.o 연구내용:

철나노 (Fe2O3)dp 대해서는 8.5 mg/kg bw 용량으로, 아연나노 (ZnO)는 2.5 mg/kg용량으로 하루 2회씩 3일 동안 처리한 랫드에 대해 독성을 측정하였다. 3일 동안 처리한 후 12시간, 36시간 후에 조직에서의 각각 철과 아연 축적상태를 측정하였고, 혈청생화학, 혈액분석 등을 실시하였다. 그 결과 철나노를 투여한 랫드의 간과 폐에서 철의 농도가 높게 검출되었고, 아연을 투여한 랫드에서는 간에서 아연의 함량이 높게 검출되었다. ALT, AST, ALP, TP, CK, LDH 값이 처리군에서 낮게 나타났다. 조직병리학적 검사결과 간과 폐에서 심각한 조직손상이 관찰되었다. 간과 폐에서의 조직손상은 투여기간 이후에도 지속적으로 관찰되었음에도 불구하고 나노물질에 의해 혈청 효소활성의 상승은 나타나지 않았다.

(21) Role of the dissolved zinc ion and reactive oxygen species in cytotoxicity of ZnO nanoparticles. (아연나노입자의 세포독성발현에 있어서 용해 아연이온과 활성산소의 역할)

o 출처 :　Toxicol Lett. 2010 Dec 15;199(3):389-97, Song W. et al.o 연구내용:

입자의 모양과 입경의 크기가 서로 다른 아연나노에 대해 마우스 마크로파지 Ana-1세포주에 대한 세포독성을 연구하였으며 아울러 아연나노의 독성에 있어서 아연이온 Zn2+의 역할에 대해 조사하였다. 아연나노는 입경의 크기에 상관없이 Ana-1세포에 농도 의존적으로 독성을 나타내었으며, 나노 입자의 모양이 세포독성에 영향을 줄 수 있는 것으로 추정되었다. 용해 아연이온 Zn2+ 이 세포배양배지와 평형에 도달할 경우 10 μg/ml수준이며 이때 세포의 50% 정도가 치사되는 것으로 확인되었다. 이 농도는 ZnCl2의 IC50 (13.33 Zn μg/ml)과 유사한 수준이었다. 아연이온이 첨가된 배지 상등액의 Zn2+ 의 농도와 세포독성은 상관성이 매우 높았으며 따라서 용해된 아연이온 Zn2+이 아연나노의 주요 독성발현에 기여하는 것으로 생각되었다.

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[그림 3-11] Song 등의 연구결과. 산화아연 나노입자 및 ZnCl2에 노출 된 Ana-1 세포의 IC50

(22) Stability, bioavailability, and bacterial toxicity of ZnO and iron-doped ZnO nanoparticles in aquatic media (Aquatic media에서 산화아연 및 철-doped 산화아연 나노입자의 안정성, 생체이용률, 항미생물작용 연구)

o 출처 : Environ Sci Technol. 2011 Jan 15;45(2):755-61, Li M. et al.o 연구내용:

나노입자의 안정성, 생체이용률은 나노입자 사이의 aquatic media, 생물체, 세포에 따라 결정된다. 여기서, High-throuhput screening(HTS)를 이용하여 산화아연 나노입자에 철 도핑의 수준, 수계 화학, 미생물 종에 따른 안정성, 생체이용률, 항미생물 메커니즘 연구를 실시하였다. 산화아연 나노물질의 제타포텐셜과 응집은 철 도핑의 정도와 이온 구성, 유기물 등에 영향을 받았으며 항미생물작용은 산화아연에서 방출되는 아연 이온 농도, 세포 종류, 유기물에 영향을 받았다. Bacillus subtilis와 Escherichia coli 에 대한 IC50은 각각 0.3-0.5, 15-43 mg/L( Zn이온 농도로써) 였으며 Pseudomonas putida 의 IC50 은 >500 mg/L였다. Tannic acid는 humic, fulvi, alginic acid 에 비하여 산화아연 나노물질과 복합체를 형성함으로써 생체이용률을 감소시켜 산화아연 나노물질에 의한 독성을 감소시켰다.

(23) Comparative chronic toxicity of nanoparticulate and ionic zinc to the earthworm Eisenia veneta in a soil matrix (Eisenia veneta 의 토양 내에서 노출되는 산화아연 나노입자와 아연 이온 만성 독성 비교 연구)

o 출처 :　Environ Int. 2011 Aug;37(6):1111-7, Hooper H. L. et al.o 연구내용:

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산화아연 나노입자는 널리 사용되고 있으며 수계에 노출되었을 때 잠재적으로 독성 위험이 있다. 산화아연 나노입자는 또한 토양 생물에 노출될 수 있는데 토양에서의 연구는 아직 부족하다. 본 연구에서는 지렁이 Eisenia veneta에 코팅이 되지 않은 산화아연 나노입자(<100nm), 이온형 아연 (ZnCl2)를 토양 및 음식에 250, 750 mg/kg 으로 21일간 노출시켰다. 그 결과, 두 가지 물질 모두 life history 특성, 면역 활성에 영향을 주었다. 체내 아연 농도 분석에서 나노입자의 경우 약간 더 높은 값이 나왔으나 독성 endpoint 에서는 아연 이온의 경우 영향이 더 컸다. 750 mg/kg 용량에서 나노입자의 경우 생식능이 50% 감소하였으나 아연 이온의 경우 거의 완벽하게 감소하였다. 그리고 면역 활성의 경우 나노입자의 경우 영향을 받지 않았으나 아연 이온의 경우 20%가 감소되었다. 24시간 노출 후 SEM 분석 결과 산화아연이 체 내 존재한 것으로 보아 나노 입자가 입자의 형태로 생체 내로 들어갈 수 있음을 확인할 수 있었다.

[그림 3-12] Hooper 등의 연구 결과. 산화아연이 지렁이 체내에 축적됨

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(24) Cytotoxicity of zinc oxide nanoparticles: importance of microenvironment. (산화 아연 나노입자의 세포독성: 미세환경의 중요성)

o 출처 : J Nanosci Nanotechnol. 2010 Dec;10(12):8638-45, Yang S. T. et al.o 연구내용:

산화아연 나노입자가 화장품을 포함한 여러 분야에 활용되고 있으나 그 독성이 알려지면서 건강에 미치는 영향에 대한 문제가 대두되고 있다. 본 연구에서 세포독성 연구와, 독성연구를 하는 미세 환경의 역할에 대한 연구를 실시하였다. 그 결과, NIH/3T3 세포에 높은 독성이 있어 세포 생존률이 감소하였고, 세포막 파괴, 세포 모형 변화 등이 일어났다. 미세 환경에서, CO2 가 산화아연 나노입자의 용해성을 증가시켜 아연 이온 누출이 증가하여 세포독성을 증가시키는 것으로 보였다. 산화아연 나노독성 연구를 하는데 실험 환경 조건이 중요함을 알 수 있었다.

(25) Toxicity of zinc oxide(ZnO) nanoparticles on human bronchial epithelial cells(BEAS-2B) is accentuated by oxidative stress (산화아연 나노입자의 인간 기관지 상피세포(BEAS-2B)에 대한 독성은 산화적 스트레스로 인해 증가하였다.)

o 출처 :　Food Chem Toxicol. 2010 Jun;48(6):1762-6, Heng B. C. et al.o 연구내용:

몇몇 나노입자의 세포 독성 연구들에서 나노입자의 세포 독성은 산화적 스트레스 유도 때문임이 알려져 있으나 세포의 산화적 스트레스 그 자체가 나노입자의 세포독성의 민감성에 어떤 영향을 미치는지에 대한 연구는 불분명하다. 염증과 같은 병의 경우 산화적 스트레스 증가와 관련이 있기 때문에 나노입자가 세포독성 민감성을 증가시킬 수 있어 임상적으로 중요하다. 본 연구는 산화적스트레스를 일으킨 BEAS-2B세포에 산화아연(10 nm)을 처리하였을 때 어떤 세포독성이 나타나는지에 대한 연구를 실시하였다. BEAS-2B세포를 먼저 5, 10 μM의 H2O2에 45분간 노출 시킨 후 H2O2를 제거하고 5-25μg/ml의 산화아연 나노물질을24시간 처리하였을 때의 세포 생존률을 WST-8 분석법을 이용하여 알아보았다. 그 결과, 초기 산화적 스트레스 유도로 세포 생존률이 감소하였다. 음성 대조군의 경우에도 산화아연 농도가 10μg/ml이상으로 증가할 시 세포 독성이 증가하였다. 5, 10 μM의 H2O2에 노출 된 후 산화아연에 노출 된 경우 10 μg/ml 이하의 농도에서도 세포 생존률이 급격히 하락하였다.

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산화아연 10μg/ml 농도에서 10μM H2O2에 먼저 노출된 세포의 경우 세포 생존률은 40.6%였으며 5μM H2O2에 먼저 노출된 세포의 경우 세포 생존률은 72.8%, H2O2에 노출되지 않은 경우 99.9% 였다. 결론적으로 산화적 스트레스를 받고 있는 세포에 산화아연 나노물질이 노출 될 시 세포 독성이 더욱 증가함을 알 수 있었다.

[그림 3-13] Heng 등의 연구결과. 산화아연 농도가 증가함에 따라 BEAS-2B 세포 생존률 감소

(26) Comparison of the mechanism of toxicity of zinc oxide and cerium oxide nanoparticles based on dissolution and oxidative stress properties (산화아연 나노입자의 인간 기관지 상피세포(BEAS-2B)에 대한 독성은 산화적 스트레스로 인해 증가하였다.)

o 출처 : ACS Nano. 2008 Oct 28;2(10):2121-34, Xia T. et al.o 연구내용:

세 가지 금속 나노입자 TiO2, ZnO, CeO2를 flame spray pyrolysis 과정으로 합성한 후 RAW341.7, BEAS-2B 세포 uptake, 세포 내 위치, 산화적 스트레스 유도에 대해 알아보았다. 그 결과 산화아연의 경우 TiO2, CeO2보다 강하게 두 세포 모두에서 독성을 나타내었으며 ROS생성, 산화적 손상, 염증반응, 세포 죽음이 증가하였다. ICP-MS, 형광 라벨된 산화아연을 통해 산화아연의 분해가 일어날 수 있음을 알 수 있었고 분해되지 않은 산화아연의 경우 BEAS-2B 에서는 세포낭에 들어가 있고 RAW264.7에서는 라이소좀에 들어가 있음이 확인되었다.

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[그림 3-14] Xia 등의 연구결과. RAW274.7 세포에서의 CeO2, ZnO, TiO2의 산화적 스트레스 연구

(27) DNA damaging potential of zinc oxide nanoparticles in human epidermal cells (인간 상피 세포의 산화아연 나노입자로 인한 DNA 손상)

o 출처 : Toxicol Lett. 2009 Mar 28;185(3):211-8, Sharma V. et al.o 연구내용:

나노물질의 경우 입자가 매우 작기 때문에 체내 DNA 와 같은 거대분자와 직접적으로 상호작용을 일으킬 수 있다. 본 연구는 화장품에 널리 사용되고 있는 산화아연 나노입자의 유전독성, 인간 피부 세포(A431)에 대한 피부독성 연구를 실시하였다. 그 결과, 시간, 산화아연 노출 농도에 따른 세포성장률이 억제되는 것을 확인하엿다. 그리고 Comet assay를 통해 Olive tail moment(OTM)이 대조군에 비하여 증가함을 확인하였다. 그리고 산화아연 나노입자는 세포의 글루타치온, 카탈라아제, superoxide dismutase를 고갈시켜 산화적 스트레스를 일으켰다. 결론적으로 산화아

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연은 매우 낮은 농도에서도 지질 과산화, 산화적 스트레스를 통해 유전독성을 일으킴을 확인하였다.

[그림 3-15] Sharma 등의 연구 결과. A431세포의 산화아연 나노물질 처리에 따른 olive tail moment 증가

(28) Comparative toxicity of nanoparticulate ZnO, bulk ZnO, and ZnCl2 to a freshwater microalga(Pseudokirchneriella subcapitata): the importance of particle solubility (산화아연나노입자, bulk 산화아연, 아연이온이 담수의 미세조류(Pseudokirchneriella subcapitata)에 대한 독성 비교 연구: 입자용해성의 중요성)

o 출처 : Environ Sci Technol. 2007 Dec 15;41(24):8484-90, Franklin N. M. et al.o 연구내용:

금속 나노입자는 여러 분야에서 사용되고 있으며 환경 거동, 잠재적 독성에 대한 우려가 높아지고 있다. 나노입자는 수계에서도 작은 입자를 유지하고 있어 큰 입자들 보다 생체이용률이 높을 것으로 생각되고 있다. 본 연구는 30nm의 산화아연 TEM, DSL 기술을 통해 입자 특성을 분석하여 입자의 응집이 중요함을 확인하였다. 수계에서는 입자가 수백 나노미터에서 마이크로미터까지 성장하였다. 그리고 산화아연 나노입자의 경우 빠르게 아연 이온으로 분해되었다. 독성연구 결과 담수 조류 Pseudokirchneriella subcapitata 의 72시간 IC50을 측정한 결과 약 60 μg/L 였다. 결론적으로 독성 연구 시 나노입자의 분해를 고려하여야 할 것이다.

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[그림 3-16] Franklin 등의 연구 결과. Pseudokirchneriella subcapitat 의 ZnCl2, Bulk ZnO, 산화아연 나노입자에 대한 72h-IC50

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3. 독성동태시험

가. 독성시험계에서의 산화아연의 안정성

(1) 정맥주사용 제제에서 산화아연나노의 분산성

o 산화아연 나노물질의 정맥주사용제재의 안정성을 알아보기 위하여 탈이온수 (DDW),

Phosphate Buffered Saline (PBS), NaCl 0.9%, 글루코스 5%에 각각 산화아연을 10,

100, 1,000, 10,000 ppm의 농도로 현탁시켜 나노물질의 분산성을 확인하였다.

o 그 결과, DDW, NaCl 0.9%, 글루코스 5% 에서는 산화아연 나노물질이 침전을

나타내지 않았으나 PBS 에서는 현탁 1시간 내에 모든 농도에서 침전을 일으켰다.

한편, NaCl 0.9% 에서는 현탁 후 24시간 경과 후 침전이 생기는 것이 확인되었다.

[그림 3-17] 산화아연 나노물질의 정맥주사용 제제에서의 분산성

o 위 그림은 DDW, PBS, 글루코스 5%, NaCl 0.9%에서 산화아연 나노물질을 10,000,

1,000, 100, 10 ppm으로 현탁한 용액의 분산성을 보여주고 있다.

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(2) 정맥주사용 제제에서 산화아연의 사이즈 분석

o 분산성을 육안으로 학인한 후 본 연구의 vehicle로서 5% 글루코스 용액이 가장 적절

하다고 판단되어 이를 본 연구의 시험용제(vehicle)로 선정하였으며 이후 DLS를 이

용한 입경분포분석을 실시하였다.

[그림 3-18] 산화아연 나노물질의 초순수 증류수에서의 입경분포

o 위 그림은 탈이온수에서의 산화아연나노물질의 입경분포 결과이며 100, 1,000, 10,000,

15,000 ppm농도로 초순수 증류수에 분산된 산화아연나노물질 입경분포를 보여주고

있다. 100 ppm에서는 14.9±8.7 nm, 1,000 ppm에서는 18.8±9.1 nm, 10,000 pom에서는

11.3±6.4 nm, 15,000 ppm에서는 14.8±7.7 nm의 평균 입경값을 나타내었다.

- 57 -

[그림 3-19] 산화아연 나노물질의 글루코스 5 %에서의 사이즈 분석

o 위 그림은 산화아연 나노물질의 글루코스 5%용액에서의 사이즈 분석을 나타내며 100,

1,000, 10,000, 15,000 ppm농도로 글루코스 5%용액에 분산된 산화아연나노물질의 입경

분포를 보여주고 있다. 100 ppm에서는 18.4±10.569 nm, 1,000 ppm에서는 23.2±10.8

nm, 10,000 pom에서는 11.9±6.9 nm, 15,000 ppm에서는 14.4±8.1 nm 수준을

유지하였다.

- 58 -

[그림 3-20] 글루코스 5%에 현탁된 산화아연 나노물질의 Fetal Bovine Serum(FBS)에서의 사이즈 분석

o 위 그림은 글루코스 5%에 현탁된 산화아연 나노물질의 Fetal Bovine

Serum(FBS)에서의 사이즈 분석을 나타내며 100, 1,000, 10,000, 15,000 ppm 농도로

글루코스 5%용액에 분산된 산화아연나노물질을 FBS과 1:9 용량비로 희석하였을 때

산화아연나노물질의 입경분포를 보여주고 있다. 100 ppm에서는 7.1±4.9 nm, 1,000

ppm에서는 8.4±6.0 nm, 10,000 pom에서는 43.7±23.0 nm, 15,000 ppm에서는 53.9±29.4

nm 수준을 유지하였다.

o 따라서 글루코스 5% 용액은 정맥주사용 용매로 사용하기 적합하다고 판단하였다.

- 59 -

(3) 인공 위액에서의 안정성

o 산화아연나노물질을 경구로 투여할 경우 위산과 혼화하게 된다. 만약 나노물질이 위

액의 낮은 pH와 만나게 될 경우 나노입자의 안정성이 훼손될 가능성이 높다. 따라서

본 연구에서는 산화아연나노입자를 인공위액 (pH 2)에 혼화하고 응집여부를 평가하

였다.

o 인공위액에 산화아연 나노물질을 10,000 ppm으로 희석하였을 때 희석함과 동시에

침전이 발생하였다. 따라서 위 내에서는 위산의 영향으로 산화아연이 침전될 것임을

예상할 수 있었다.

[그림 3-21] 산화아연 나노물질의 인공위액에서의 응집현상

나. 독성동태시험

(1) 혈중 아연 농도변화 및 Toxicokinetic parameter 산출

o Sigma Aldrich사에서 제조한 산화아연 나노물질(Product number : 721077)을 5%

글루코스에 현탁시킨 후 Sprague Dawley 랫드 (8주령, 200~250g, 수컷, 특정병원체

부재 SPF, 그룹 당 4마리)에 경구투여 및 정맥투여 하였다.

- 고용량군: 30 mg/kg, 저용량군: 3 mg/kg

o 계획된 채혈시간에 200 μl의 혈액을 랫드의 경정맥에서 채취한 후 ICP-AES를 통하여

아연 분석을 실시한 결과 값은 [표 3-2]와 같다.

o 경구투여 시 고용량과 저용량 군 모두 대조군에 비하여 혈중 아연 농도가 높아지지

않았으며 정맥주사 시 고용량 및 저용량군에서 투여 5분 후 혈중 아연 농도가 급격히

증가하여 2일 까지 서서히 감소되었다.

- 60 -

o 정맥주사 시 고용량 투여군의 경우, 투여 5분 후의 혈중 아연 평균농도는 41.07±7.16

μg/ml 이었으며 이후 시간 경과에 따라 농도가 감소하기 시작하여 2시간 후에는

16.24±0.62 μg/ml 수준으로 떨어져 혈중 아연 농도가 초기 최고농도의 60% 정도로

감소하였다.

o 정맥주사 시 저용량 투여군의 경우, 투여 5분 후의 혈중 아연 평균농도는 9.90±0.42

μg/ml 이었으며 이후 시간 경과에 따라 농도가 감소하기 시작하여 2시간 후에는

6.01±0.71 μg/ml 수준으로 떨어져 혈중 아연 농도가 40% 정도 감소하였다.

o 위의 결과로 보아 3, 30 mg/kg 용량으로 산화아연 나노물질을 경구투여 시

위장관에서 혈관으로 아연 흡수가 거의 일어나지 않으며 정맥주사 시 혈중에서

빠르게 조직으로 분포되어 2일 안에 모든 아연이 혈중에서 빠져나감을 알 수 있었다.

[표 3-2] 산화아연 나노물질 경구 및 정맥투여 후 혈중 아연 농도 변화

- 61 -

Blood p.o 7day

0 1 2 3 4 5 6 7

0

10

20

30

40

503 mg/kg30 mg/kgControl

Time (day)

Zn ( m

g/m

l)

Blood p.o 2h

0 30 60 90 120

0

10

20

30

40

50Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (min)

Zn ( m

g/m

l)

[그림 3-22] 산화아연 나노물질 경구투여 후 혈중 아연 농도의 경시변화

- 62 -

Blood i.v 7day

0 1 2 3 4 5 6 7

0

10

20

30

40

50

Control

3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn ( m

g/m

l)

Blood i.v 2h

0 30 60 90 120

0

10

20

30

40

50Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (min)

Zn ( m

g/m

l)

[그림 3-23] 산화아연 나노물질 정맥주사 후 혈중 아연 농도의 경시변화

- 63 -

[표 3-3] 산화아연 나노물질 경구투여 및 정맥주사 후 독성동태지표

o 본 연구의 대조군 조직 중 아연농도가 정상범위에 속하는지 유무를 알아보기 위하여

여러 연구들의 대조군 조직 농도 평균을 내어 비교한 결과 타 연구의 대조군 조직 중

아연 농도와 본 연구 대조군 조직 중 아연농도가 비슷한 수치임을 확인할 수 있었다.

o 고용량군과 저용량군의 혈청 은나노 농도를 바탕으로 각 그룹별로 AUC(last), Cmax,

Tmax값을 산출하였다.

o [표 3-3]에서 보듯이 경구투여 고용량군의 AUC(last)는 24.39±3.03 μg·day/ml 었으며

정맥주사 고용량군의 AUC(last)는 33.74±2.52 μg·day/ml 이었다. 대조군의 AUC(last)

(24 μg·day/ml)을 각각의 AUC(last)에서 뺀 후 경구투여 고용량군의 AUC(last)를

정맥주사 고용량군의 AUC(last)로 나누어 구한 생체이용률 (Bioavailability)은 약

4%였다. 따라서 산화아연 나노물질은 경구투여시 흡수가 거의 일어나지 않음을 알

수 있었다.

o 경구투여 고용량군의 Cmax는 8.64±1.25 μg/ml 였으며 정맥투여 고용량군의 Cmax는

38.73±7.48 μg/ml 였다. 각각의 값에서 대조군의 혈중 아연 농도(6.19 μg/ml)를 뺀 후

경구투여 고용량군의 Cmax를 정맥투여 고용량군의 Cmax로 나누었을 때 약 7.5 %였다.

(2) 조직 분포

o 산화아연나노물질을 고용량(30 mg/kg), 저용량(3 mg/kg)으로 경구투여 및

정맥주사하고 투여 1일, 7일 후에 치사시켜 간, 신장, 폐, 비장, 흉선, 고환 및 뇌조직을

취하여 산가수 분해 후 ICP-AES를 통하여 아연 농도 분석을 실시하였다.

- 64 -

o 그 결과 [표 3-4]에서 보는 바와 같이 경구투여의 경우, 저용량군의 7일차 비장에서

통계적으로 유의하게(p<0.05) 아연 농도가 증가하였고 다른 장기에서는 아연이

축적되지 않았으며 대조군의 농도와 비슷하였다.

o 정맥주사의 경우, 간, 신장, 비장, 폐에서 아연이 축적됨을 확인할 수 있었다. 간은

저용량 및 고용량 1일차에서 아연의 농도가 각각 37.68±4.01 μg/g, 88.22±4.86으로

대조군과 비교하여 통계적으로 유의하게 높았으며(p<0.05, p<0.001), 신장과 비장은

고용량 1일차에서 각각 34.63±2.89 μg/g, 30.51±3.56 μg/g (p<0.001, p<0.001)로

대조군과 비교하여 유의하게 아연 함량이 높았다.

o 폐의 경우 정맥주사 고용량군의 1일차 조직에서 아연함량이 391.23±84.99 μg/g로 아연

함량이 특이적으로 높았다. 이는 Back 등이 발표한 연구 결과와 유사함을

보였다[그림 4-32].

[표 3-4] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 각 장기별 분포현황

- 65 -

[그림 3-24] 산화아연 나노물질의 간조직 분포 현황

(*, *** 은 각각 p<0.05, p<0.001로 통계학적으로 유의함을 나타냄)

- 66 -

[그림 3-25] 산화아연 나노물질의 신장분포 현황

(*** 은 p<0.001로 통계학적으로 유의함을 나타냄)

- 67 -

[그림 3-26] 산화아연 나노물질의 비장 분포 현황

(*, *** 은 각각 p<0.05, p<0.001로 통계학적으로 유의함을 나타냄)

- 68 -

[그림 3-27] 산화아연 나노물질의 가슴샘 분포 현황

- 69 -

[그림 3-28] 산화아연 나노물질의 고환 분포 현황

- 70 -

[그림 3-29] 산화아연 나노물질의 뇌 조직 분포 현황

- 71 -

[그림 3-30] 산화아연 나노물질의 폐 조직 분포 현황

(*** 은 p<0.001로 통계학적으로 유의함을 나타냄)

- 72 -

o 위 결과에서 알 수 있듯이 산화아연나노물질을 처리하지 않은 대조군의 시료에서도

아연이 검출되고 있다. 원래 아연은 생체 내 대사효소의 조효소 등으로 작용하는 등

미량생리활성물질로서 매우 중요하다.

o 본 연구에서 검출되었던 대조시료의 아연농도와 타 연구에서 보고된 대조시료의 배경

농도를 비교하기 위해 조사한 바 본 연구에서 검출되었던 대조군 시료에서의 아연농

도는 타 연구에서 검출된 수준과 유사함을 알 수 있었다.

[그림 3-31] 정상 시험동물군(랫드 등)의 아연 함량

[그림 3-32] 산화아연나노의 폐 축적

(Ref. Pharmacokinetics, tissue distribution, and excretion of zinc oxide nanoparticles.

Back et al., Int J NanoMed, 2012)

- 73 -

(3) 뇨를 통한 산화아연 나노물질의 체 외 배설

o 산화아연 나노물질을 랫드에 경구투여 및 정맥주사 한 후 아연이 뇨 중으로 배설되는

것을 확인하였다. 대조군과 처리군(고용량 30 mg/kg, 저용량 3 mg/kg)의 랫드를

대사케이지에 넣고 매일 채뇨를 하고 뇨 량을 확인하였으며 채취된 뇨에 대해 아연

물질의 정량 분석을 실시하였다[표 3-5].

o 그 결과 경구투여의 경우 뇨를 통한 아연의 배설이 7일 동안 대조군과 유사한

수준이었으며 정맥주사의 경우 뇨를 통한 아연의 배설이 경구투여에 비하여 높았다

[그림 3-33].

o 정맥주사의 경우 1일 차 고용량군의 뇨 중 아연 농도는 4.47±0.70 μg/ml 수준으로

배설되었으며 이틀 후부터는 배설량이 다소 감소되어 7일 차에는 대조군과 유사한

수준으로 아연이 배설됨을 확인할 수 있었다. 정맥주사 1일차 저용량군의 뇨 중 아연

농도는 0.95±0.14 μg/ml 수준으로 배설되었으며 이틀 후부터는 대조군과 유사한

수준으로 아연이 배설되었다.

o 정맥주사를 통한 산화아연 처리군에서 뇨를 통하여 배설되는 아연 농도는 혈중농도의

감소와 함께 뇨중 배설량도 감소하는 것으로 보여 진다.

o [그림 3-34]는 뇨 중 누적 배설량을 그림으로 나타낸 것이다. 보는 바와 같이

경구투여의 경우 뇨 중 배설이 거의 없어 배출량이 약 0 μg으로 유지되고 있으며

정맥주사의 경우 1일차에 다량 배설된 후 점차 배설량이 감소하여 3일차부터는

배설되는 양이 거의 없음을 볼 수 있다.

o 경구투여와 정맥주사 모두 고용량군의 경우 용량이 30 mg/kg 으로 랫드 한 마리에

6,000 μg의 산화아연이 투여되었으므로 아연은 4,820 μg이 투여되었다. 경구투여

고용량군의 뇨 중으로 누적 배설된 아연의 양 0.21±1.06 μg 을 투여된 아연의 양

4820 μg으로 나누면 투여량 중 0%의 아연이 뇨로 배설되며 정맥투여 고용량군의

경우 뇨 중 누적 배설된 아연의 양이 88.94±1.19 μg 로 1.8 % 의 아연이 뇨로

배설됨을 확인할 수 있었다[표 3-6].

- 74 -

[표 3-5] 산화아연 나노물질의 경구투여 및 정맥주사 후 날짜별 뇨를 통한 배설량

- 75 -

Urine p.o

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn ( m

g/m

l)

Urine i.v

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn ( m

g/m

l)

[그림 3-33] 산화아연 나노물질의 뇨를 통한 배설

- 76 -

[표 3-6] 산화아연 나노물질의 뇨를 통한 배설 비율 (%)

Accumulative graph ofzinc excretion via urine

1 2 3 4 5 6 7

0

50

100

P.O 30 mg/kgI.V 30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

)

[그림 3-34] 산화아연 나노물질의 뇨를 통한 총 배설량 (누적량) 그래프

- 77 -

(4) 변을 통한 산화아연 나노물질의 체외 배설

o 산화아연 나노물질을 랫드에 경구투여 및 정맥주사 한 후 아연이 변으로 배설되는

것을 확인하였다. 대조군과 처리군(고용량 30 mg/kg, 저용량 3 mg/kg)의 랫드를

대사케이지에 넣고 매일 채변을 하고 변 무게를 확인하였으며 채취된 변에 대해 아연

물질의 정량 분석을 실시하였다 [표 3-7].

o 경구투여 고용량군의 경우 1일 차에 263.08±57.96 μg/g 의 농도로 배설되었으며 이틀

후부터는 배설량이 점차 감소하여 4일차에는 대조군과 유사한 110.86±17.24 μg/g 의

농도로 배설되었다. 경구투여 저용량의 경우 관찰기간 7일 동안 대조군과 비슷한

수준으로 아연이 배설되었다.

o 산화아연 나노물질을 경구투여 시 대부분 흡수되지 않으며 장관을 통해 변으로 바로

배설되는 것으로 보여진다.

o 정맥투여의 경우 고용량 및 저용량에서 아연의 변으로의 배설이 점점 증가하여 3일

차에 최고 농도로 배설되었으며 그 후 점차 감소하다가 6일차에 다시 증가한 후 다시

감소하는 양상을 보였다. 고용량군의 3일, 6일 차 변으로 배설되는 아연의 농도는

각각 249.20±54.79 μg/g, 186.61±86.66 μg/g 였으며 저용량군의 3일, 6일 차 변으로

배설되는 아연의 농도는 각각 146.33±33.26 μg/g, 165.93±79.55 μg/g 였다.[그림 3-35]

o 정맥주사를 통한 산화아연 처리군에서 변을 통한 배설이 3일, 6일에 증가하는 것은

혈액 및 조직에 분포된 산화아연이 담즙배설을 통해 장관으로 분비되기 때문인

것으로 판단된다.

o [그림 3-36]은 변 중 누적 배설량을 그림으로 나타낸 것이다. 보는 바와 같이

경구투여 고용량의 경우 1일 차에 대부분이 배설되나 정맥주사의 경우 3일 차부터

대변으로의 배설이 증가함을 알 수 있다.

o 경구투여와 정맥주사 모두 고용량군의 경우 용량이 30 mg/kg 으로 랫드 한 마리에

6,000 μg의 산화아연이 투여되었으므로 아연은 4820 μg이 투여되었다. 경구투여

고용량군의 변 중으로 배설된 아연의 누적량 1649.52±171.63 μg 을 투여된 아연의 양

4,820 μg으로 나누면 투여량 중 34.2 %의 아연이 변으로 배설되며 정맥투여

고용량군의 경우 변 중 배설된 아연의 누적량이 2255.92±204.08 μg 46.8 % 의

아연이 변으로 배설됨을 확인할 수 있었다.

- 78 -

[표 3-7] 산화아연 나노물질의 변을 통한 배설

- 79 -

Feces p.o

1 2 3 4 5 6 7

0

100

200

300

400Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

/ml)

Feces i.v

1 2 3 4 5 6 7

0

100

200

300

400Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

/ml)

[그림 3-35] 산화아연 나노물질의 변을 통한 배설

- 80 -

[표 3-8] 산화아연 나노물질의 총 투여량 중 변을 통한 배설 비율 (%)

Accumulative graph ofzinc excretion via feces

1 2 3 4 5 6 7

0

1000

2000

3000

P.O 30 mg/kgI.V 30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

)

[그림 3-36] 산화아연 나노물질의 변을 통한 총 배설량 (누적량) 그래프

- 81 -

(5) 일반증상

o 시험물질의 투여와 관련된 일반증상의 이상이나 사망동물은 관찰되지 않았다.

(6) 체중

o 시험물질의 투여와 관련된 체중변화의 이상은 관찰되지 않았다

[표 3-9] 산화아연나노물질에 의한 랫드의 체중 변화

(7) 뇨량 및 변량

o 뇨량

- 투여 후 1 일과 2 일째에 30 mg/kg 정맥내투여군의 뇨량이 부형제대조군에 비하여

통계학적으로 유의성 있게 높았다(p<0.05, p<0.01). 한편, 3 mg/kg 정맥내투여군에서

는 투여 1 일과 2 일째에 뇨량이 증가하는 경향으로 관찰되었다.

o 변량

- 투여 후 1 일과 2 일째에 30 mg/kg 정맥내투여군의 변량이 부형제대조군에 비하여

통계학적으로 유의성 있게 높았다(p<0.05, p<0.01).

- 82 -

[표 3-10] 산화아연 나노물질에 의한 뇨(urine)량의 변화

[표 3-11] 산화아연 나노물질의 변(stool) 량의 변화

- 83 -

(8) 혈액학적 검사

o 투여 후 1 일째 검사 결과에서는 30 mg/kg 경구 투여군에서 WBC, HGB 및 LYM가

부형제대조군에 비하여 통계학적으로 유의성 있게 높았고(p<0.05). 반면 MONO과

MPV는 유의성 있게 낮았다(p<0.05, p<0.01). 또한 30 mg/kg 정맥내투여군은 HDW,

NEU 및 EOS가 경구투여 부형제대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 높게 관찰되

었다(p<0.05, p<0.01). 반면 LYM, MONO는 통계학적으로 유의하게 낮게 관찰되었다

(p<0.01).

o 투여 후 7 일째 검사 결과에서는 30 mg/kg 정맥내투여군은 RDW, HDW 및 PLT가

경구투여 부형제대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 높게 관찰되었다(p<0.05). 반

면 HGB는 경구투여 부형제대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮게 관찰되었다

(p<0.05).

[표 3-12] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈액학적 검사결과 (1일 째)

적혈구(RBC) 적혈구분포폭(RDW) 호중구(NEU)헤마토크리트치(HCT) 헤모글로빈분포폭(HDW) 림프구(LYM)혈색소량(HGB) 평균혈소판용적(MPV) 단핵구(MONO)평균적혈구용적(MCV) 혈소판수(PLT) 호산구(EOS)평균적혈구헤모글로빈량(MCH) 망상적혈구(RET) 호염기구(BASO)평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC) 백혈구(WBC) 대형비염색성세포(LUC)

- 84 -

[표 3-13] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈액학적 변화결과 (7일 째)

(9) 혈청생화학적 검사

o 투여 후 1 일째 검사 결과에서는 30 mg/kg 정맥내투여군에서 AST, CPK, TBIL, TP,

BUN 및 CRE가 경구투여 부형제대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 높게 관찰되

었고(p<0.05, p<0.01), GLU와 A/G는 경구투여부형제 대조군에 비하여 통계학적으로

유의하게 낮게 관찰되었다(p<0.01).

o 투여 후 7 일째 검사 결과에서는 30 mg/kg 경구투여군의 CRE가 부형제대조군에 비

하여 통계학적으로 유의성 있게 높았다(p<0.05).

- 85 -

[표 3-14] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈청생화학적 변화 결과 (1일 째)

아스파테이트 아미노기전이효소(AST) 총콜레스테롤(TCHO) 크레아티닌(CRE)알라닌 아미노기전이효소(ALT) 중성지방(TG) 무기인(IP)알칼라인 포스파타제(ALP) 총단백(TP) 칼슘(Ca2+)크레아틴인산활성효소(CPK) 알부민(ALB) 나트륨(Na+)총빌리루빈(TBIL) 알부민/글로불린 비(A/G) 칼륨(K+)당(GLU) 혈액요소질소(BUN) 염소(Cl-)

[표 3-15] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 혈청생화학적 변화결과 (7일 째)

- 86 -

(10) 장기 중량

o 투여 후 1 일째 부검동물에서는 30 mg/kg 정맥내투여군에서 신장좌측절대/우측상대,

비장 및 폐장의 절대 및 상대중량이 경구투여 부형제대조군에 비해 통계학적으로 유

의하게 높게 관찰되었다(p<0.05, p<0.01). 반면 30 mg/kg 경구투여군에서는 간장의 상

대중량이 통계학적으로 유의하게 낮았고(p<0.01), 30 mg/kg 정맥내투여군에서는 간장

의 상대중량이 경구투여부형제 대조군에 비하여 통계학적으로 유의하게 낮게 관찰되

었다(p<0.01).

o 투여 후 7 일째 결과에서는 어떠한 유의한 변화도 관찰되지 않았다.

[표 3-16] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 장기 중량 변화 (1일 째)

- 87 -

[표 3-17] 산화아연 나노물질을 투여한 랫드의 장기중량 변화 (7일 째)

- 88 -

(11) 부검 소견

o 모든 시험군에서 육안적 이상소견은 관찰되지 않았다.

(12) 조직병리학적 검사

(가) 조직병리학적 소견

1) 간장

- 부형제대조군에서는 1/4 례에서 국소다발성의 미약한 염증세포의 침윤이 관찰되었다.

- 30 mg/kg 경구투여군 에서도 1/4 례에서 미약한 정도의 국소성의 염증세포침윤이 관

찰되었다.

- 30 mg/kg 정맥내투여군에서는 4/4례에서 간장의 간세포의 핵분열상 (mitotic

figures)의 수가 미약하게 증가하였다.

[표 3-18] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 간세포의 핵분열상 수

[그림 3-37] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 간 조직병리

그림C의 화살표는 간세포에서 관찰 된 핵분열상을 나타낸다. (A: Control, B: 30 mg/kg 경구투여, C: 30

mg/kg 정맥투여)

2) 비장

- 비장은 부형제대조군, 경구투여군 및 정맥내투여군 모두에서 특이할 만한 소견이 관

찰되지 않았다.

- 89 -

3) 신장

- 부형제대조군과 시험물질투여군을 합하여 신장에서 관찰된 소견들로는 호염기성의

세포질을 가진 세뇨관 무리, 호염기성세뇨관과 두꺼워진 바닥막, 미약한 간질의 반응

을 동반한 국소성 신증 (focal nephropathy), 세포질내 유리질 방울의 존재와 세뇨관

의 변성을 동반한 hyaline신증 (hyaline nephropathy,), 사구체내 바닥막의 비후로 나

타나는 국소성 사구체신증, 유리질원주, 일부 세뇨관의 확장과 그 주변부의 결합조직

증식 (tubular dilatation and fibrosis)이 낮은 빈도로 일관성 없이 관찰되었다.

[그림 3-38] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 신장 조직병리

A는 국소성 신증 (경구고용량, focal nephropathy), B는 hyaline 신증 (정맥고용량), C는 사구체신증(정맥고

용량)을 나타낸다.

4) 폐

- 폐에서 시험물질과 관련된 것으로 판단되는 소견으로는 30 mg/kg 정맥내투여군의

4/4례에서 폐의 폐포벽모세혈관내 암색의 침착물과 그를 둘러싸고 관찰된 폐실질의

손상이 관찰되었다.

- 30 mg/kg 경구투여군에서는 폐에서의 이상 소견은 관찰되지 않았다.

[그림 3-39] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 폐 조직병리

그림 F의 동그라미는 폐포벽모세혈관 내 암색의 침착물과 그를 둘러싸고 관찰된 폐실질의 손상을 나타낸

다. (D: Control, E: 30 mg/kg 경구투여, F: 30 mg/kg 정맥투여)

- 90 -

5) 뇌

- 시험물질에 의한 것으로 판단되는 어떤 소견도 관찰되지 않았다.

6) 가슴샘

- 시험물질에 의한 것으로 판단되는 어떤 소견도 관찰되지 않았다.

7) 고환

- 시험물질에 의한 것으로 판단되는 어떤 소견도 관찰되지 않았다.

[표 3-19] 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 조직병리학 결과

- 91 -

(나) 전자현미경소견

o 산화아연나노물질이 각 조직에 침투되어 존재하는지의 여부를 확인하기 위해 전자현

미경 관찰을 수행하였다. 30 mg/kg 으로 투여한 후 1일차와 7일차에 랫드의 간을

TEM으로 관찰한 결과 대조군에서는 발견되지 않은 입자형태의 산화아연나노물질이

확인되었다.

[그림 3-40] 산화아연나노물질을 정맥투여한 후 전자현미경으로 관찰한 랫드의 간 조직

화살표는 산화아연나노물질이 축적되어 있는 것을 보여준다.

- 92 -

(13) 측정분석 정도관리

(가) 정도관리 (QC)

본 연구에서 적용한 ICP-AES 분석에서는 다음과 같은 QC를 적용하였다.

o 초기보정: 최소한 3-5가지 표준물질과 보정용 공시료를 시료와 동일한 질산 매트

릭스를 가지도록 준비 사용하였다.

o 초기보정 공시료 (ICB): 초기보정 공시료는 초기보정 점검용 표준액을 사용한 직후

에 그리고 고농도 표준용액 점검 이전에 분석한다. 초기보정 공시료 분석 결과자료의

적절성 판단기준은 연속보정용 공시료 (CCB) 점검에서 제시하는 기준과 동일하다.

o 고농도 표준용액 점검(HSV) : 초기보정 공시료의 분석직후 그리고 시료의 분석

이전에 분석한다. 측정되는 농도는 실제시료의 95～105%에 들어가는 결과가 나오

도록 검증하였다.

o 연속 보정 점검 (CCV): 연속보정 점검용 표준물질은 보정용 보관표준액을 사용하여

보정곡선의 중간 정도의 농도가 되도록 제조한다. 이 용액은 시료분석 이전에 분석하

고 매 10개의 시료분석 시 1번 그리고 연속보정 공시료 분석의 마지막 이전 시점에 분

석하였다. 측정된 농도는 실제시료의 90～110% 범위 내에 들어가도록 검증하였다.

o 연속 보정 공시료 (CCBs): 연속보정 공시료는 각 연속보정 점검용 표준물질 분석

직후에 분석하였다. 이 공시료는 다음과 같은 것을 평가하는데 이용된다.

- 방법론적 검출한계와 비교

- 기기감응도의 절대값은 방법론적 검출한계보다 작아야 한다.

(나) 연속 보정 공시료 (CCBs) 정도관리 시험분석

o 본 정도관리 시험분석에서는 5회에 걸쳐서 매회10개의 공시료를 정도관리를 위하

여 ICP-AES를 사용하여 분석하였으며 그 결과는 다음과 같다.

- 93 -

[표 3-20] Plasma CAL Reference Standard (Cat # 140-051-301, Lot. #: S110516002)

Measured by ICP-OES(Ultima 2, JY, KBSI)

Bath　 1 2 3 4 5

#1 0.005 0.012 0.014 0.018 0.007

#2 0.008 0.01 0.011 0.018 0.007

#3 0.005 0.007 0.014 0.016 0.005

#4 0.005 0.009 0.014 0.016 0.005

#5 0.005 0.009 0.013 0.017 0.006

#6 0.005 0.009 0.013 0.017 0.006

#7 0.008 0.011 0.01 0.02 0.009

#8 0.002 0.005 0.016 0.014 0.003

#9 0.003 0.006 0.015 0.015 0.004

#10 0.001 0.005 0.016 0.014 0.003

AVE(μg/ml) 0.0047 0.0083 0.0136 0.0165 0.0055

STDEV 0.002263 0.002452 0.001955 0.0019 0.0019

LODa (μg/ml) 0.00679 0.007355 0.005865 0.005701 0.005701

* : ICP-OES(Ultima 2, JY, KBSI)

a The limit of detection (LOD) is defined as 3* standard deviation of the blank (μg/ml).

다. 표준작업수순서 (SOP)

표준작업수순서는 부록에 첨부하였다.

라. 시험자료 및 검체관리

시험자료 및 검체는 GLP시험기관의 SOP 에 따라 보관중이며 국립환경과학원의 요청

시 제공 가능한 형태로 관리중이다.

- 94 -

4. 향후연구 및 정책추진방향 제안

가. 나노물질 독성동태 연구의 방향

o 생체이용율을 고려한 독성평가 연구

- 생체이용율 (Bioavailability)는 독성시험의 용량반응에 영향을 크게 미치는 중요한

인자이다. 본 연구결과 산화아연나노물질을 경구투여할 경우 그 흡수율은 매우 낮

은 것으로 나타났다.

- 경구투여에 의한 산화아연나노물질의 반복투여독성 연구 시에는 실제 투여량에 해

당하는 용량을 정확하게 반영하지 못할 것으로 판단된다. 대부분의 투여량이 위액

과 반응하여 침전되므로 나노입자크기를 유지하지 못하게 되고 따라서 나노입자로

서 체내에 흡수되는 것은 매우 어렵다

- 따라서, 산화아연나노물질의 독성평가는 생체이용율을 높여 독성목표장기에 시험물

질이 도달하게 되었을 때 나타내는 독성을 평가하여야 하는데 이를 위해서는 정맥

투여 방법 등에 의한 노출경로를 모색하여야 한다.

- 산화아연나노물질의 나노입경이 유지되면서 생체이용율을 최대한 높일 수 있는 정

맥투여경로를 이용하여 독성시험을 수행할 때 산화아연나노물질이 본래부터 가지

고 있는 고유한 독성을 평가할 수 있게 된다.

나. 정책추진방향

o 노출경로 별 독성값에 근거한 나노물질의 위해관리 정책 수립이 필요하다.

- 병원성 미생물이 혈액을 통해 직접 인체에 도달할 경우 거의 대부분은 질병발생으

로 이어진다. 그러나 병원성 미생물이 경구적으로 노출되어 위장관에 도달할 경우

대부분의 미생물은 위산의 살균작용에 의해 사멸하며 따라서 질병을 유발할 수 없

다.

- 경구노출의 가능성이 있는 나노제품의 경우 실제 나노물질이 경구노출될 경우 위

산에 의해 응집이 발생할 가능성이 매우 높다. 응집이 발생할 경우 나노입자로서의

생체이용율은 매우 낮게 되며 따라서 나노독성을 발현하기는 어렵다.

- 따라서, 경구 노출되는 나노물질의 위해관리는 흡입, 혈관(정맥 등) 등에 의해 노출

되는 나노물질의 위해관리와는 다른 관점에서 정책수립을 할 수 있다.

- 95 -

5. 나노물질의 인체건강영향연구관련 워크숍개최

[그림 3-41] 나노입자 독성동태연구의 현황 및 위해성평가 워크숍 리플렛

- 96 -

가. 일시 및 장소

o 일시 :　2012년 7월 13일 (금) 14:00 ~ 18:00

o 장소 :　동덕여자대학교 대학원 310호

나. 워크숍 주제 및 프로그램

o 워크숍 주제

- 나노입자 독성동태 연구의 현황 및 위해성평가 연계방안

o 프로그램

- 14:00~14:30 등록

인사말 : 최경희 부장 (국립환경과학원)

- 14:30~15:00 나노입자 독성동태에 관한 최근 연구현황 : 박광식 교수 (동덕여대)

- 15:00~15:30 생체 내 나노물질의 전자현미경 분석 : 권희석 박사 (kbsi)

- 15:30~16:00 휴식

- 16:00~16:30 화학물질 독성동태시험법의 나노물질 적용 : 김윤균 교수 (단국대)

- 16:30~17:00 나노물질 체내노출량과 위해성평가 기법 : 김예신 박사 (리스컴)

- 17:00~17:20 휴식

- 17:20~18:00 토론 (I)

-발표자 : 박광식, 권희석, 김윤균, 김예신

-자문위원

: 김영훈(광운대), 김수현(KTR), 손우찬(울산대), 제정환(서울대)

-담당관 : 환경부, 국립환경과학원 담당관

-기타 : 관련 분야 연구자 등 다수

- 18:00 ~ 토론(II)

[그림 3-42] 워크숍 기념사진

- 97 -

6. OECD 나노물질안전성 국가보고서 갱신

가. 나노물질

o 은나노 및 티타늄나노 물질의 인체영향 시험결과를 중심으로 OECD나노물질안전성

국가보고서 갱신을 수행하였다. 수행건수 및 작업결과는 아래와 같다.

나. OECD 보고서 작성

[그림 3-43] OECD 포유류 은나노 독성 보고서의 예시

다. NAPIRAhub Server 입력 보고서 수

- 98 -

[그림 3-44] NAPIRAhub Server 화면

o Silver nanoparticles(단위 : 입력 보고서 수)

§ Basic toxicokinetics : 2

§ Acute toxicity

§ Oral : 2

§ Inhalation : 1

§ Dermal : 1

§ Irritation/Corrosion

§ Skin irritation/corrosion : 1

§ Eye irritation : 1

§ Sensitization

§ Skin sensitization : 2

§ Repeated dose toxicity

§ Oral : 5

§ Inhalation : 1

- 99 -

§ Genetic toxicity

§ In vitro : 2

§ In vivo : 2

§ Reproduction/Developmental toxicity

§ In vivo : 1

§ Exposure related observations in humans : 2

o Titanium Dioxide (단위 : 입력 보고서 수)

§ Acute toxicity

§ Oral : 1

§ Inhalation : 1

§ Dermal : 1

§ Irritation/Corrosion

§ Skin irritation/corrosion : 1

§ Eye irritation : 1

§ Sensitization

§ Skin sensitization : 1

§ Repeated dose toxicity

§ Oral : 1

§ Genetic toxicity

§ In vitro : 2

§ In vivo : 1

§ Exposure related observations in humans : 1

- 100 -

Ⅳ 결론

1. 결론

가. 독성동태시험

(1) 혈중농도

o 혈중 아연 농도 분석결과 3 mg/kg (저용량), 30 mg/kg (고용량)으로 산화아연 나

노물질을 경구 투여시에 나노물질은 거의 흡수되지 않았으며 정맥주사로 투여할 경

우 혈중에서 빠르게 조직으로 분포되거나 배설되어 2일 안에 혈중농도는 정상수준

으로 회복됨

Blood p.o 7day

0 1 2 3 4 5 6 7

0

10

20

30

40

503 mg/kg30 mg/kgControl

Time (day)

Zn ( m

g/m

l)

[그림 4-1] 산화아연나노물질 경구투여 후 혈중 아연 농도 변화Blood i.v 7day

0 1 2 3 4 5 6 7

0

10

20

30

40

50

Control

3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (m

g/m

l)

[그림 4-2] 산화아연나노물질 정맥투여 후 혈중 아연 농도 변화

- 101 -

(2) 조직분포

o 산화아연나노물질의 조직분포를 조사한 결과 경구투여의 경우, 대부분의 조직에서 산

화아연나노물질이 대조군과 유사한 수준으로 검출되었는데 이는 산화아연나노물질의

경구투여 흡수율이 낮기 때문으로 판단됨

o 정맥주사의 경우 간은 저용량 및 고용량 1일차에서 아연의 농도가 각각 37.68±4.01

μg/g, 88.22±4.86 μg/g으로 대조군에 비해 현저히 상승하였으며 신장과 비장은 고용량

1일차에서 각각 34.68±2.89 μg/g, 30.51±3.56 μg/g으로 대조군에 비해 유의하게 아연이

축적됨이 관찰되었음

o 폐의 경우 정맥주사 고용량군의 1일차 조직에서 아연함량이 391.23±84.99 μg/g 으로

아연 함량이 특이적으로 높아 산화아연은 폐에 특이적으로 높게 축적되는 것으로

사료됨

[표 4-1]. 산화아연 나노물질을 랫드에 경구 및 정맥주사 후 각 장기별 분포현황

(3) 배설

(가) 뇨배설

o 산화아연나노물질을 경구 또는 정맥으로 투여 (30 mg/kg) 후 뇨 중 배설량을 조

사한 결과 경구투여의 경우 뇨를 통한 아연의 배설이 7일 동안 대조군과 유사한 수

준이었으며 정맥주사의 경우 1일 차 고용량군의 뇨 중 아연 농도는 4.47±0.70 μg/ml

- 102 -

수준으로 배설되었으며 이틀 후부터는 배설량이 다소 감소되어 7일 차에는 대조군과

유사한 수준으로 아연이 배설됨을 확인됨

Urine p.o

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (m

g/m

l)

Urine i.v

1 2 3 4 5 6 7

0

2

4

6Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (m

g/m

l)

[그림 4-3] 산화아연 나노물질의 뇨 배설

(나) 대변 배설

o 경구투여 고용량군의 경우 1일 차에 263.08±57.96 μg/g 의 농도로 배설되었으며 이

틀 후부터는 배설량이 점차 감소하여 4일차에는 대조군과 유사한 110.96±17.24 μg/g

의 농도로 배설. 경구투여 저용량의 경우 관찰기간 7일 동안 대조군과 비슷한 수준으

로 아연이 배설

- 103 -

o 이러한 결과로 보아 산화아연 경구투여된 산화아연 나노물질은 거의 대부분 흡수되지

않으며 장관을 통해 바로 변으로 배설되는 것으로 보여짐

o 정맥투여의 경우 고용량 및 저용량에서 아연의 변으로의 배설이 점점 증가하여 3일

차에 최고 농도로 배설되었으며 그 후 점차 감소하다가 6일차에 다시 증가한 후 다시

감소하는 양상을 보임. 고용량군의 3일, 6일차에 변으로 배설되는 아연의 농도는 각각

249.20±54.79 μg/g, 186.61±86.66 μg/g 이었음

o 정맥주사를 통한 산화아연 처리군에서 변을 통한 배설이 3일, 6일에 증가하는 것은

담즙을 통해 장관으로 분비되어 변과 함께 배설되기 때문인 것으로 판단됨

Feces p.o

1 2 3 4 5 6 7

0

100

200

300

400Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

/ml)

Feces i.v

1 2 3 4 5 6 7

0

100

200

300

400Control3 mg/kg30 mg/kg

Time (day)

Zn (mg

/ml)

[그림 4-4] 산화아연 나노물질의 변 배설

- 104 -

나. 일반독성 o 투여용량에서 시험물질과 관련된 일반증상의 이상이나 사망동물은 관찰되지

않았으며 체중변화도 관찰되지 않음

o 혈액학적 지표 및 혈청생화학적 지표에서는 시험물질 투여군 (특히 정맥투여 고용량)에서 일부지표의 통계학적 차이가 관찰됨. 용량반응 등 보다 세부적인 시험이 필요함

o 조직병리학적 검사결과 정맥 고용량 투여군의 간장에서 간세포의 핵분열상의 수가

미약하게 증가되었으며 폐의 폐포벽 모세혈관내 암색의 침착물과 그를 둘러싸고 있는 폐실질의 손상이 관찰되었고 아울러 신장에서는 사구체신증 등이 관찰됨. 상대적으로 경구투여의 경우 병리조직학적 소견은 미약함

o 비장, 뇌, 가슴샘, 고환 등에서는 특이적 소견을 관찰하지 못함

o 전자현미경소견결과 간장에서 산화아연나노물질의 응집체가 확인됨

다. 향후연구 및 정책추진방향 o 생체이용율을 고려한 독성평가 연구를 수행하여야 함 - 생체이용율 (Bioavailability)는 독성시험의 용량반응에 영향을 크게 미치는 중요

한 인자이며 본 연구결과 산화아연나노물질을 경구투여할 경우 그 흡수율은 매우 낮은 것으로 나타남

- 경구투여에 의한 산화아연나노물질의 반복투여독성 연구시에는 실제 투여량에 해당하는 용량을 정확하게 반영하지 못할 것으로 판단됨. 대부분의 투여량이 위액과 반응하여 침전되므로 나노입자크기를 유지하지 못하게 되고 따라서 나노입자로서 체내에 흡수되는 것은 매우 어려움

- 따라서, 산화아연나노물질의 독성평가는 생체이용율을 높여 독성물질의 표적장기에 시험물질이 도달할 경우의 독성을 평가하여야 하며 이를 위해서는 정맥투여 방법 등에 의한 노출경로를 모색하여야 함

- 산화아연나노물질의 나노입경이 유지되면서 생체이용율을 최대한 높일 수 있는

- 105 -

정맥투여경로를 이용하여 독성시험을 수행할 때 산화아연나노물질이 본래부터 가지고 있는 고유한 독성을 평가할 수 있게 되므로 이에 관한 연구를 수행하여야 함

o 노출경로 별 독성값에 근거한 나노물질의 위해관리 정책 수립이 필요 - 병원성 미생물이 혈액을 통해 직접 인체에 도달할 경우 거의 대부분은 질병발생

으로 이어지나 병원성 미생물이 경구적으로 노출되어 위장관에 도달할 경우 대부분의 미생물은 위산의 살균작용에 의해 사멸하며 따라서 질병을 유발하지 못함

- 나노제품으로부터 유리되는 나노물질이 경구를 통해 인체에 노출될 경우 위산에 의해 응집현상이 발생할 가능성이 매우 높음. 응집이 발생할 경우 나노입자로서의 생체이용율은 매우 낮게 되며 따라서 나노독성을 발현하기는 어려움

- 따라서 경구로 노출되는 경우 나노물질이 위산에서 응집되어 체내에 들어가지 않으므로 위해의 정도는 낮아지며 위해관리의 우선순위는 낮게 평가될 수 있음. 아울러 경구로 노출되는 나노물질의 위해관리는 흡입, 혈관(정맥 등) 등에 의해 노출되는 나노물질의 위해관리와는 다른 관점에서 위해관리의 정책수립이 필요할 것으로 판단됨

- 106 -

2. 기대성과 및 활용방안

o 독성시험용 산화아연 나노물질의 물리화학적 성질 및 안정성 규명기법 개발

- 현재까지 국제적 학술지에 발표된 산화아연 나노물질의 독성논문을 조사해보면 아

직까지 거의 대부분의 연구가 시험환경에서의 나노물질에 대한 물리화학적 특성을

제대로 규명하지 않은 상태에서 시험

- 이는 산화아연 나노물질의 나노독성 (nanotoxicity)에 대한 평가가 불완전함을 의미

하며 본 연구에서는 이러한 점을 개선함으로써 나노 위해성평가의 기반 마련

⇒ 본 연구과제에서는 독성동태시험에 필수적인 경구투여, 정맥주사의 독성시험 용매

(vehicle)에서의 안정성 등을 평가하고 그 방법론을 표준화함으로써 향후 독성동태

시험에서의 나노물질 적용성을 확보

⇒ 본 연구의 나노물질 독성시험매체에서의 안정성에 관한 표준화 작업은 향후 OECD

나노시험표준화 작업반 등에 국가자료로 제출

o 물리적 특성과 안정성이 규명된 산화아연 나노물질의 유해성자료 생산

- 독성동태 시험을 통해 얻은 산화아연 나노물질의 유해성자료를 생산하고 생산된

자료에 대한 국제적 검증을 통해 OECD 회원국가 공유함으로써 국가위상 제고

o 국내 나노독성연구기반 확충

- GLP시험기관과의 공동연구사업을 통해 GLP기관에서의 나노독성 수행능력을 향상

시킴으로써 향후 나노제품에 대한 국가 간 유해성/위해성평가 역할분담 수행능력

기반을 마련

o 환경부주관 범부처「나노안전관리종합계획」이행 및 안전관리정책 자료 제공

- 나노안전관리 종합계획의 주무부처인 환경부는 각 부처 사업을 주도적으로 선도할

책임이 있으며 이를 위해서는 유해성자료 생산에 관한 환경부/국립환경과학원의 주

도적인 역할이 중요

- 본 연구과정을 통해 획득한 독성동태기술의 표준화는 타 부처의 나노연구사업에 필

요한 기술요소를 제공할 수 있을 것으로 판단됨

- 107 -

- 아울러 독성동태 결과는 체내노출량 결정, 투여경로에 따른 체내흡수율 정보제공 등

나노안전관리에 필수적인 독성정보를 제공하게 되므로 환경부는 이를 바탕으로 산

화아연나노물질의 안전관리 정책을 제시할 수 있음

⇒ 일반 국민에게 나노물질의 위험성, 안전사용에 관한 지침 등을 제시함으로써 환경

부의 위상제고

- 108 -

V 참고문헌

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Acute toxicity of ferric oxide and zinc oxide nanoparticles in rats., J Nanosci Nanotechnol. 2010 Dec;10(12):8617-24, Wang L. et al.

Chronic toxicity of ZnO nanoparticles, non-nano ZnO and ZnCl2 to Folsomia candida (Collembola) in relation to bioavailability in soil, Environ Pollut. 2011 Oct;159(10):2713-9, Kool P.L. et al.

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Safety evaluation of sunscreen formulations containing titanium dioxide and zinc

- 110 -

oxide nanoparticles in UVB sunburned skin: an in vitro and in vivo study, J Biomed Nanotechnol. 2011 Feb;7(1):98-9, Sharma V. et al.

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- 111 -

- 부 록 -

1. 표준작업수순서(SOP) 2. 국외출장보고서

- 112 -

1. 표준작업수순서(SOP)

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종 및 계통 특정병원체 부재(SPF) 랫드, Hsd:Sprague Dawley™SD™

생산자 및 공급원 코아텍(경기도 평택시 진위면 동천리 406)

선정사유 본 시험에 사용한 랫드는 크기가 작고, 다루기가 쉬우며, 공급체계가 확립되어, 약물동태시험에 널리 사용되고 있어 선택하였다.

성별 수컷

<독성동태시험 표준작업수순서>

I. 개요 1. 목적 「독성동태표준작업수순서」는 화학물질의 흡수, 분포, 배설 및 대사에 관한 독성동태학(Toxicokinetics)적 연구로부터 얻은 정보를 토대로 독성을 평가하고 해석하기 위해 필요한 제반 과정을 상세히 기록해 놓은 문서로서 독성동태시험의 신뢰성 제고를 목적으로 한다.

2. 정의 2.1. 독성동태학 (Toxicokinetics) 물질의 흡수, 분포, 배설 및 대사에 관한 연구 2.2. 흡수 (Absorption) 투여물질이 체내에 들어오는 과정 2.3. 분포 (Distribution) 흡수물질 및 그 대사체가 체내에서 순환하고 분산하는 과정 2.4. 배설 (Excretion) 투여물질 및 그 대사체가 체외로 제거되는 과정 2.5. 대사 (Metabolism) 투여물질이 효소 및 비효소 반응을 통하여 체내에서 구조적으로 변화하는 과정

II. 시험 1. 시험의 준비 1.1. 시험동물 a. 시험동물정보 - 시험에 사용할 동물정보를 확보하고 상세히 기록한다. (예, 독성동태시험에 사용한 시험동물의 정보)

- 114 -

동물 수

입수시 68

투여시 65

주령

입수시 7

투여시 8

투여시 체중범위 평균체중(g)의 ±20 % 이내

잔여동물의 처리 안락사 처리하였다.

b. 검역 및 순화 - 입수 후 5 일간 시험을 실시하는 동물실내에서 순화시키고, 매일 1회 이상 일반

증상을 관찰한다.

c. 식별 - 개체식별은 순화기간에는 적색, 투여 및 관찰기간에는 흑색 매직을 이용한 미부

표시법을 사용하고, 개체별로 다른 색상의 개체식별카드를 부착하며, 사육상자대에는 고유번호를 부착한다. 사육실 입구에는 동물실 사용기록지를 부착한다.

d. 동물실험 윤리규정 - 시험동물사육관리를 담당하는 기관은 해당기관의 동물윤리위원회에 시험계획을

제출하고 승인받아야 한다.

1.2 사육환경 a. 환경조건 및 측정

- 동물은 온도 23±3 ºC, 상대습도 55±15 %, 환기횟수 10-20 회/hr, 조명시간 12 시간(오전 8 시 점등-오후 8 시 소등) 및 조도 150-300 Lux로 유지되는 사육실에서 사육되어야 한다.

- 온도와 상대습도는 매시간 컴퓨터 시스템을 이용하여 측정하고, 환기횟수 및 조도는 정기적으로 측정한다.

- 실험기간 동안 동물실의 온도는 21.5-22.4 ºC, 상대습도는 58.0-60.9 % 범위이어야 하며 매일 기록하고 시험 결과에 영향을 줄만한 이상은 없는지 확인한다.

b. 사료 및 물 오염물질 검사 - 사료는 단백질 등 영양소가 충분한 멸균사료를 구입하여 자유롭게 섭취하도록 한

다. 사료성분 분석 성적서를 검토하여 사료조성 및 오염물질 등에서 시험에 악영향

- 115 -

을 줄만한 요인은 없는지 확인한다. - 물은 자외선 살균기 및 미세여과장치로 소독한 지하수를 폴리카보네이트제 음수

병에 넣고 자유섭취 하도록 한다. 수질검사는 지정된 기관에서 정기적으로 실시하여 먹는물 수질기준에 적합한지 확인한다.

c. 사육상자 및 사육밀도 - 동물은 모든 시험기간 동안 스테인레스제 망 사육상자(W 215 x L 355 x H 200

mm)에서 사육상자 당 3 마리 이하로 수용하며, 채뇨 및 채변 대상 동물은 Metabolic cage에서 사육상자 당 1 마리를 수용하도록 한다.

d. 군분리 - 순화기간 중 건강한 것으로 판정한 동물의 체중을 순위화하고, 각 군의 평균체중이

균일하게 분포하도록 시험군 구성표와 같이 무작위로 분배한다.

1.3 시험종의 선택 a. 동물종 - 하나 또는 그 이상의 동물 종을 시험에 사용할 수 있으며 동일한 시험물질에 대

해 다른 독성 연구에서 사용되거나 사용이 권유되는 시험 종을 선택하는 것이 바람직하다. 설치류를 시험에 사용하는 경우, 개체별 체중이 평균 체중의 ±20%를 초과하지 않도록 한다.

b.수량 및 성별 - 흡수 및 배설 연구를 위해서는 대조군 및 각 처리군에 대해 최소 4마리로 시작한다. - 시험에 사용되는 성별은 정해져 있지 않으나, 성별을 구분해서 시험해야 할 특별한

경우에는 한쪽 성만을 구분해서 노출할 수 있다. - 성별에 따른 반응의 차이가 인정될 때는 암수 모두를 사용하여야 한다. 이때 각

성별로 처리군당 4마리 이상을 사용한다. 비설치류의 경우에는 처리군당 4마리 이하로 할 수 있다.

- 조직내 분포를 연구하는 경우, 대조군 및 처리군에서의 최초 시험개체수는 시험과정에서 관찰하는 시점의 횟수와 각 시점에 관찰하는 동물의 수를 고려하여 결정한다.

- 대사를 연구하는 경우, 개체 수는 실험의 목적에 따라 시험자가 적절하게 결정한다.

- 시험물질을 반복적으로 노출시키거나 여러 시점에서 관찰하는 시험의 경우, 관찰

- 116 -

시점의 횟수 및 관찰을 계획한 동물의 수 등을 고려하여 처리군의 개체수를 결정한다. 그러나 최소한 2마리 이상 사용하도록 한다.

2. 시험방법 2.1. 원리 - 시험물질은 적절한 경로를 통하여 체내에 투여하며, 목적에 따라 처리군에 일회 또

는 반복적으로 투여한다. 물질 투여 후, 체액, 조직 및/또는 배설물에서의 해당 시험물질 및/또는 시험물질의 대사체를 분석한다.

2.2. 시험물질 - 나노물질에 대한 독성동태연구는 나노입자의 안정성을 시험하여야 한다.

a. 경구투여용 나노물질의 안정성 - 산화아연 나노물질을 인공위액에 혼화하여 응집여부를 평가한다. - 인공위액은 대한약전 일반시험법 중 붕해시험법의 제 1액을 사용한다. 제 1액

(위액)은 염화나트륨 2.0 g에 염산 7.0 ml 및 물을 넣어 녹여 1,000 ml로 한 후 pH를 약 1.2로 하여 조제한다.

- 침천 여부를 확인하며 침전이 되지 않는다고 판단될 경우 입경과 표면전하 등 물리화학적 성질을 평가한다.

b. 정맥주사용 나노물질의 안정성 - 나노물질을 적절한 주사용 등장액에 현탁시킨 후 분산성을 확인한다. - 현탁농도는 정맥주사 시 혈중 아연 농도와 유사한 범위 내에서 조정한다. - 혈액에서의 분산성을 확인하기 위해 나노물질울 Fetal Bovine Serum (FBS)에

투여 농도로 희석한 후 분산성을 확인한다. - 분산성은 입경과 표면전하 등 물리화학적 성질을 평가하여 확인한다.

2.3. 투여방법 - 투여는 해당물질을 대상으로 한 다른 독성시험에서와 동일한 투여경로를 선택하고,

또한 다른 시험에서와 동일한 용제를 사용하는 것이 가장 적절하다. 위장관 내 투여 또는 사료에 시험물질을 섞어서 경구 투여하는 방법을 일반적으로 사용한다.

- 위장관 내 투여 또는 사료에 시험물질을 섞어 투여하는 경우에 흡수율 차이를 고려하여 투여한다. 투여되는 시험물질의 양을 정확히 계산하도록 한다.

- 경구투여 외에도 일정 기간 동안 실험동물의 피부에 바르는 피부노출 또는 흡입을

- 117 -

통한 노출을 통해 시험물질을 투여할 수 있다. - 시험물질 투여 직후의 흡수 및 분포 양상을 확인하기 위해서 해당 물질을 정맥으로

주사하는 방법을 사용할 수 있다. - 시험물질 매개체는 시험물질의 영향을 방해하지 않도록 고려하여 선정한다.

a. 경구투여 - 투여 전 하룻밤 절식시켜 위 내용물을 비운 후, 경구투여용 존데를 장착한 주사관

을 이용하여 위내에 직접 투여한다. 투여 후 3-4 시간째에 사료를 다시 급여한다.

b. 정맥투여 - 보정틀을 이용하여 랫드를 고정한 후, 좌측 또는 우측의 미정맥 내에 1 회용 주사

기를 이용하여 약 2 ml/min의 속도로 투여한다. 투여 전에는 70 % 소독용 알코올을 이용하여 투여부위를 소독.

2.4. 용량 - 단회투여를 실시하는 경우, 최소한 두개 이상의 처리군 농도를 두도록 한다. - 이때 독성영향이 나타나지 않는 농도를 저농도로 하고, 독성동태학 매개변수에 변

화를 가져오거나 독성영향이 나타날 수 있는 농도를 고농도로 설정하도록 한다. - 반복투여를 실시하는 경우에는 저농도만을 설정하여 수행할 수 있으나, 필요한 경

우 고농도를 추가로 설정하여 시험한다. * 나노물질의 용량결정 사례 (산화아연나노물질) a. 정맥주사용 - 투여용량을 저용량 3 mg/kg, 고용량 30 mg/kg으로 하고 투여액량을 2 ml/kg 으로

설정하였을 때 - 저용량의 경우 산화아연나노물질 (50 wt %, 비중 1.73 g/ml) 0.013 ml을 취하고

vehicle 14.987 ml로 희석한다. (22.5 mg/15 ml) - 고용량의 경우 산화아연나노물질 (50 wt %, 비중 1.73 g/ml) 0.13 ml을 취하여

vehicle 14.87 ml로 희석한다. (225 mg/15 ml) b. 경구투여용 - 투여용량을 저용량 3 mg/kg, 고용량 30 mg/kg으로 하고 투여액량을 10 ml/kg

으로 설정하였을 때

- 118 -

- 저용량군은 산화아연나노물질 (50 wt %, 비중 1.73 g/ml) 0.017 ml를 취하여 vehicle 99.983 ml로 희석한다.

- 고용량군은 산화아연나노물질 (50 wt %, 비중 1.73 g/ml) 0.069 ml를 취하여 vehicle 39.931 ml로 희석한다. .

2.5. 시험의 실시 2.5.1. 흡수 - 시험물질을 경구 및 정맥으로 각각 투여한 후 일정기간 동안 시험물질의 혈중 아연

농도를 분석하고 정맥투여시의 AUC와 경구투여시의 ACU를 비교하여 흡수율을 산정한다.

- 산화아연나노물질의 경우 아래와 같이 수행 a. 채혈 방법 - 채혈은 경정맥에서 주사기를 이용하여 정해진 시간에 혈액 약 200 μl를 채혈. 채

혈한 혈액은 헤파린 처리된 tube(1000 IU/ml 액 5 μl)에 넣고 혼합 후 분리과정 없이 전혈로 -50 ℃이하로 설정되어 있는 Deep freezer에 보관한다.

- 각 튜브 상당과 측면에 '시험번호-군-동물번호-채혈시각(예:264N, G1, 1-1hr)의 내용이 기재된 초저온보관용 라벨을 부착. 이때 정확한 채혈량을 기록한다.

b. 채혈 시간 - 부형제대조군 : 투여 전 (p.o. - 4 마리, i.v. - 4 마리), 투여 후 7 일차 (8 마

리) 총 16 sample - 시험물질투여군 : 투여 전, 투여 후 5, 10, 30 분, 1, 2, 6, 12, 24 hr, 2, 3, 4, 5,

6, 7 day (15 points), 총 240 sample을 제조한다.

c. 혈중 파라미터 분석 - 혈중 아연 농도 변화에 따른 생체이용률 계산은 식품의약품안정청의 지원을 받아

경희대 생물약제학 교실 이영주 교수팀이 개발한 BA Calc 2006 프로그램을 사용한다.

- 혈중 아연 농도 변화로부터 AUC, Cmax, Tmax, T1/2 등을 산출한다.

2.5.2. 분포 - 시험물질 노출 후, 시간별로 동물을 부검하여 각 장기 및 조직에서의 시험 물질 및

- 119 -

/또는 대사체의 농도와 양을 확인함으로써 정량적 정보를 획득한다.

a. 장기적출 및 장기중량 측정- 적출장기는 간, 신장, 폐, 뇌, 비장, 가슴샘, 고환(7장기/마리)이며, 부형제

대조군과 시험물질 투여군 (저용량 및 고용량)은 충분한 배설을 확인할 수 있는 기간 (예, 1, 7 일)에 각 군당 4 마리씩에 대하여 장기를 적출하고, 모든 적출장기의 중량을 측정한다. 양측성 장기는 각각 측정한다.

- 조직 내 분포측정을 위한 검체는 개체별 해당 장기의 동일부위에서 약 200 mg씩의 시료를 취하여 냉동보관한다.

- 이 때 실제 적출된 습중량을 측정. 또한 투여 후 1 일과 7 일째의 부검 동물 중 정맥내투여 부형제대조군 1 마리, 고용량군 3 마리의 간장 일부를 조직병리 및 전자현미경적 검사를 실시하기 위해 따로 준비된 고정액에 고정한다.

b. 조직시료의 산가수분해 - 샘플링 시료는 분석 전까지는 -80 ℃로 냉동 보관한다. - 시료 중 아연의 분석을 위하여 일정량의 시료(조직 및 대변의 경우 습중량으로

200~300 mg 내외, 뇨 및 혈액의 경우 약 0.2 ml에 해당하는 양)을 취한다. - 시료에 7 ml의 70% 질산과 1 ml의 과산화수소수 용액을 넣고 마이크로웨이브 시

스템을 이용하여 고온고압상태에서 산 가수분해 한다. - 가수분해 후 시료가 용액상태가 되었는지 확인한 후 필요시 희석하여 ICP 분석을

실시한다.

c. ICP 분석 o 표준파장 보정 (Reference mono)

- Monochrometer는 160～800nm에 걸친 파장영역을 분석할 수 있으므로 분석의 정확성을 기하기 위하여 Monochrometer의 파장선별 능력을 검증 하여야 한다.

- 표준 원소는 주로 구리가 이용되며 표준파장 324.754nm를 선택하는 것이 일반적이다. 구리원소는 324.754nm와 327.396nm 사이에서 선명하고 분리도가 매우 양호한 Peak를 나타내므로 324.754nm를 표준파장으로 327.396nm를 확인파장으로 선정한다.

- 120 -

o 분석파장 선정 (Mono scan)- Monochromator의 위치가 정상적이라면 관심원소의 분석에 이용할 특정 파장을

선정하여야 한다. - 관심원소의 분석가능 파장을 임의로 선정하여 표준 용액과 시료의 파형을

비교하고 해당 파장의 최적성을 확인하여야 한다. - 파형을 비교할 때에는 원소의 분석파장을 중심으로 표준물질과 시료가 동일하게

대칭의 Gaussian 파형을 보여야 하며 간섭의 영향이 없는 파장을 최적분석 파장으로 선정한다.

o 분석조건 설정 (Method file)- 시료를 정량분석 하려면 분석파장 등의 여러 가지 분석조건 및 기기의 조건

등을 설정하여 분석과정에 이용되는 분석방법을 작성하여야 한다. - 효율적이고 정밀한 분석을 위해서는 선택된 파장의 차수(Order), 선택파장을

검색하기 위한 검색창의 넓이, 검색소요시간, 반복분석 횟수와 같은 분석조건을 빠짐없이 설정하여야 한다.

- 아울러 분석효율에 영향을 미칠 수 있는 기기 조건으로는 플라스마 관측높이, 분무가스 유입량, 펌프속도, 증폭기 감도, 플라즈마가스 유입량 등이 알려져 있다.

o 시료분석 (Manual run)- 분석조건 및 기기조건 등을 설정하여 특정원소의 분석과정에 이용될 분석방법이

작성되면 표준용액으로 표준정량곡선 및 회귀방정식을 작성하고 시료를 분석 한다.

- 시료분석에 있어서 표준정량곡선의 작성은 시료분석의 정확성과 직결되는 작업이므로 주의를 요한다. 표준 정량곡선을 작성하기 위하여 표준 용액을 준비 할 때는 반드시 시료의 예측농도 범위를 포함하는 것이 바람직하다.

o 시분석성적 작성 (Generate report) - 시료의 분석결과를 정리하여 실험목적에 부합하도록 작성한다. 분석 성적서에는

표준물질의 농도, 표준정량곡선, 시료분석결과, 반복실험간 오차를 포함하는 것이 바람직하다.

d. 시료 중 시험물질 (아연) 함량 계산- 시료 무게 당 분석한 아연 농도를 계산하여 혈액, 뇨, 변, 조직 중 아연 함량을

- 121 -

분석한다.

2.5.3. 배설 - 배설 연구에서는 소변, 대변 및 호기, 경우에 따라 답즙을 채취한다. 이러한 배설

물에서의 시험물질 및/또는 대사체의 양은 노출 후 수차례 측정하도록 한다. 측정 횟수는 시험물질 노출 후 투여된 물질의 약 95%가 배출될 때 까지 또는 투여 후 7일 동안 수차례 측정한다.

a. 채뇨 - 24 시간 동안 수집한 요의 볼륨을 측정한 후 균질화하여 1 ml을 취하여 냉동보관 하

였다. 8 일간 수행하였으며, 일일 총 배설 뇨량을 기록한다. (예, 부형제대조군: 1, 7 일, 시험물질투여군: 1-7 일)

b. 채변 - 24 시간 동안 수집한 변의 무게를 측정한 후 10 배 볼륨의 탈이온수로 균질화하여

1 ml을 취하여 냉동보관. 8 일 간 수행하였으며, 일일 총 배설 변량을 기록한다. (예, 부형제대조군: 1, 7 일, 시험물질투여군: 1-7 일)

2.5.4 독성 a. 채혈 o 동물은 채혈 전에 하룻밤 동안(16-24 시간) 절식(물은 제공). o 부검일에 동물을 Isoflurane으로 흡입마취하고, 마취가 확인되면 개복하여 후대정맥에서

주사기를 이용하여 채혈을 실시. o 검사항목 - 일반혈액검사 : 혈액 약 1 ml, 튜브 : EDTA-2K CBC bottle - 혈액생화학적검사 : 혈액 약 2 ml 이상, 튜브 : Clot activator vacutainer tube

① 혈액학적 검사 o 아래 항목에 대해 혈액검사를 실시.

- 122 -

적혈구(RBC) 적혈구분포폭(RDW) 호중구(NEU)헤마토크리트치(HCT) 헤모글로빈분포폭(HDW) 림프구(LYM)혈색소량(HGB) 평균혈소판용적(MPV) 단핵구(MONO)평균적혈구용적(MCV) 혈소판수(PLT) 호산구(EOS)평균적혈구헤모글로빈량(MCH) 망상적혈구(RET) 호염기구(BASO)평균적혈구헤모글로빈농도(MCHC) 백혈구(WBC) 대형비염색성세포(LUC)

② 혈액생화학적 검사 - 아래 항목에 대해 혈액생화학적 검사를 실시.

아스파테이트 아미노기전이효소(AST) 총콜레스테롤(TCHO) 크레아티닌(CRE)

알라닌 아미노기전이효소(ALT) 중성지방(TG) 무기인(IP)알칼라인 포스파타제(ALP) 총단백(TP) 칼슘(Ca2+)크레아틴인산활성효소(CPK) 알부민(ALB) 나트륨(Na+)총빌리루빈(TBIL) 알부민/글로불린 비(A/G) 칼륨(K+)당(GLU) 혈액요소질소(BUN) 염소(Cl-)

b. 조직병리학적 검사- 투여 후 2 일째에 부형제대조군과 고용량군의 각 군당 4 마리씩에 대하여 적출한

장기를 10 % 중성완충포르말린용액에 고정한 후 조직병리학적 검사를 실시한다 (7 장기ｘ3 slideｘ12마리, 총 252 sample).

- 제작한 slide 중 병변이 확인된 조직과 부형제대조군에 대해서만 사진촬영을 실시한다.

c. 통계 분석 - 통계학적 분석은 상용으로 널리 사용되는 통계 패키지인 SPSS 10.1K를 이용하며

유의수준은 p<0.05로 설정한다.

- 123 -

- 혈중, 혈액학적 및 혈액생화학적 자료, 뇨량, 분변 및 장기중량에 대하여는 자료의 정규성을 가정하고 모수적인 일원분산분석(One-way ANOVA)을 적용한다. 분산의 동질성은 Levene test로 검정한다.

- ANOVA 결과가 유의하며 등분산인 경우 Duncan multiple range test (표본수 같음)로, 이분산인 경우는 Dunnett T3 test로 사후검정을 실시하여 부형제대조군과 유의한 차이를 나타내는 군을 확인한다.

III. 시험결과 및 보고 1. 결과의 처리 및 평가 1.1. 결과의 처리 - 대조군 및 각 처리군에 대해 시간, 농도, 조직, 기관(장기) 등과 관련된 측정치의

평균 및 통계적 변이값을 산출하여 표시한다. - 가능한 경우, 데이터를 표로 작성하고, 필요하면 그래프를 추가한다. 흡수 정도 및

배설량, 배설 속도는 적절한 방법을 통하여 계산한다. 대사연구의 경우, 대사체의 구조를 확인하고 대사 경로를 표시한다.

1.2. 결과의 평가 1.2.1. 흡수 - 시험물질의 흡수에 대한 연구 결과는 급성독성을 평가하거나 반복투여독성 연구

를 위한 시험 계획에 도움을 줄 수 있다. 시험 물질이 흡수되지 않거나 급성독성을 나타내지 않는다면(예, 폴리머 종류), 더 이상 반복투여 연구가 필요하지 않음을 제안할 수 있다.

1.2.2. 분포 - 조직 및 기관(장기)에 대한 시험물질의 분포양상을 확인함으로써 반복투여독성

에 대한 연구 및 평가에 도움을 제공할 수 있다. - 임신동물에 대한 분포조사를 통해 기관형성기의 임신모체에 노출된 시험물질이

태반을 어느 시점에서 어느 정도 통과하는지 측정할 수 있다. - 또한 분포 연구의 시험데이터를 통하여 시험물질이 신체의 어느 조직 또는 기관

(장기)에 축적되는지를 확인할 수 있다.

- 124 -

1.2.3. 배설 - 시험물질의 배설 양상을 확인함으로써 반복투여 연구 및 평가에 도움을 제공할

수 있다. 배설량 및 배설 속도를 평가함으로써 시험물질 및/또는 대사체가 체내에 잔류하는지 여부를 조사할 수 있다. 시험물질 및/또는 대사체의 잔류 여부는 독성반응의 변화와 관련을 보일 수 있다.

2. 시험결과의 보고 수행된 독성동태 시험의 종류에 따라 결과보고서는 다음과 같은 정보를 포함하도록 한다.

2.1. 시험에 사용된 동물의 종과 계통 및 개체수 2.2. 방사능 동위원소로 표지한 경우 표지된 시험물질 특성 / 또는 대조물질의 특성 2.3. 용량 및 투여 간격 2.4. 투여 경로 및 사용된 용제 2.5. 사용된 사료 2.6. 생물학적 시료(호흡으로 배출된 공기 포함)에서 시험물질 및/또는 대사체 확인 방

법 2.7. 실험동물의 성별, 용량 투여 계획, 시간, 조직, 기관(장기)에 대한 측정치를 포함한

도표 2.8. 시간별 흡수속도 및 배설 속도 2.9. 생물학적 시료에서의 대사체 확인 방법 2.10. 대사와 관련된 생화학적 분석 방법 2.11. 제안된 대사 경로 2.12. 다음의 정보 또는 과정을 토대로 시험결과에 대한 해석과 고찰을 실시한다. (1) 시험물질의 흡수에 관한 정보를 토대로 경구, 피부, 흡입 및 기타 경로를 통해 실험

동물 체내로 도입되는 물질의 양 및 속도를 평가한다. (2) 시험물질의 분포에 관한 정보를 토대로 실험동물의 각종 조직 및 장기에서 흡수된

시험물질 및/또는 대사체가 순환하고 분포하는 양상을 평가한다. (3) 시험물질의 배설에 관한 정보를 토대로 동물 체내에서 투여된 시험물질 및/또는 대

사체가 제거되는 속도와 양을 평가한다. (4) 시험물질의 대사에 관한 정보를 토대로 투여된 시험물질 및/또는 대사체가 효소 및

비효소 반응을 거쳐 구조적으로 어떻게 변하는가를 평가한다.

- 125 -

2. 국외 출장보고서

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<국외 출장보고서 >

- 목 차 -

Ⅰ 출장 개요

Ⅱ 학회 일정

Ⅲ 나노 연구 동향 조사결과

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I 출장 개요

1. 장소 및 일시

o 장소 :　중국 베이징, Beijing Friendship Hotel

o 일시 : 2012년 9월 3일 ~ 2012년 9월 8일

2. 참석자

o 동덕여자대학교 약학대학 이연진 (연구보조원)

o 동덕여자대학교 약학대학 최종혜 (연구보조원)

3. 참석학회

o The 6th international conference on Nanotoxicology

o International Conference on Nanotoxicology는 2008년 스위스, 2010년 영국에 이어 6

번째로 National Centrer for Nanoscience and Technology of China 가 주최하여 중

국 베이징에서 9월 4일부터 9월 7일까지 4일간 개최되었다. 본 학회에서는 빠르게

발전하고 있는 나노테크놀러지 기술에 맞춰 나노 물질의 안전성 평가에 대한 발표

및 토론이 8가지 주제에 따라 이루어졌다. 주제는 나노물질의 Tox(독성), EHS(환경,

건강, 안전), PK(독성동태), Bio(나노 바이오 제품), BioChem(생화학), ESRA(노출시

나리오와 위해서평가), Analysis(나노 분석), ELSI(윤리, 법, 사회적 이슈)였다. 8가지

의 주제에 따른 발표 및 10명의 나노 독성에 저명한 인사들의 Plenary 발표가 있었

으며 Future Scientists Forum 으로 미래의 과학자들의 연구 결과를 간략히 소개하

는 시간도 있었다. 약 600여명의 전세계 과학자들이 참석하여 최신의 나노 독성 연

구에 대한 열띤 논의를 할 수 있는 자리였다.

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4. 학술 발표(포스터 발표)

o 제목 : Serum kinetics, distribution and excretion of silver in rabbits following 28 days after a single intravenous injection of silver nanoparticles

o 초록 : Serum kinetics, tissue distribution, and excretion of citrate-coated silver nanoparticles (AgNPs) were investigated in rabbits (N=4) up to 28 days after a single intravenous injection. Following a single injection of AgNPs, the AUC(last) was reported to be 3.65±0.68 μg·day/ml in 5 mg/kg-treated group and 0.90±0.16 μg·day/ml in 0.5 mg/kg-treated group, respectively. The accumulation of silver was observed in all the tested organs including liver, kidney, spleen, lung, brain, testis, and thymus at 1 day, 7 day and 28 day of measurement. The liver and spleen seemed to be the major targets because of high accumulation of silver. Excretion via feces and urine was also monitored during the entire experimental period. Unexpectedly, much more excretion of silver occurred via feces than through urine after an intravenous injection, which suggests biliary excretion of AgNPs. General toxicity was analyzed and histopathological changes were also observed.

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Ⅱ 학회 일정

Theme 1 : Nanotoxicology and Human Toxicology

(나노 독성과 인간에 대한 독성)

Theme 2 :　Nanomedicine, Pharmacokinetics and Particokinetics

(나노의약, 약동학과 나노입자동력학)

Theme 3 : Nanobiotechnology, Nano-Bio Interface, and Nanobiomaterials

(나노바이오테크놀러지, 나노바이오인터페이스, 나노바이오물질)

Theme 4 : Nano-Biochemistry and Nano-Analysis

(나노물질의 생화학, 나노물질 분석법)

Theme 5 :　Exposure Scenarios and Risk Assessment of Nanomaterials

(나노물질의 노출 시나리오와 위해성평가)

Theme 6 : Environmental Health and Nanosafety

(환경 건강 및 나노안전성)

Theme 7 : Ethical, Legal and Social Issues of Nanotechnology

(나노기술의 윤리적, 법적, 사회적 이슈)

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Ⅲ 나노 연구 동향 조사결과

1. Plenary Presentation

(1) Emerging toxicity mechanisms and diversity of engineered nanomaterials: a challenge

for safety assessment (나노물질의 독성 메커니즘과 다양성: 안전성 평가의 문제)

o 발표자 :　 Kai Savolainen, Nanosafety Research Center, Finnish Institute of

Occupational Health, Helsinki, Finland

o 연구내용 :

나노물질이 소비재, 산업에 이용됨에 따라 나노물질의 사용이 빠르게 증가하고

있다. 이런 증가에 따라 인간에의 노출 또한 빠르게 증가하고 있다. 하지만

나노물질의 노출에 따른 위험성에 대한 연구는 부족하다. 위험성에 대한 평가

연구는 중요 표적 장기와 적절한 경로를 통한 노출에 따른 엔드포인트,

작업장에서의 노출 농도 등을 파악하는 것이 중요하다. 다양한 나노물질이

사용되고 있기 때문에 빠르고 정확하게 위해성 평가를 할 수 있는 방법을 찾는

것이 무엇보다 중요한 시점이다. 따라서 빠르고 효과적인 오믹스 기술,

생물정보학, 시스템생물학을 이용하여 세포, 분자 수준에서 나노물질의 영향을

평가하기 시작했다. 이를 통하여 나노물질의 독성 메커니즘과 물질의 특성을

효과적으로 알 수 있으며 위험 마커들과 나노물질 metrics 의 상호작용 및

인과관계를 알 수 있다. 또한 빠르고 믿을 수 있는 나노물질 위해성 평가를

통하여 나노물질의 분류 및 표시를 함으로써 건강 위해성 평가에 적절히 이용될

수 있다. 직업적, 소비자제품, 환경학적 건강 연구에서 나노물질에 대한 믿을 수

있는 바이오마커들의 반응이 규명된다면 나노물질의 안전성에 대한 연구는 매우

발전할 것으로 보인다.

(2) Designed synthesis and assembly of uniform-sized nanocrystals for medical

applications (의학적 적용을 위한 균일한 사이즈의 나노크리스탈의 합성)

o 발표자 :　 Taeghwan Hyeon, World Class University Program of Chemical

Convergence for Energy&Environment, and School of Chemical and Biological

Engineering, Seoul National University, Seoul, Korea

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o 연구내용 :

3nm 사이즈의 매우 작은 산화철 나노입자(ESION)을 0.2 mm보다 작은 혈관의

고해상도 이미지화에 사용하였다. 20 nm보다 작은 페리 자성의 산화철

나노입자(FION)는 매우 높은 자성과 보자력을 나타낸다. FION으로 라벨링된

세포는 단일 세포에서도 즉시 보일만큼 강하게 T2 조영제와 같은 효과를

나타냈다. 유전적으로 동일한 이자 랑게르한스섬을 이식한 후 당뇨병이 있는

랫드는 인슐린과다증이 생겼고 이식된 섬은 150일까지 관찰되었다. 이를 통하여

일정한 구멍 사이즈를 지닌 다공성의 실리카 공으로 고정시킨 단순분산된

자철석의 나노입자를 MRI, 형광 이미징, 약물 전달에의 응용으로 사용될 수

있음을 in vivo 및 in vitro시험을 통하여 확인하였으며 MRI조영제와 자성을

통한 약물 전달 vehicle로 사용할 수 있는 속이 빈 자철석의 나노캡슐을

합성하였다.

(3) Using in vivo and in vitro models to relate route of exposure to nanomaterials

systemic effects (나노물질의 관련된 경로로의 노출을 통한 전신적인 효과를 알아보기

위한 in vivo 및 in vitro 모델의 사용)

o 발표자 :　Vicki Stone, School of Life Sciences, Heriot-Watt University, Edinburgh,

UK

o 연구내용 :

나노물질이 다양하게 응용됨에 따라 다양한 노출 경로를 통한 위험성에 대한

연구가 필요하다. 하지만 모든 나노물질에 대해 모든 가능한 경로로 in vivo

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연구를 하는 것은 불가능하므로 적절하고 믿을 수 있는 동물 시험을 대체할

방안이 필요하다.

많은 in vitro 연구들은 단일세포를 배양하고 나노물질을 처리하지만 그러한

세포 실험에 대한 적절성에 대한 평가가 제기되고 있다. in vitro연구가 in vivo를

잘 반영하고 있는지를 평가를 위하여 InLiveTox 라는 프로젝트에서 단순 세포

배양 연구와 랫드에 금과 이산화티타늄 나노입자를 정맥주사 또는

경구투여(50-25 g/마리) 한 비교연구를 실시하였다. 실험을 위하여

Pro-imflammatory 관련 유전자 발현 과 산화적스트레스 마커를 위장관 조직, 간,

대동맥에서 측정하였고 위장관 상피세포(Caco2), 간세포(C3A),

혈관상피세포(Huvec) 세포의 결과와 비교하였다. 그 결과, 정맥주사한 랫드의

간조직과 간세포의 결과는 매우 유사하여 단일세포 배양 모델이 조직 특이적

반응을 예측하는데 적합하다고 판단되었다. 예를들어 이산화티타늄 처리 시

C3A세포와 랫드의 간에서 24시간 노출 뒤 글루타치온 고갈이 발생하였으며 IL8,

IL1R, TNF가 증가하였다. 하지만, 경구투여 결과는 세포시험과 생체 내 시험이

같은 결과를 나타내지 않았다. 이를 통하여 위장관으로 나노물질이 노출될 때

물질의 특성이 변화하거나 나노물질의 작용을 억제시키는 반응을 일으킴을

예측할 수 있었다. ENPRA(EC FP7) 프로젝트에서는 기관지 점적 투여와 세포

모델을 비교하였는데 그 결과 TiO2를 점적주사하였을 때는 GSH 고갈이 마우스

간에서 심하게 발생하였으나 C3A세포에서는 영향을 주지 않음을 알 수 있었다.

(4) Nanomaterial toxicity testing in the 21st century: use of high throughput approaches

to understand oxide nanoparticle toxicity (21세기의 나노물질 독성 시험 : 산화 나노

입자 독성 평가를 위한 고속 대량 연구법)

o 발표자 :　Andre E. Nel, Professor of Medicine and Chief of NanoMedicine, UCLA

School of Medicine Director, Center for Environmental Implications of

Nanotechnology; Director, UCLA Center for Nanobiology and Predictive toxicology

o 연구내용 :

나노기술의 성장과 발전에 따라 안전성 평가법을 개발하기 위하여 고속 대량 스

크리닝법(HTS) 과 예측가능한 독성학적 패러다임이 UC center for the

Environmental Implications of Nanotechnology(CEIN)과 UCLA Center for

NanoBiology and Predictive Toxicology에서 개발되고 있다. 이 플랫폼은 잠재적

으로 위험가능성이 있는 나노물질의 특성을 nano/bio interface로 평가하여

- 133 -

in vivo에서의 부작용을 예측가능하도록 한다. ulti-parametric HTS 분석으로

24개의 서로 다른 특성을 가진 산화 나노물질의 폐에 대한 급성 면역반응을

산화적 스트레스를 예측할 수 있다.

2. Theme 1: Nanotoxicology and Human Toxicology

(1) Nanosilver and ionic silver: applications and interactions with bacterial and human

cells (은나노와 은이온: 박테리아와 인간세포에의 적용 및 상호작용)

o 발표자 :　Annette Kraegeloh, Nano Cell Interactions Group, INM-Leibniz-Institute

for New Materials, Campus D22, 66123 Saarbrucken, Germany

o 연구내용 :

은나노는 항균작용 및 광학, 전자 기술분야에서 다양하게 사용되고 있다. 본

연구에서는 은나노와 은이온의 세균 및 인간 세포에서의 영향을 조사하였다.

간단한 분석을 통해 은이온이 박테리아의 단백질 합성에 영향을 줌을

확인하였으며 은이온에 선택적인 전극을 이용하여 은이온과 진핵세포간의

상호작용이 은이온의 환원작용 때문이라는 것을 밝혔다. 그리고 세포 배양액의

단백질 농도가 인간세포의 은이온에 대한 민감도 저하를 가져옴을 알았으며

세포와 은의 결합은 강하지 않아 쉽게 제거되었다.

- 134 -

(2) Comparative proteomic analysis of lung toxicity in rats induced by three types of

nanomaterials (세 가지 나노물질에 의해 유발된 폐 독성의 프로테오믹스 분석 비교 연구)

o 발표자 :　Zhunge Xi, Institute of Hygiene and Environmental Medicine, Academy

of Military Medical Sciences, China

o 연구내용 :

나노물질이 대량생산되고 널리 응용됨에 따라 인간에 노출되는 양도 증가하고

있다. 나노물질에 대한 생물학적인 영향이 평가되고 있지만 근본적인 in vivo에서

의 메커니즘에 대한 영구는 아직 미비하다. 따라서 본 연구에서는 프로테오믹스

를 사용하여 나노물질을 처리한 랫드에서 폐 독성을 나타내는 단백질 마커를 찾

았다. 시험에 사용한 나노물질은 Nano-ferroso-ferric oxide(Nano-Fe3O4),

nano-silicon dioxide(Nano-SiO2), 카본나노뉴브였으며 콘 오익에 희석되어 TEM

- 135 -

으로 특성을 분석하였다. 투여는 랫드에 세가지 나노물질을 2일에 한번씩 5주간

기관지 점적하였으며 그들의 프로테오믹스를 비교하였다. 2차원 전기영동(2-DE)

을 실시한 후 MALDI-TOP mass spectrometry를 실시하였다. 프로테오믹스 분

석 결과 17가지의 단백질들에서 대조군에 비해 유의성이 있는 변화가 나타났다.

9가지 단백질은 증가되었으며 8가지는 감소되었다. 결론적으로 기관지 점적을 통

해 세가지 물질 모두 산화적 스트레스 또는 염증반응을 통하여 폐 손상을 가져올

수 있음을 알 수 있었다.

(3) ROS and NO induced by silvernanoparticles activate mast cells (은나노입자에 의해 유

도된 ROS와 NO는 비만세포를 활성화 시킨다.)

o 발표자 :　Seungjae Kim, Department of Microbiology, Institute for Immunology and

Immunological Diseases, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea

o 연구내용 :

비만세포와 그 생성물들은 비정상적이게 만성적으로 활성화되어있어 해로운

면역반응을 일으켜 조직에 손상을 주는 천식, 알러지, 아나필락시스와 같은 병과

연관되어있다. 본 연구에서는 은나노입자의 비만세포의 과립 방출에 대한 영향에

대해 알아보았다. 그 결과 은나노는 RBL2H3 비만세포에서 과립 방출을

유도하였다. 이는 칼슘 유입과 관련이 있다고 알려져 있다. 또한 ROS 와 NO 가

이 현상에 영향을 줌을 실험을 통해 알 수 있었다. 그리고 은나노에 의한

비만세포 과립 방출은 은나노 입자가 작을수록 높게 나타났다. 20, 100nm보다

5nm에서 효과가 크게 나타났다. 결론적으로 본 연구는 나노물질의 비만세포의

과립 방출에 영향을 줌을 알 수 있었으며 알러지반응에 대한 연구가 in vivo에서

이루어 져야 할 것이다.

- 136 -

3. Theme 2: Nanomedicine, Pharmacokinetics and Particokinetics

(1) Biodistribution, biopersistence and toxicity of systemically-introduced nanoceria in the

rat (나노세리아의 생체 내 분포, 생체 내 지속, 전신적 독성)

o 발표자 :　Rober A. Yokel, Pharmaceutical Science, US. EPA, REsearch Triangle

Park, NC

o 연구내용 :

세리아 나노물질은 산화환원반응을 하며 불용성이다. 디젤연료의 첨가제, 기계의

연마제등 여러 분야에 사용되고 있다. 여러 연구에서 세리아는 산화적 스트레스를

통해 세포 성장률을 낮추는 것으로 알려져 있다. 대부분 in vitro에서

연구되었기에 생체내 분포 및 배설에 관한 연구는 부족하다. 따라서 본 연구의

목적은 생체 내 분포 및 배설에 영향을 주는 나노세리아의 물리화학적 특성을

규명한 후 혈액 내로 들어가서 어떤 영향을 나태내는지 알아보는데 있다. 실험을

위하여 구연산으로 코팅된 5, 15, 30, 55 nm의 큐빅, 막대모양의 나노 세리아를

합성하였으며 랫드에 정맥주사한 후 1시간 및 90일 이후에 치사시켰다. 변, 뇨,

혈액, 뇌, 말단 조직등에서 세리움을 정량하였으며 산화적스트레스마커, 현미경을

통한 조직 관찰 등을 실시하였다. 그 결과, 30nm 세리아의 1% 미만이 변 또는

뇨로 2주 안에 배설되었는데 그 중 98%가 변으로 배설되었다. 5nm 세리아는 큰

입자보다 더 느리게 배설되었다. 대부분의 나노세리아는 단핵 포식세포에

- 137 -

축적되었으며 30nm 나노세리아의 경우 90일 이상 체내 머무르는 등 체 내에서

제거되지 않고 오래 머무르고 있었다. 아주 극소량의 나노세리아가 뇌에서

검출되었다. 하지만 이는 뇌 실질조직에서 검출된 것이 아니었다. 결론적으로

5nm만큼 작은 나노세리아는 뇌에 침투될 수 없었으며 불용성의 나노물질은

체내에서 느리게 배출됨으로써 독성을 일으킬 수 있음을 알 수 있었다.

(2) Cellular DNA damage response to zinc oxide nanoparticles hinges on the tumor

suppressor p53 pathway (산화아연 나노물질의 세포 DNA 손상은 발암 억제 p53

pathway를 방해한다)

o 발표자 :　 David Leong, Department of Chemical and Biomolecular Engineering,

National University Singapore, Singapore

o 연구내용 :

본 연구에서는 산화아연 나노물질이 발암 억제 경로와 어떤 상호작용을

일으키는지를 p53을 중심으로 알아보았다. p53은 발암을 억제시키는 중요한

역할을 수행한다. 대부분의 암은 p53 신호전달에 결함이 있다. 본 연구에서 BJ

세포(피부 fibroblasts) 에 산화아연 나노물질을 처리할 때 p53 경로가 활성화되어

세포 수가 감소함을 확인하였다. 산화아연 처리 시 세포자살과 같은 반응이

일어났으며 이는 발암성에 대해 보호효과가 있음을 나타낸다. p53 이 knock

down 된 세포에서 산화아연 처리 시 같은 결과를 볼 수 있었다. 결론적으로

개개의 나노물질의 세포 독성과 발암성은 나노물질의 특성 때문뿐만 아니라

유전적인 부분까지 영향을 미침을 알 수 있었다.

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4. Theme 3: Nanobiotechnology, Nano-Bio Interface, and Nanobiomaterials

(1) Stabilized zinc oxide nanoparticles show higher cytotoxicity than zinc ions at

equivalent concentrations (안정화된 산화아연 나노입자는 같은 농도의 아연 이온보다

높은 독성을 나타낸다.)

o 발표자 :　 Duncan S. Sutherland, iNANO Center, Aarhus University, Aarhus,

Denmark

o 연구내용 :

무기 나노입자는 다양한 분야에 응용되고 있어 인간 건강에 잠재적 위험이 크다.

산화아연 나노입자는 화장품에 많이 이용되고 있으며 아연 이온에 비해 독성이

약하다고 알려져 있다. 하지만 나노입자의 분해와 응집은 나노물질의 독성에 큰

영향을 미친다. 그럼에도 불구하고 많은 연구들이 산화아연 나노물질에 관한

연구들이 안정화되지 않거나 약하게 안정화된 산화아연 나노물질을 사용하고

있다. 본 연구에서는 20, 90 nm 사이즈의 산화아연 나노입자를 BSA 코팅으로

안정화 시킨 후 아연 이온과의 세포 독성비교연구를 실시하였다. 세포독성연구는

인간 혈관 상피세포 A549에서 MTT assay를 통해 알아보았다. 그 결과, 20nm

입자의 경우 아연 이온에 비해 높은 세포독성을 보였으나 90nm 입자의 경우

아연이온에 비해 낮은 세포독성을 보였다. DLS와 AAS를 이용하여 산화아연

나노입자의 안정성을 확인하였으며 나노입자와 세포간의 상호작용을 Flow

Cytometry, SEM, TEM을 통하여 확인하였다. 결론적으로 Trojan Horse

메커니즘으로 세포 내 uptake가 일어나 세포 내 아연 이온이 노출되어 산화아연

독성이 나타남을 알 수 있었다.

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(2) Surface Properties of Gold Nanorods Mediated Cell Responses (금 나노막대의 표면 특

성에 따른 세포 반응)

o 발표자 :　Liming Wang, Institute of High Energy Physics, Chinese Academy of

Sciences, China

o 연구내용 :

서로 다른 표면 특성을 가진 골드 나노막대가 세포 생장률에 미치는 영향에 대해

알아보았다. 그 결과 cetyltrimethylammonium bromide(CTAB)에 코팅된 금나노만이

암세포의 미토콘드리아를 표적으로 하였으며 미토콘드리아 자극성 세포 자살을

일으켰다. 반면 정상세포나 줄기세포에는 라이소좀에 저장되거나 세포 밖으로

배출됨으로 인해 미미한 영향을 끼쳤다. 이러한 결과를 바탕으로 서로 다른 세포

반응은 세포 종류 및 표면 특성에 영향을 받음을 알 수 있었다.

5. Theme 4: Nano-Biochemistry and Nano-Analysis

(1) Nanostructured coatings for vascular stent (나노구조의 혈관 스텐트 코팅제)

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o 발표자 :　 Lina Marcela Hoyos Palacio, Grupo de Investigacion Sobre Neubos

Materiales, USA

o 연구내용 :

모양을 기억하는 polyurethane films 나노구조를 electrospinning으로 만들었으며 DSC,

SEM, HRTEM, DMA를 실시하였다.

6. Theme 5: Exposure Scenarios and Risk Assessment of Nanomaterials

(1) Nanosafety and risk assessment: controversial results of toxicological studies (나노 안

전성과 위해성 평가: 논란이 있는 독성 연구에서의 결과들)

o 발표자 :　Harald F. Krug, Empa Swiss Federal Laboratories for Materials Science

and Technology, Department Material metts Life, Lerchenfeldstr.5, Switzerland

o 연구내용 :

나노 안전성과 위해성평가에 많은 프로그램, 국제 학회, 규제 활동이

세계적으로 진행되고 있다. 이에 따라 2004년에 나노독성에 관한 연구가 150

건이었던데 반해 2011년에는 1800 건으로 매우 급상승하였다. 많은 연구에서

나노물질의 독성을 얘기하고 있지만 실험적 set-up에 중요한 결함 떄문에 그

결과는 논의 중이다. 나노입자 서스펜션의 용제, 나노입자의 밀도를 고려하지

않음에 있다. 나노독성연구에서는 특히 이러한 중요 문제점을 고려하여 연구를

실시하여야 한다. 그럼에도 불구하고 시험 표준화 및 방법은 매우 빠르게

성립되었다. 따라서 나노물질에 대한 적절한 시험법이 재정립되어야 할 것이다.

7. Theme 6: Environmental Health and Nanosafety

(1) Nanotoxicology and OECD's working party on manufactured nanomaterials (나노독성

과 OECD 작업반)

o 발표자 :　Asako Aoyagi, OECD Environment, Health and Safety Division

o 연구내용 :

제조 나노물질에 대한 OECD 작업반 (WPMN)은 제조 나노물질의 인간 건강과 환경

- 141 -

안전성에 관한 국제 협력체로 2006년에 설립되었다. WPMN의 가장 중요한 영역은

시험 가이드라인을 만드는 것인데 나노물질의 경우 기존 화학물질과 다른 특성으로

인해 새로운 시험 가이드라인(물리 화학적 특성, 생태계에의 영향, 분해와 축적, 건강

영향)이 필요하다. WPMN은 기존 115개의 OECD 시험 가이드라인을 리뷰한 결과

대부분이 기존 화학물질과 동일한 시험법에 따라도 되지만 어느정도 수정이

필요하다고 판단하였다. WPMN은 최근 나노물질의 안전성 시험을 위한 샘플 준비 및

노출량 측정에 관한 지도를 발표하였다(ENV/JM/MONO(2010)25). WPMN에서는

시험 가이드라인 개발을 평가하기 위한 5개의 워크숍을 준비하고 있다.

1)유전독성학과 메커니즘(2012년 12월 4-6일, 한국), 2)환경적거동과 환경독성(2013년

1월29-31일, 베를린), 3) 물리화학적 특성(2013년 3월, 멕시코), 4)나노 유전독성(2013년

6월, 캐나다), 5) 나노물질과 화학물질의 그룹화(미정).

- 142 -

8. Poster Session

(1) Shape Transformation of Lipid and Biological Membranes after Exposure to Ag

Nanoparticles (은나노 노출로 인한 지질과 생화학적 막의 변화)

o 발표자 :　Babara Drašler, University of Ljubljana, Biotechnical Faculty, Department

of Biology, Vecna pot 111, 1000 Ljubljana, Slovenia

o 연구내용 :

은나노는 지질막의 변형과 적혈구 모양 변화를 가져왔다.

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(2) Toxicology of iron oxide nanoparticles: impact of size and surface modifications (산화

철 나노입자의 독성: 입자 크기 및 표면 변화의 영향)

o 발표자 :　P. Hugouneq.S. France

o 연구내용 :

나노입자의 표면전하가 응집에 영향을 주었으며 응집은 나노물질 독성에 영향을

주었다. 따라서 나노물질에 대한 물리 화학적 특성 평가가 나노물질 독성 평가 전

필수적으로 이루어져야 한다.

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(3) Effects of multiwalled carbon nanotubes on blood coagulation (다중벽 탄소나노튜브의

혈액 응고에 미치는 영향)

o 발표자 :　Xuelian Cheng. China

o 연구내용 :

다양한 다중벽 탄소튜브(long-COOH, short-COOH, long-NH2, short-NH2)의

적혈구 모양, 혈액 응고, 혈소판 응집에 미치는 영향에 대한 연구 결과, 다중벽

탄소나노튜브는 적혈구 모양을 변화시켰으며 혈소판 생존능을 변화시켰다. 그리고 그

효과는 사이즈 및 탄소나노튜브의 화학적 특성에 영향을 받았다.