SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA V NITRE

FAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

1125303

CHARAKTERISTIKA KOLIFORMNÝCH BAKTÉRIÍ

VYSKYTUJÚCICH SA V SUROVOM KRAVSKOM MLIEKU

2011 Eva KOŠARIŠŤANOVÁ

SLOVENSKÁ POĽNOHOSPODÁRSKA UNIVERZITA

V NITREFAKULTA BIOTECHNOLÓGIE A POTRAVINÁRSTVA

CHARAKTERISTIKA KOLIFORMNÝCH BAKTÉRIÍ

VYSKYTUJÚCICH SA V SUROVOM KRAVSKOM

MLIEKU

BAKALÁRSKA PRÁCA

Študijný program:

Študijný odbor:

Agropotravinárstvo

4170700 Spracovanie poľnohospodárskych produktov

Školiace pracovisko: Katedra hygieny a bezpečnosti potravín

Školiteľ: Ing. Peter Zajác, PhD.

Nitra 2011 Eva KOŠARIŠŤANOVÁ

Čestné vyhlásenie

Podpísaná Eva Košarišťanová vyhlasujem, že som bakalársku prácu na

tému ,,Charakteristika koliformných baktérií vyskytujúcich sa v surovom kravskom

mlieku“ vypracovala samostatne s použitím uvedenej literatúry.

Som si vedomá zákonných dôsledkov v prípade, ak uvedené údaje nie sú pravdivé.

V Nitre 20. 5. 2011

........................................

podpis

Poďakovanie

Dovoľujem si touto cestou poďakovať vedúcemu bakalárskej práce Ing. Petrovi

Zajácovi, PhD., za cenné rady, odbornú spoluprácu, vedenie a profesionálny prístup pri

spracúvaní mojej bakalárskej práce.

Abstrakt

Predmetom bakalárskej práce bolo vytvorenie literárneho prehľadu o koliformných

baktériách vyskytujúcich sa v surovom kravskom mlieku. V práci sme charakterizovali

jednotlivé rody koliformných baktérií vyskytujúcich sa v  mlieku. Mikrobiálna

kontaminácia je jedným z hlavných problémov v potravinárskom priemysle a má

negatívny vplyv na kvalitu potravín a zdravie konzumenta. Obsah mikroorganizmov

v surovom kravskom mlieku závisí hlavne od viacerých faktorov, predovšetkým

zdravotného stavu dojníc, spôsobu získavania a uchovávania mlieka. V práci sme sa

zamerali na možnú mikrobiálnu kontamináciu mlieka, preventívne a nápravné opatrenia

v prvovýrobe. Popísali sme legislatívne požiadavky na mlieko týkajúce sa koliformných

baktérií.

Kľúčové slová: mlieko, koliformné baktérie

Abstract

The subject of our work was to create an overview of coliforms found in raw cow's

milk. In this paper we describe the different types of pathogenic micro-organisms

occurring in milk. Microbial contamination is one of the main problems in the food

industry and has a negative impact on food quality and health of consumers. The

content of microorganisms in raw milk is mainly dependent on several factors,

particularly health of dairy cattle, the method of acquisition and preservation of milk. In

this work we focused on the possible microbial contamination of milk, preventive and

remedial measures in primary production. We have described the legislative

requirements for milk on pathogenic microorganisms and methods for the determination

of selected species of coliforms. Work conducted has raised the negative impact of

selected species of coliforms in milk quality and overall health of the consumer.

Keywords: milk, coliform bacteria

ObsahObsah................................................................................................................................5

Zoznam ilustrácií.............................................................................................................6

Zoznam skratiek a značiek.............................................................................................8

ÚVOD...............................................................................................................................9

1 Cieľ práce.................................................................................................................10

2 Metodika práce a metódy skúmania......................................................................11

3 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí......................................12

3.1 Legislatívne požiadavky na surové mlieko..........................................................12

3.2 Výskyt koliformných baktérií v surovom kravskom mlieku...............................14

3.2.1 Rod Citrobacter....................................................................................................21

3.2.2 Rod Escherichia coli............................................................................................21

3.2.3 Rod Klebsiella......................................................................................................23

3.2.4 Rod Enterobacer...................................................................................................24

3.3 Preventívne a nápravné opatrenia v prvovýrobe mlieka......................................26

3.4 Stanovenie počtu koliformných baktérií v surovom kravskom mlieku...............31

4 Návrh na využitie poznatkov..................................................................................33

Záver...............................................................................................................................34

Zoznam použitej literatúry...........................................................................................36

Zoznam ilustrácií

Obr. 1 Biochemická identifikácia koliformných baktérií (Robinson et al., 2000)...20Obr. 2 Citrobacter freundii (CDC, 2005)......................................................................21Obr. 3 Escherichia coli (ARS, 2005).............................................................................23Obr. 4 Klebsiella pneumonie (CDC ATLANTA, 2006)...............................................24

Zoznam tabuliek

Tab. 1 Mikroorganizmy spôsobujúce klinickú mastitídu (HERT et al., 2010)......19Tab. 2 Biochemické reakcie na diferenciáciu baktérií rodu Enterobacter (Robin-

son et al., 2010)...............................................................................................25

7

Zoznam skratiek a značiek

% percento

°C stupeň Celzia

ARS Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture

CDC Centrum for Disease Control and Protection, United States, Department of

Health and Human Services

CPM celkový počet mikroorginzmov

ES Európske spoločenstvo

hod. hodina

ml mililiter

PCR Polymerase chain reaction (Polymerázová reťazová reakcia)

RT-qPCR Kvantitatívna polymerázová reťazová reakcia v reálnom čase

ß Beta

ssp. subspecies

STN slovenská technická norma

URL hypertextový odkaz

Z. z. Zbierka zákonov

8

ÚVOD

Koliformné baktérie sú gramnegatívné tyčinky, ktoré netvoria spóry a sú schopné

rastu na kultivačnom médiu obsahujúcom žlčové soli, či iné povrchové aktívne látky s

podobnými vlastnosťami. Majú schopnosť fermentovať laktózu pri teplote 35 °C alebo

37 °C, sú aeróbne alebo fakultatívne anaeróbne.

Koliformné baktérie sú často zastúpené v mikroflóre mlieka. Prítomnosť

koliformných baktérií sa môže použiť na posúdenie úrovne hygieny v prvovýrobe

mlieka. Prítomnosť koliformných baktérií môže indikovať prítomnosť iných

patogénnych mikroorganizmov, ktoré pochádzajú z exkrementov. V mliekarenskom

priemysle sa koliformné baktérie taktiež považujú za indikátor sekundárnej

kontaminácie. Počas pasterizácie sa koliformné baktérie devitalizujú, a z tohto dôvodu

je možné ich použiť aj ako indikátor nesprávne vykonanej pasterizácie. Ich prítomnosť

v zabalenom mlieku môže viesť k zmenám chuti a skráteniu doby spotreby. Tieto

baktérie majú slabú odolnosť voči dezinfekčným látkam.

Z hľadiska hygieny sa za nebezpečnú považuje sekundárna kontaminácia mlieka

mikroorganizmami, ktorá je zapríčinená okolím dojnice. Podľa Európskej legislatívy

musia byť dojace zariadenia a priestory, kde sa mlieko skladuje a kde sa s ním

manipuluje alebo kde sa schladzuje, umiestnené a skonštruované tak, aby obmedzili

riziko kontaminácie mlieka. Vysoký počet mikroorganizmov v mlieku môže byť

následkom nedostatočného tepelného alebo chladiaceho ošetrenia mlieka. Patogénne

mikroorganizmy v mlieku a  mliečnych výrobkoch môžu u konzumenta vyvolať

ochorenia rôzneho pôvodu. Preto je ich výskyt v potravine neprípustný.

V bakalárskej práci uvádzame legislatívne požiadavky na surové mlieko, zaoberáme

sa výskytom koliformných baktérií v surovom kravskom mlieku, bližšie popisujeme

vybrané rody koliformných baktérií ako sú Citrobacter, Escherichia coli, Klebsiella

a Enterobacter. Ďalej sú v práci uvedené preventívne a nápravné opatrenia

v prvovýrobe mlieka, ktoré je nutné vykonávať za účelom minimalizácie sekundárnej

kontaminácie mlieka. V závere práce uvádzame postup mikrobiologického stanovenia

koliformných baktérií podľa platných technických noriem.

9

1 Cieľ práce

Ciele bakalárskej práce sú:

- vytvorenie literárneho prehľadu o výskyte koliformných baktérií v surovom

kravskom mlieku,

- popísanie vybraných rodov koliformných baktérií vyskytujúcich sa v surovom

kravskom mlieku.

- popísať preventívne a nápravné opatrenia v prvovýrobe mlieka.

10

2 Metodika práce a metódy skúmania

Pri štúdiu poznatkov a získavaní informácií o súčasnom stave riešenej problematiky

doma a v zahraničí sa využijú rôzne dostupné odborné zdroje publikované slovenskými

a zahraničnými autormi. Podľa získaných poznatkov a po ich dôkladnom naštudovaní sa

vypracuje literárny prehľad bakalárskej práce. Pri jej vypracovaní sa použijú informácie

z kníh, vedeckých a odborných časopisov, legislatívy, diplomových prác, bakalárskych

prác, noriem a technických dokumentov dostupných v elektronických databázach na

internete, v knižniciach a prípadne iných zdrojoch.

11

3 Súčasný stav riešenej problematiky doma a v zahraničí

3.1 Legislatívne požiadavky na surové mlieko

Mikrobiologické požiadavky na surové mlieko, údaje o cudzorodých látkach a ich

výskyte v surovom mlieku sú objektívnymi indikátormi účinnosti systému na výrobu

bezpečného surového mlieka. Najdôležitejšie legislatívne požiadavky na získavanie

surového mlieka v chovoch na produkciu mlieka – určených na produkciu mlieka do

spracovateľských závodov (všeobecne nad 5 kusov hovädzieho dobytka v chove, ktorý

uvádza mlieko na trh len do mliekarne). Z týchto chovov sa mlieko spracováva v

schválených spracovateľských prevádzkarniach na spracovanie mlieka – v

mliekarniach. Jedná sa najmä o veľké množstvá. Pre takéto chovy platia rôzne

legislatívne požiadavky (URL 1, 2007).

Pod pojmom „Surové mlieko“ rozumieme mlieko produkované sekréciou mliečnej

žľazy zvierat chovaných na farmách, ktoré neprešlo tepelnou úpravou pri teplote viac

ako 40 °C alebo nebolo podrobené inému ošetreniu, ktoré by malo rovnocenný účinok

(Nariadenie ES č. 853/2004 v znení neskorších predpisov).

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1662/2006 Zo 6. novembra

2006, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č.

853/2004, ktorým sa ustanovujú osobitné hygienické predpisy pre potraviny

živočíšneho pôvodu. Definuje požiadavky na výrobu a všeobecné hygienické

požiadavky na produkčné hospodárstva a zariadenia na získavanie surového mlieka.

Podľa tohto nariadenia musí surové mlieko pochádzať od zvierat:

- ktoré nemajú žiadne príznaky infekčných chorôb, ktoré môžu byť prenosné

mliekom na ľudí,

- ktoré sú v dobrom zdravotnom stave, neprejavujú žiadne príznaky chorôb,

ktoré môžu mať za následok kontamináciu mlieka a netrpia žiadnymi

infekciami pohlavného ústrojenstva s výtokom, ani enteritídou s hnačkou a

horúčkou alebo rozpoznateľným zápalom vemena,

- ktoré nemajú žiadne poranenia vemena, ktoré by mohli ovplyvniť mlieko,

- ktorým neboli podané žiadne nepovolené látky alebo lieky a ktoré neboli

nezákonne ošetrené v zmysle smernice 96/23/ES,

12

- u ktorých, ak im boli podané povolené lieky alebo látky, boli dodržané

ochranné lehoty predpísané pre tieto lieky alebo látky.

Najmä, pokiaľ ide o brucelózu, musí surové mlieko pochádzať od:

- kráv alebo byvolíc, ktoré patria do stáda, ktoré je v zmysle smernice

64/432/EHS bez brucelózy alebo úradne bez brucelózy.

Pokiaľ ide o tuberkulózu, musí surové mlieko pochádzať od:

- kráv alebo byvolíc, ktoré patria do stáda, ktoré je v zmysle smernice

64/432/EHS úradne bez tuberkulózy (Nariadenie ES č. 1662/2006).

Základné hygienické požiadavky na osobnú a prevádzkovú hygienu definuje

Nariadenie Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 852/2004 z 29. apríla 2004 o hygiene

potravín.

Podľa Zákona č. 152/1995 o potravinách v znení neskorších predpisov a zákonov

musia výrobcovia potravín dodržiavať viaceré požiadavky, z ktorých veľmi dôležité sú

požiadavky obsiahnuté najmä v § 4 až § 12, v ktorých sa definujú základné povinnosti

pri výrobe potravín, manipuláciu s nimi a ich uvádzaní do obehu (URL 1, 2007).

V zmysle Nariadenia Európskeho parlamentu a Rady (ES) č. 1662/2006 je

potrebné zabezpečiť nasledujúce kritériá:

ak ide o surové kravské mlieko:

- CPM pri 30 C 100 000 v 1 ml,

- počet somatických buniek 400 000 v 1 ml.

V tomto legislatívnom predpise však nie je zadefinovaná požiadavka na počet

koliformných baktérií prítomných v surovom kravskom mlieku. Túto požiadavku

definuje technická norma STN 57 0529: 1999. V zmysle STN 57 0529: 1999 sa na

surové kravské mlieko aplikujú nasledovné mikrobiologické znaky kvality:

počet psychrotrofných mikroorganizmov do 50 000 v 1 ml,

počet termorezistentných mikroorganizmov do 2000 v 1 ml,

počet koliformných baktérií do 1000 v 1 ml,

spórotvorné anaeróbne baktérie v 0,1 ml – skúška negatívna.

Mlieko musí byť čerstvé, z jedného alebo viacerých pôdojov, získané úplným

vydojením vemena dojníc. Pri dennom zvoze nesmie byť mlieko staršie ako 20 hodín

od prvého pôdoja, pri obdennom zvoze staršie ako 44 hodín (STN 57 0529, 1999).

13

Mlieko sa musí ihneď po nadojení uchovávať na čistom mieste skonštruovanom a

vybavenom tak, aby sa zabraňovalo jeho kontaminácii. Musí sa ihneď schladiť na

teplotu najviac 8 °C, ak sa vykonáva každodenný zber alebo na teplotu najviac 6 °C, ak

sa nezberá denne. Počas prepravy sa nesmie prerušiť chladiarenský reťazec a pri

príchode do prevádzkarne určenia nesmie byť teplota mlieka vyššia ako 10 °C.

Prevádzkovatelia potravinárskych podnikov nemusia dodržiavať požiadavky na teplotu

ak sa mlieko spracuje do dvoch hodín od nadojenia alebo ak je vyššia teplota potrebná z

technologických dôvodov, ktoré súvisia s výrobou určitých mliečnych výrobkov a ak to

povolil príslušný orgán. Prevádzkovatelia potravinárskych podnikov, ktorí vyrábajú

mliečne výrobky musia začať postupy na zabezpečenie, aby bezprostredne pred

spracovaním malo surové kravské mlieko používané na výrobu mliečnych výrobkov

celkový počet mikroorganizmov pri teplote 30 °C menej ako 300 000 mikroorganizmov

v 1 ml. Ak mlieko nespĺňa tieto kritériá musia to prevádzkovatelia potravinárskych

podnikov oznámiť príslušnému orgánu a prijať opatrenia na nápravu tohto stavu

(Nariadenie ES č. 1662/2006).

3.2 Výskyt koliformných baktérií v surovom kravskom mlieku

Mlieko je so svojou vyváženou skladbou živín a vysokým obsahom vody veľmi

vhodným prostredím pre rast mikroorganizmov, ktoré svojou metabolickou činnosťou

môžu kvalitu a biologickú hodnotu jeho i výrobkov z neho získaných ovplyvniť

priaznivo alebo nepriaznivo (Takančíková et al., 2005).

Mikroflóra mlieka veľmi závisí od zdravotného stavu a dobytka a od hygieny

počas dojenia (Betina a Nemec, 1977).

Vyšetrením asepticky odobratého mlieka priamo z vemena bolo dokázané, že

mlieko od zdravých dojníc obsahuje malý počet mikroorganizmov, ktoré sú obyčajne

usadené v strukovom kanáliku a predchádzajú do mliečnej cisterny vemena. Prvé streky

mlieka obsahujú najviac mikroorganizmov, posledné streky už asi 10 až 15 %

z počiatočného množstva.

Po nadojení dochádza k podstatnej zmene pôvodných mikroorganizmov surového

mlieka a to v dôsledku kontaminácie rôzneho pôvodu. Hlavným zdrojom kontaminácie

po nadojení sú povrch struku a vemena, ovzdušie, ruky, oblečenie pracovníkov, náradie,

nástroje, dojacie zariadenie, ale i ostatné zdroje napr. voda, hmyz a pod (URL 1, 2007).

14

Na skladbu mikroorganizmov mliek po nadojení má vplyv aj baktericídna aktivita

čerstvo nadojeného mlieka. Baktericídna schopnosť je tým väčšia, čím je nižšia teplota

skladovaného mlieka a čím je nižší počet mikroorganizmov v mlieku (URL 1, 2007).

Na rozmnožovaní mikroorganizmov má podstatný vplyv teplota a druh prítomných

mikroorganizmov (Tančinová et al., 2005).

Görner a Valík (2004) uvádzajú, že v surovom mlieku sa môžu vyskytovať

koliformné baktérie.

Koliformné baktérie zaraďujeme do čeľade Enterobacetriaceae. Táto čeľaď zahŕňa

gram negatívne, nesporulujúce, fakultatívne anaeróbne, oxidázo-negatívne, katalázno-

pozitívne paličkovité baktérie. Delia sa podľa hostiteľa, biochemických vlastností

a odlišnej antigénnej štruktúry na skupiny, rody, druhy a sérovary. Čelaď

Enterobacteriaceae obsahuje obligátne patogénne rody a druhy: Salmonella, Shigella,

Yersinia, Enterocolitica. Rad príslušníkov čelade Enterobacteriace sa nachádza aj

v pôde, vo vode, alebo na rastlinách odkiaľ sa dajú izolovať (Ervinia, Klebsiella,

Serratia, Proteus, Enterobacter, Eserchia, Yersinia). Ako pôvodcovia alimentárnych

toxiko infekcií prichádzajú do úvahy niektoré druhy a sérovary salmonel, šigel, kmene

Yersinia enterocolitica a enteropatogénne Eserchia coli (Grieger a Holec, 1990).

Blackburn (2006) uvádza, že koliformné baktérie sa vo všeobecnosti nevyznačujú

rezistenciou voči teplotám vyšším ako 50 °C a pri pasterizačných teplotách vyšších ako

72 °C by sa mali spoľahlivo devitalivozvať. Baktérie E. coli uhynú pri teplote 56 °C za

4 – 6 min, a pri teplote 60 °C za 2 minúty.

Optimálna hodnota vodnej aktivity pre baktérie čeľade Enterobacteriaceae sa

pohybuje v rozmedzí 0,94 až 0,99. Rozsah hodnôt pH potrebných pre život baktérií tejto

čeľade sa pohybuje od 4 ,4 do 9,0. V niektorých vedeckých prácach boli publikované

výsledky, pri ktorých baktérie E. coli O157:H7 tolerovali aj kyslejšie prostredie s pH

pod 4 Blackburn (2006).

Pod pojmom koliformné baktérie rozumieme latkózo-pozitívne oxidázo-negatívne

baktérie. V použitých živných pôdach sa správajú podobne ako druh Escherichia coli

a jeho biotypy, ďalej Enterobacter aerogenes a Enterobacter cloacae ako aj členovia

rodov Citrobacter a Klebsiella (Grieger a Holec, 1990).

Základnými vlastnosťami koliformných baktérií z hľadiska ich zistenia a stanovenia

na polotuhých médiách je fermentácia laktózy za tvorby kyselín a prechodných

metabolitov a v tekutých médiách tvorba plynov a kyselín. Pre fermentáciu laktózy sú

15

vlastnosti koliformných baktérií ako indikátorových v potravinárskej mikrobiológii

široko využívané. Pre dobrý rast aj v iných druhoch potravín a pre ich prítomnosť na

znečistených plochách predmetov denného užívania majú indikátorovú funkciu v celej

potravinárskej mikrobiológii (Grieger a Holec, 1990).

Blackburn (2006) uvádza, že koliformné baktérie sa vyznačujú schopnosťou

fermentácie D-glukózy. Táto vlastnosť sa využíva pre účely ich izolácie a počítania.

Tieto baktérie sú ďalej charakteristické absenciou cytochróm-oxidázovej aktivity.

Oxidázový test je preto dôležitým nástrojom pri diferenciácii týchto baktérií od baktérií

patriacich do iných čeľadí ako napr. Vibrionaceae a Pasteurellaceae. Baktérie rodov

Enterobacter, Escherichia, Citrobacter a Klebsiella sa vyznačujú schopnosťou

fermentovania laktózy. Tieto baktérie majú za následok mnohé ochorenia z potravín.

Koliformné baktérie považujeme za indikátorové mikroorganizmy, ktorých prítomnosť

v potravinách svedčí o nedodržaní základných hygienických požiadaviek.

Martín et al., (2010) uvádzajú, že koliformné baktérie sú často zastúpené

v mikroflóre mlieka, majú tvar tyčiniek, sú gram negatívne, nesporulujúce a počas

inkubácie pri teplote 35 až 37 °C fermentujú laktózu za vzniku kyselín a plynov.

Prítomnosť koliformných baktérií sa môže použiť na posúdenie úrovne hygieny

potravín. Tieto mikroorganizmy sú bežne zastúpené v truse a výkaloch teplokrvných

zvierat. Prítomnosť koliformných baktérií môže indikovať prítomnosť iných

patogénnych mikroorganizmov, ktoré pochádzajú z exkrementov. V mliekarenskom

priemysle sa koliformné baktérie považujú za indikátor sekundárnej kontaminácie

mlieka. Počas pasterizácie sa koliformné baktérie devitalizujú, a z tohto dôvodu je

možné ich použiť ako indikátor nesprávne vykonanej pasterizácie. Ich prítomnosť

v zabalenom mlieku môže viesť k zmenám chuti a skráteniu doby spotreby.

Pre svoju termolabilnosť sú koliformné baktérie v potravinárstve indikátorom

spoľahlivosti pasterizácie a termizácie. Pre dobrý rast sú indikátorom aj sekundárnej

kontaminácie potravín. Pre svoju slabú odolnosť voči chemickým látkam sú

indikátorom sanitácie technologického náradia a zariadenia (Grieger a Holec, 1990).

Medzi koliformné baktérie sa radia všetky aeróbne alebo fakultatívne anaeróbne,

gram negatívne, nesporolujúce baktérie, fermentujúce laktózu za súčasnej tvorby plynu

(Grieger a Holec, 1990).

Výskyt kolifomrných baktérií v mlieku a mliečnych výrobkoch je považovaný za

indikáciu možnej prítomnosti črevných patogénnych baktérií alebo všeobecne za

16

indikáciu znečistenia fekálneho pôvodu. Súvisí to s tým, že tieto mikroorganizmy sú

súčasťou črevnej mikroflóry ľudí a zvierat. Vzhľadom k pomerne dlhodobému

prežívaniu koliformných mikroorganizmov v prostredí mimo tráviaceho ústrojenstva,

vo vode, v pôde, v rôznych častiach dojacieho stroja a na zariadeniach potravinárskych

závodov teda ich výskyt nemožno vždy považovať za dôkaz fekálneho znečistenia. Pod

pojmom fekálna kontaminácia je zahrnutá každá kontaminácia baktériami, ktoré sú

normálnou a nutnou zložkou črevnej mikroflóry ľudí a zvierat. Kontaminácia mlieka

koliformnými mikroorganizmami ukazuje skôr na nedostatočnú hygienu získavania

a ošetrovania mlieka, na nesprávne technologické spracovanie a teda na nedodržanie

teplotných časových režimov. V mlieku a mliečnych výrobkoch sú zisťované tieto

koliformné baktérie (Grieger a Holec, 1990).

Kuang et al., (2009) uvádzajú, že použitie tradičných kultivačných metód na

identifikáciu mikroorganizmov podieľajúcich sa na zápale mliečnej žľazy dojníc nemusí

viesť k žiadaným výsledkom. Autori uvádzajú, že použitie modifikovanej PCR metódy

je vhodnejšie pre zisťovanie profilu bakteriálnej populácie asociovanej s mastitídou.

Počas štúdie identifikovali mnohé baktérie podieľajúce sa na zápale vemena, pričom

z koliformných baktérií identifikovali Klebsiella pneumoniae, Escherichiu coli a

Shigella flexneri.

Martín et al., (2010) sa vo svojej vedeckej práci zaoberali optimalizáciou RT-qPCR

(real-time quantitative PCR) metódy na detekciu baktérií čeľade Enterobacteriaceae

v mlieku a mliečnych výrobkoch. Autori uvádzajú, že táto metóda je vhodná pre

detekciu laktózu fermentujúcich baktérií z čeľade Enterobacteriaceae v mlieku a

syroch. Pomocou optimalizovanej RT-qPCR metódy boli schopní detegovať vo

vzorkách: Klebsiella pneumoniae ssp. rhinoscleromatis CECT 852, Klebsiella

pneumoniae ssp.  pneumoniae CECT 143, Klebsiella pneumoniae ssp. ozaenae CECT

851, Klebsiella oxytoca CECT 860, Enterobacter cloacae CECT 194, Enterobacter

aerogenes CECT 684, Enterobacter gergoviae CECT 857, Enterobacter

sakazakii CECT 858, Citrobacter freundii CECT 401, Citrobacter amalonaticus CECT

863, Citrobacter koseri  CECT 856, Escherichia coli CECT 423, Escherichia

coli CECT 428, Escherichia coli CECT 515, Escherichia coli CECT 434, Escherichia

coli CECT 4201, Escherichia coli CECT 470, Escherichia coli CECT 405, Shigella

flexneri CECT 585, Shigella sonnei CECT 413, Serratia marcescens CECT 846,

17

Yersinia enterocolitica CECT 4315, Hafnia alvei CECT 158 a mnohé iné baktérie tejto

čeľade.

NAM, et al., (2009) zisťovali prevalenciu a výskyt gram-negatívnych baktérií

v surovom mlieku, ktoré pochádzalo od dojníc s mastitídou. Výskum realizovali počas

šiestich rokov a zistili, že najčastejšie sa vyskytujúcimi patogénnymi baktériami boli

Escherichia coli, Pseudomonas fluorescens, Klebsiella pneumoniae, Enterobacter

cloacae, Acinetobacter lwoffi/junii, Pseudomonas aeruginosa, a Serratia marcescens.

Prítomné baktérie vykazovali slabú citlivosť voči testovaným antibiotikám okrem

amikacínu a gentamicínu. Hoci tieto dve aminoglykozidové antibiotiká sú účinné voči

gram negatívnym baktériám, menej ako polovica z týchto baktérií bola citlivá voči

streptomycínu. Β-laktámové antibiotiká okrem piperacilínu mali najnižšiu citlivosť zo

všetkých testovaných antibiotík. Citlivosť voči chloramfenikolu a trimetoprimu bola

pomerne vysoká u všetkých gram negatívnych baktérií s výnimkou Acinetobaktera spp.

a Pseudomonas spp.. Vysoká rezistencia bola zistená voči tetracyklínu medzi všetkým

gram negatívnym baktériám.

HERT, et al., (2010) zisťovali vo svojej štúdii vplyv klinickej mastitídy na

pravdepodobnosť počatia kráv Holšteinského dobytka. V rámci 6 ročnej štúdie izolovali

niekoľko rodov a druhov baktérií spôsobujúcich klinickú mastitídu, pričom značnú časť

z nich tvorili koliformné baktérie. Mikroorganizmy spôsobujúce klinickú mastitídu sú

uvedené v tabuľke 1.

18

Tab. 1 Mikroorganizmy spôsobujúce klinickú mastitídu (HERT et al., 2010)

Druh / rod Počet izolácií

Gram pozitívne baktérie

Streptococcus spp. 1,911

Staphylococcus aureus 546

Staphylococcus spp. 535

Gram negatívne baktérie

Escherichia coli 2,189

Klebsiella spp. 1,073

Citrobacter spp. 81

Enterobacter spp. 55

Iné

Arcanobacterium pyogenes 193

Mycoplasma spp. 98

Corynebacterium bovis 40

Pseudomonas spp. 4

Kvasinky 220

Robinson et al., (2000), že uvádza baktérie ktoré hydrolyzujú o-nitrofenyl-β-D-

galaktopyranózu sa považujú za koliformné baktérie (fermentujúce laktózu).

Biochemickú identifikáciu koliformných baktérií je možné vykonať pomocou Voges –

Proskauerovho testu, ktorý je znázornený na obr. 1.

19

Test podľa Voges-Proskauera

EnterobacterKlebsiellaSerratia

CitrobacterEscherichia

SerratiaHafnia

KluyveraYersinia

Enterobacter asburiae

+ -

Deoxyribonukleáza (DNáza) pri 25°C

Pohyblivosť+ -Serratia Klebsiella

Enterobacter- +

E. asburiae CitrobacterEscherichia

SerratiaHafnia

KluyveraYersinia (25°C)

Pohyblivosť

- +Klebsiella

Enterobacter dissolvensEnterobacter nimipressuralis

Enterobacter

Ornitín dekarboxyláza

+ -E. dissolvens

E. nimipressuralisKlebsiella

Arginín dihydroláza

+ -E. dissolvens E. nimipressuralis

Obr. 1 Biochemická identifikácia koliformných baktérií (Robinson et al., 2000)

20

3.2.1 Rod Citrobacter

Baktérie tohto rodu sa nachádzajú v oblasti životného prostredia a tiež v zažívacom

systéme. Ich výskyt v potravinách sa spája s alimentárnym ochorením, ktoré sa

prejavuje hnačkou a sekundárnou infekciou u oslabených osôb, infekciami močových

ciest a dojčenskou meningitídou. (Grieger a Holec, 1990).

Potraviny sa môžu sekundárne kontaminovať baktériami druhu Citrobacter spp.

Mnohé rody ako C. freundii, C. amalonaticus, C. diversus alebo C. koseri môžu

spôsobiť hnačkové ochorenie u ľudí. C. freundii produkuje verotoxíny. Príčinou

kontaminácie sú najmä nedostatky v prevádzkovej hygiene (Motarjemi a Adams,

2006).

Obr. 1 Citrobacter freundii (CDC, 2005)

3.2.2 Rod Escherichia coli

Baktérie rodu Escherichia coli sú gramnegatívne aeróbne a fakultatívne anaeróbne

tyčinky, ktoré štiepia laktózu za súčastnej tvorby plynu. Patria do čeľade

Enterobacteriaceae. Patogenita kmeňov EEC sa viaže na produkciu enterotoxínov, ako

aj na prítomnosť antigénov K, ktoré sa posudzujú ako faktor virulencie. Pri nedodržaní

zásad hygieny sa potraviny môžu kontaminovať zvýšeným počtom koliformných

baktérií, vrátane enteropatogénnych E. coli (Grieger a Holec, 1990).

21

Escherichia coli je bežný komenzálny mikroorganizmus hrubého čreva živočíchov.

Fekálnym znečistením sa dostáva do vody, kde môže prežiť dlhé obdobie. V tráviacom

systéme sa niektoré kmene uplatňujú ako patogény rôznymi mechanizmami, podľa

ktorých sa skupiny týchto tzv. enteropatogénnych kmeňov Escherichia coli označujú

ako:

1. Enteropatogénne (EPEC) – vyvolávajú hnačkové ochorenia u novorodencov.

Dochádza k dehydratácii pri vodnatých hnačkách, v krajnom prípade môže

nastať úmrtie. U väčších detí a dospelých ochorenie nevyvolávajú.

2. Enterotoxinogénne (ETEC) – môžu vyvolávať hnačkové ochorenia u detí

i dospelých.

3. Enteroinvazívne (EIEC) – majú podobný mechanizmus patogenity ako shigely,

t.j. prenikajú buniek a v nich sa množia.

4. Enterohemoragické (EHEC) – baktérie produkujú verotoxíny. Na ochorenie sú

náchylné deti (Tančinová et al., 2005).

Nataro a Kaper uvádzajú, že v súčasnosti sa rozlišuje 5 tried patogénnych

Escherichia coli, ktoré spôsobujú hnačkové ochorenia: enterotoxinogénne Escherichia

coli (ETEC), enteroinvazívne Escherichia coli (EIEC), Enterohemoragická Escherichia

coli (EHEC), enteropatogénna Escherichia coli (EPEC) a enteroagregatívna Escherichia

coli (EAEC). Popri infekciách intestinálneho systému je tiež schopná infikovať močové

cesty (UTI - urinary tract infections) a vyvolať neonatálnu meningitídu.

K rizikovým potravinám, v ktorých sa môžu tieto baktérie vyskytovať patrí aj surové

mlieko, sušené mlieko a mliečne výrobky.

Prevenciou je náležitá hygiena a tepelná úprava. Uchovávanie rizikových potravín

pri teplote do 5 °C (Tančinová et al., 2005).

U detí prebieha ochorenie vo forme ťažkej epidemickej dyspepsie. Prejavuje sa

silnými hnačkami a zvracaním s následnou dehydratáciou a acidózou.

U starších detí a dospelých sa ochorenie prejaví horúčkou, hnačkou a bolesťami

brucha, prípadne bolesťami kĺbov a svalov. Inkubačný čas je 1-3 dni, ale môže byť aj

dlhší (Grieger a Holec, 1990).

22

Pasterizáciou a sterilizáciou mlieka sa kmene EEC devitalizujú. Znižovaním hodnoty

pH na 5 a menej sa ich rast a rozmnožovanie obmedzuje až zastavuje. Chladom sa

kmene EEC nezničia, po zmrazení a v priebehu procesov zrenia používaných

v mliekarskej technológii sa čiastočne znižuje ich počet (Grieger a Holec, 1990).

Počas posledných rokov výrazne vzrástol počet infekcií ľudí vyvolaných

enterohemoragickým (EHEC) sérotypom Escherichia coli O157:H7, pričom vznik

týchto infekcií bol spájaný s konzumáciou mäsa a mliečnych produktov,

kontaminovaných týmito baktériami (Tkáčiková et al., 1998).

Escherichia coli O157:H7 vyvoláva hemoragickú kolitídu a hemoragicko –

uremický syndróm (HUS) u ľudí. Zvláštnosťou infekcií vyvolaných Escherichia coli

O157:H7 je to, že k ich vyvolaniu u vnímavých jedincov (detí alebo starých ľudí) stačí

malý počet baktérií (10 a viac zárodkov) (Naas et al., 1998).

Obr. 1 Escherichia coli (ARS, 2005)

3.2.3 Rod Klebsiella

Baktérie rodu Klebsiella patria do podskupiny čeľade Enterobacteriaceae, ktorá

patrí do skupiny fakultatívne anaeróbnych gramnegatívnych tyčiniek. Rod Klebsiella sa

vyskytuje po celom svete a bežne sa izoluje z pôdy, odpadových vôd, chladiacej vody,

ovocia, cukrovej trstiny, obilia, zeleniny ako reďkovka, šalát, mrkva, paradajky,

v potravinách živočíšneho pôvodu ako mlieko a mliečne výrobky. Tieto baktérie môžu

23

kontaminovať potraviny a prispievať tak k ich znehodnoteniu. Tieto baktérie majú

väčšiu rezistenciu voči antibiotikám. Niektoré druhy by mohli byť využité

v priemyselných procesoch kvasenia pre syntézu chemických látok (Blackburn, 2006).

Baktérie rodu Klebsiella sa vyskytujú najmä v exkrementoch živočíchov. Baktérie

Klebsiella spp. boli izolované aj zo surového mlieka, do ktorého sa dostali v dôsledku

zanedbania hygieny pri dojení. Vplyvom kontaminácie mlieka týmito baktériami môže

nastať zvýšená tvorba biogénnych amínov počas výroby zrejúcich syrov (Motarjemi a

Adams, 2006).

Obr. 1 Klebsiella pneumonie (CDC ATLANTA, 2006)

3.2.4 Rod Enterobacer

Baktérie rodu Enterobacer ako Enterobacter aerogenes, Enterobacter cloacae

a Enterobacter agglomerans sa vyskytujú v zažívacom systéme. Do surového mlieka sa

dostávajú sekundárne. Tieto baktérie sa zúčastňujú procesu kazenia potravín

a predstavujú stálu zložku skupiny koliformných baktérií. Vyznačujú sa schopnosťou

premeny sacharidov na plyny ako sú oxid uhličitý a vodík (Görner a Valík, 2004).

Robinson et al., (2000), že uvádza, že na diferenciáciu jednotlivých druhov

baktérií rodu Enterobacter je možné použi biochemické reakcie. Tieto reakcie sú

znázornené v tabuľke 2.

24

Tab. 1 Biochemické reakcie na diferenciáciu baktérií rodu Enterobacter

(Robinson et al., 2010)

Test

aerogenes

cloacae

gergoviae

sakazaki

taylorae

amnigenus 1

amnigenus 2

asburiae

hormaechei

Intermedium

cancerogenus

dissolvens

nimipresuralis

Metylénová červená - - - - - - V + V + - - +

Citrát + + + + + V + + + V + + -

Močovina - V + - - - - V V - - + -

Lyzín dekarboxyláza + - + - - - - - - - - - -

Arginín - + - + + - V V V - + + -

Dihydroláza + + + + + V + + + V + + +

Pohiblivosť + + + + + + + - V V + - -

Fermentácia laktózy + + V + - V V V - + - - -

Fermentácia

sacharózy

+ + + + - + - + + V - + -

Fermentácia

duicitolu

- V - - - - - - V + - - -

Fermentáciaadonitol

u

+ V - - - - - - - - - - -

Fermentácia

sorbitolu

+ + - - - - + + - + - + +

Fermentácia rafinózy + + + + - + - V - + - + -

Žltý pigment - - - + - - - - - - - - -

Vysvetlivky: - a + 90% reaktívnosti. v – variabilná reakcia (11-89%)

YE et al., (2010) uvádzajú, že Enterobacter sakazakii je patogénna baktéria, ktorá

môže spôsobovať závažné ochorenia dojčiat. Táto baktéria sa môže vyskytnúť v detskej

a dojčenskej výžive v dôsledku nesprávne vykonaného sušenia mlieka.

Blackburn (2006) uvádza, že Enterobacter sakazakii je patogénna baktéria, ktorá

môže vyvolať závažné zdravotné problémy u dojčiat. Táto baktéria môže mať za

následok neonatálnu sepsu a meningitídu. Enterobacter sakazakii bol izolovaný

z dojčenskej výživy, ktorá spôsobila závažnú infekciu detí. Do dojčenskej výživy sa táto

25

baktéria dostala v dôsledku neadekvátneho ošetrenia a sekundárnej kontaminácie

z prostredia.

Enterobacter spp. sú koliformné baktérie rodu Enterobacteriaceae. Nie sú

považované vyslovene za fekálne koliformné baktérie. Do exkrementov sa môžu

dostávať aj z pôdy. Enterobacter spp. sú často izolované aj z ovocia a zeleniny. Výskyt

Enterobacter spp. v potravinách je považovaný za nebezpečný a baktéria môže byť

potenciálne patogénna pre vybrané skupiny obyvateľstva. V niektorých vedeckých

štúdiách bol popísaný probiotický účinok baktérií rodu Enterobacter spp.. Tieto

baktérie môžu spôsobiť kazenie potravín  (Blackburn, 2006).

3.3 Preventívne a nápravné opatrenia v prvovýrobe mlieka

Mikrobiologická kvalita mlieka je jedným z hlavných faktorov podieľajúcich sa na

výslednej kvalite nakupovaného surového kravského mlieka. Má význam nielen

z hľadiska zdravotného, ale aj z hľadiska ekonomického, pretože sa podieľa na

výslednom zatriedení mlieka do príslušnej triedy kvality, čo sa následne odráža

v preplácaní mlieka. Mikrobiologická kvalita surového kravského mlieka úzko súvisí

s podmienkami, v ktorých sa mlieko získava a ošetruje (Čapla et al., 2008).

Hlavné faktory, ktoré ovplyvňujú kvalitu mlieka v prvovýrobe sú:

nedostatočná výživa dojníc,

nedostatočná starostlivosť o dojnice,

nízka hygienická úroveň obsluhujúceho personálu,

nesprávna kvalita mliečnej žľazy, neoddájanie prvých strekov mlieka do

zvláštnej nádoby a jeho posudzovanie pred začiatkom dojenia, neošetrenie

mliečnej žľazy po dojení,

nesprávna technika dojenia (dojenie na prázdno, nesprávne zoradenie dojacích

prístrojov),

nevhodný zdroj pitnej vody – kontaminácia,

nerealizuje sa oddelené dojenie chorých zvierat,

problémy v sanitačnom režime (nedodržiava sa koncentrácia čistiacich

a dezinfekčných prostriedkov odporúčaných výrobcami, nestriedajú sa kyslé

a alkalické prostriedky, nerealizuje sa neutralizácia týchto prostriedkov pred

vypúšťaním – zaťaženie životného prostredia),

vážne hygienické nedostatky pri preberaní mlieka do zvozných cisterien pred

26

prepravou – nesprávne prečerpávanie mlieka a ďalšie (Burdová, 2001).

Zdroje kontaminácie mlieka mikroorganizmami na farme môžeme rozdeliť na

primárne (mliečna žľaza) a sekundárne (vonkajšie prostredie – vzduch, koža, povrch

vemena, ruky dojiča, ceckové nástrčky, mliekovodné hadice a potrubie, krmivo,

podstielka atď.) (Semjan, 1994).

Primárna kontaminácia mlieka je kontaminácia mlieka mikroorganizmami pred

opustením vemena (Burdová, 2001).

Mikroorganizmy, ktoré sa nachádzajú v mlieku, prenikajú do mlieka resp. vemena

z vonkajšieho prostredia cez strukový kanálik. Počty týchto mikroorganizmov ako aj ich

zastúpenie závisí od starostlivosti o dojnicu, jej veku, prípravy dojnice, prvotného

ošetrenia mliečnej žľazy ako aj úrovne dojacej techniky. Preto sú opodstatnené trendy

vykonávať prvé streky mlieka pred samotným umytím. Tým sa odstráni najviac

kontaminované mlieko z ceckového kanálika a nevytlačí sa do mlieka v mliečnej

cisterne (Čanigová, 2001).

Silne znečistené vemeno môže zapríčiniť zvýšenie počtu mikroorganizmov až na

100 000 v 1 ml mlieka. Starostlivým umývaním vemena a  jeho následným dôkladným

sušením možno znížiť počty mikroorganizmov na menej ako 5000 v 1 ml mlieka

(Boroš, 1999).

Mlieko získané hygienicky, po oddojení prvých strekov mlieka je mikrobiologicky

veľmi čisté, pretože v zdravej mliečnej žľaze je mlieko sterilné, presnejšie povedané,

vytvára sa sterilne (Grieger a Holec, 1990).

Vyšetrením asepticky odobratého mlieka priamo z vemena bolo dokázané, že

mlieko od zdravých dojníc obsahuje malý počet mikroorganizmov, ktoré sú obyčajne

usadené v strukovom kanáliku a prechádzajú do mliečnej cisterny vemena. Prvé streky

obsahujú najviac mikroorganizmov, posledné streky už asi 10 až 15 % z počiatočného

množstva (Tančinová et al., 2005).

U chorých dojníc sa asociácia mikroorganizmov mení podľa pôvodcu ochorenia.

Porovnaním vzoriek mlieka zdravých dojníc a dojníc v subklinickej mastitíde sa zistilo,

že počet mikroorganizmov v mlieku dojníc nemusí byť väčší, ale prevažnú časť tvoria

choroboplodné baktérie (Vasiľ, 2000).

27

Sekundárna kontaminácia mlieka mikroorganizmami pochádza z bezprostredného

okolia dojnice, t.j. z povrchu jej vemena, z plôch, s ktorými sa nadojené mlieko stýka po

jeho získaní v dojacích strojoch, počas dopravy v príslušných potrubiach, pri jeho

chladení z plôch chladiča, počas jeho udržiavania a plôch mliečnice

poľnohospodárskeho závodu (Görner a Valík, 2004).

Kontaminácia mlieka z maštaľného prostredia je všeobecne omnoho častejšia

a rozsiahlejšia než kontaminácia mliečnou žľazou (Foltys et al., 1996).

V priebehu dojenia sú hlavnými zdrojmi mikroorganizmov v mlieku:

- sekrečné tkanivo a vývodné cesty,

- mliečna žľaza,

- telo dojnice,

- maštaľné prostredie,

- ruky a odev pracovníkov,

- zariadenie na dojenie,

- nádrže a zariadenia na chladenie a uchovávanie mlieka (Grieger a Holec,

1990).

Po nadojení dochádza k podstatnej zmene pôvodných mikroorganizmov surového

mlieka a to v dôsledku kontaminácie rôzneho pôvodu. Hlavným zdrojom kontaminácie

po nadojení sú povrch cecka a vemena, ovzdušie, ruky a oblečenie pracovníkov,

náradie, nástroje, dojacie zariadenie, ale i ostatné zdroje napr. voda, hmyz a pod.

(Tančinová et al., 2005).

Na skladbu mikroorganizmov mlieka po nadojení má vplyv aj baktericídna aktivita

čerstvo nadojeného mlieka, ktorú vyvoláva prítomnosť laktenínu. Baktericídna

schopnosť je tým väčšia, čím je nižšia teplota skladovaného mlieka a čím je nižší počet

mikroorganizmov v mlieku (Tančinová et al., 2005).

Dojace zariadenia a priestory kde sa mlieko skladuje a kde sa s ním manipuluje

alebo, kde sa schladzuje, musia byť umiestnené a skonštruované tak, aby obmedzili

riziko kontaminácie mlieka (Nariadenie Európskeho parlamentu a rady (ES) č.

853/2004, v znení nariadení ES č. 1662/2006 a č. 1020/2008).

K mikrobiálnej kontaminácii mlieka dochádza i z odevu a neumytých rúk dojiča,

avšak táto je menej závažná ako možnosť kontaminácie mlieka patogénnymi

mikroorganizmami (Foltys et al., 1996).

28

Suroviny a potraviny sú kontaminované predovšetkým pracovníkmi, ktorí trpia

katarom horných dýchacích ciest alebo majú na rukách drobné hnisavé poranenia.

Takýto človek, prichádzajúci do styku s potravinami môže spôsobiť ich sekundárnu

kontamináciu, a to buď priamo alebo nepriamo cez nástroje, resp. nádoby používané pri

manipulácii s danými potravinami. Pri akejkoľvek práci s potravinami je nevyhnutné

dodržiavať osobnú hygienu (Tančinová et al., 2005).

Pri každom podozrení na infekčné ochorenie, pri horúčkovitých ochoreniach,

hnisavých a kožných ochoreniach si musí pracovník vyžiadať lekárske vyšetrenie.

Takto chorí pracovníci nesmú dojiť ani ošetrovať mlieko po nadojení (Trúchla et al.,

1998).

Od nadojenia mlieka až po odvoz do mliekarne dochádza ku zvyšovaniu počtu

mikroorganizmov v mlieku nielen kontamináciou, ale aj rozmnožovaním prítomných

mikroorganizmov v mlieku. Na rozmnožovaní mikroorganizmov v mlieku má podstatný

vplyv teplota a druh mikroorganizmov (Tančinová et al., 2005).

Veľmi dôležité je pripraviť dojnicu na dojenie. Pred dojením treba umyť vemeno

teplou vodou 45 – 50 ºC a dôkladne osušiť. Umývajú sa len cecky a spodná časť

vemena. Teda časti, ktoré prichádzajú do styku s ceckovými nástrčkami (Trúchla et al.,

1998).

Pre zmyslové posúdenie mlieka a odstránenie kontaminovaného mlieka sa musia

oddojiť najmenej dva až tri streky z každého cecku do špeciálnej nádoby, nikdy nie na

zem alebo na ruku, aby sa nevytvárali podmienky pre prenos infekcie z dojnice na

dojnicu (Tančin et al., 2001).

Prvé streky mlieka sa musia vydojiť na začiatku prípravy vemena, aby sa počas

umývania kontaminované mlieko v ceckovom kanáliku a cisterne cecku nezmiešalo

s ostatným mliekom. Pri zistených zmenách na mlieku je potrebné urobiť kontrolu

zdravotného stavu vemena a mlieko od podozrivej dojnice vylúčiť z dodávky do

mliekárne (Tančin et al., 2001).

Príprava vemena dojnice na dojenie musí spĺňať dve funkcie:

- hygienickú, 

- fyziologickú.

Oddájanie prvých strekov mlieka, umývanie a utieranie vemena musí zabezpečovať

hygienické predpoklady pre získanie kvalitného mlieka (Tančin et al., 2001).

29

Dojacie zariadenie môže mať priamy alebo nepriamy vplyv na zdravotný stav

vemena. Prejavuje sa to tým, že:

1. umožňuje kontamináciu povrchu kože,

2. vyvoláva zmeny stavu ceckov,

3. umožňuje penetrovať baktériám cez ceckový kanálik,

4. umožňuje prenos baktérií medzi jednotlivými štvrťami,

5. ovplyvňuje stupeň vydojenia vemena (Tančin et al., 2001).

Mlieko sa musí ihneď po nadojení uchovávať na čistom mieste skonštruovanom a

vybavenom tak, aby sa zabraňovalo jeho kontaminácii. Musí sa ihneď schladiť na

teplotu najviac 8 °C, ak sa vykonáva každodenný zber alebo na teplotu najviac 6 °C, ak

sa nezberá denne (Nariadene Európskeho parlamentu a rady (ES) č. 853/2004,

v znení nariadení ES č. 1662/2006 a č. 1020/2008).

Vychladením mlieka sa na jednej strane obmedzí rozmnožovanie väčšiny druhov

kontaminujúcej mikroflóry, ale na strane druhej sa množia psychotrofné

mikroorganizmy, ktoré sa v konečnom dôsledku podieľajú na celkových počtoch

mikroorganizmov a teda na mikrobiologickej kvalite mlieka (Čanigová, 2001).

Vplyvom vonkajších podmienok chovu a manipulácie so zvieratami dochádza

k vzniku porúch spúšťania mlieka, ktoré sa prejavujú predlžovaním času dojenia,

znížením nádoja a čiastočným alebo úplným zadržaním mlieka v priebehu dojenia.

Zadržané mlieko vo vemene slúži ako zdroj pre baktérie, v dôsledku čoho sa zvyšuje

riziko ochorenia mliečnej žľazy na mastitídu (Tančin et al., 2001).

Stavby a zariadenia, v ktorých sa získava, ošetruje a uchováva surové kravské

mlieko nesmú ovplyvňovať jeho kvalitu a zdravotnú bezchybnosť, musia byť

udržiavané v dobrom stave, pravidelne čistené a dezinfikované (Trúchla et al., 1998).

Správne pracovné postupy manipulácie s prašnými krmivami a podstielkou obmedzí

možnosť kontaminácie mlieka vzduchom (Foltys et al., 1996).

V oblasti prvovýroby mlieka treba dodržiavať nasledujúce požiadavky:

hygienický program dojenia,

hygienu, sanitáciu maštalí, mliečnic, dojacích zariadení,

kontrolu funkčného stavu dojacej techniky,

sledovať zdravotnú situáciu v chove dojníc,

sledovať zdravotný stav mliečnej žľazy,

30

sledovať zdravotný stav ošetrovateľov,

dodržať dobu na schladenie mlieka po nadojení do 150 minút (Burdová,

Baranová a Pažáková, 1998).

V oblasti spracovateľského priemyslu:

zabezpečiť šetrné zaobchádzanie s mliekom zvlášť pri zvoze do mliekarne,

kontrola hygienického stavu a účinnosti sanitácie prepravných cisterien,

nepredlžovať skladovanie schladeného mlieka pred spracovaním,

zabrániť opätovnej kontaminácii po tepelnom ošetrení,

zvlášť na tzv. kritických bodoch mliekarských zariadení pravidelne a cielene

kontrolovať účinnosť sanitácie,

sledovať podmienky skladovania (čas, teplota),

sledovať výskyt psychotropných mikroorganizmov v surovom mlieku určenom

na výrobu syrov, fermentovaných mliečnych výrobkov a mliečnych výrobkov

s predĺženou trvanlivosťou (Burdová et al., 1998).

3.4 Stanovenie počtu koliformných baktérií v surovom kravskom

mlieku

Pri stanovení počtu koliformných baktérií v surovom kravskom mlieku sa postupuje

podľa požiadaviek viacerých technických noriem.

STN ISO 4832 (560085) (1.11.2009) - Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na

stanovenie počtu koliformných baktérií - metóda počítania kolónií.

STN ISO 7218 (1.1.2008) - Mikrobiológia potravín a krmív. Všeobecné pravidlá

a pokyny na mikrobiálne skúšanie (ISO 7218:2007).

STN ISO 6887-1 (1.11.2001) a STN ISO 6887-1/Oa (1.10.2004) –

Mikrobiológia potravín a krmív. Úprava analytických vzoriek, príprava základnej

suspenzie a desaťnásobných riedení na mikrobiologické skúšanie. Časť 1:

Všeobecné pokyny na prípravu základnej suspenzie a desaťnásobných riedení

(ISO 6887-1:1999).

STN ISO 6887-5 (1.1.2011) – Mikrobiológia potravín a krmív. Úprava

analytických vzoriek, príprava základnej suspenzie a desaťnásobných riedení na

mikrobiologické skúšanie. Časť 5: Špecifické pokyny na úpravu mlieka

a mliečnych výrobkov (ISO 6887-5:2010).

31

Vzorka mlieka sa dôkladne premieša niekoľko násobným prevrátením. Zo vzorky sa

napipetuje 1 ml mlieka do 9 ml fyziologického roztoku s peptónom. Tento postup sa

opakuje až do dosiahnutie potrebného riedenia (pre surové kravské mlieko sa spravidla

používa druhé a tretie riedenie). Na každé riedenie sa používa nová sterilná pipeta a pri

prenášaní vzorky sa dbá nato, aby sa hrot pipety nedotkol riediaceho roztoku.

Premiešavanie vzorky v procese riedenia sa vykonáva hrotom pipety, ktorá sa

použije na nasledujúce riedenie a to 10-násobným nasatím a vyprázdnením pipety alebo

pomocou vortexu tak aby sa vytvoril vír. Konečné riedenie sa inokuluje po 1 ml

súbežne do dvoch Petriho misiek. Inokulum sa zalieva do 45 min od prípravy prvého

riedenia 15 ml živnej pôdy (VČŽL) s teplotou 44 °C – 47 °C. Petriho misky sa dôkladne

premiešajú a nechajú sa stuhnúť na chladnej vodorovnej ploche. Po úplnom stuhnutí

média sa Petriho misky inkubujú v termostate obrátené hore dnom pri teplote 37 °C 24

hod. 2 hod. Zároveň so vzorkami sa robia kontrolné skúšky na sterilitu pôdy,

fyziologického roztoku s peptónom a ovzdušia. Kontrola sterility pôdy sa robí naliatím

15 ml do Petriho misky. Kontrola fyziologického roztoku s peptónom sa robí zaliatím

1 ml fyziologického roztoku s peptónom 15 ml média. Kontrola ovzdušia sa robí

naliatím 15 ml média do Petriho misky, ktorá sa nechá otvorená 1 minútu. Petriho

misky s kontrolami sa umiestnia do termostatu spolu s Petriho miskami so vzorkami

a inkubujú sa rovnako.

Po ukončení inkubácie sa na miskách spočítajú kolónie. Výsledok sa vypočíta podľa

nasledovného vzorca:

N = _____ c____

V x 1,1 x d

Kde: c - súčet všetkých kolónií spočítaných na vybraných Petriho miskách

V – objem inokula v ml očkovaný na každú misku (1 ml)

d - riediaci faktor zhodný s prvým použitým riedením (10-n)

Výsledok sa zaokrúhli tak, aby obsahoval dve platné číslice.

Výsledok sa vyjadrí nasledovne:

„Počet koliformných baktérií v 1 ml, vyjadrený ako číslo medzi 1,0 a 9,9 x10x“

32

4 Návrh na využitie poznatkov

Na základe poznatkov, ku ktorým sme dospeli štúdiom danej problematiky

navrhujeme nasledovné opatrenia s cieľom zabrániť kontaminácii mlieka koliformnými

baktériami:

- zabezpečiť prevádzkovú hygienu,- dodržiavať osobnú hygienu, - zabezpečiť hygienu a technologické ošetrenie mlieka po nadojení, chladenie

a uchovávanie mlieka, - zabezpečiť hygienu pri preprave a skladovaní mlieka.

Získané poznatky nám poskytli obraz o danej problematike, na základe ktorých

budeme pokračovať pri riešení diplomovej práce.

33

Záver

Mlieko je výborná živná pôda pre rozvoj patogénnych mikroorganizmov. Medzi

najrozšírenejšie koliformné mikroorganizmy, ktoré spôsobujú ochorenia rôzneho

pôvodu patria Enterobacter, Serratia, Klebsiella, Proteus, Yersinia, Hafnia,

a Escheriachia coli. Všetky spomínané kolifomné bakérie majú negatívny vplyv na

senzorické vlastnosti mlieka a na zdravie konzumenta. Aby sa zabránilo rozvoju týchto

mikroorganizmov, je veľmi dôležité dodržiavanie hygieny pri získavaní mlieka. Mlieko

môže byť kontaminované mikroorganizmami dôsledkom primárnej alebo sekundárnej

kontaminácie. Primárna kontaminácia nastáva pred vydojením mlieka z vemena a preto

je dôležité, aby sa oddeľovali prvé streky mlieka, ktoré obsahujú najviac

mikroorganizmov. Mlieko po oddojení prvých strekov je mikrobiologicky veľmi čisté.

Počet mikroorganizmov v mlieku závisí od starostlivosti o dojnicu z hľadiska hygieny.

Dôležitým ukazovateľom kvality mlieka je aj zdravotný stav a vek zvieraťa.

Z hľadiska hygieny sa za nebezpečnejšiu považuje sekundárna kontaminácia mlieka

mikroorganizmami, ktorá je zapríčinená okolím dojnice. Všeobecne podľa Európskej

legislatívy musia byť dojace zariadenia a priestory, kde sa mlieko skladuje a kde sa s

ním manipuluje alebo kde sa schladzuje, umiestnené a skonštruované tak, aby obmedzili

riziko kontaminácie mlieka. Sekundárnu kontamináciu mlieka môžu spôsobiť aj

samotní pracovníci v mliekarenských závodoch, preto je dôležité dodržiavať osobnú

hygienu.

Vysoký počet mikroorganizmov v mlieku môže byť následkom nedostatočného

tepelného alebo chladiaceho ošetrenia mlieka. Patogénne mikroorganizmy v mlieku

a  mliečnych výrobkoch môžu u konzumenta vyvolať ochorenia rôzneho pôvodu. Preto

je ich výskyt v potravine neprípustný. Najčastejšie príčiny vzniku ochorení súvisia

s nedodržiavaním technologických postupov a v porušení zásad hygieny. Kontaminácia

surového mlieka patogénnymi mikroorganizmami sa zisťuje vhodnými analytickými

metódami, pričom ich správna voľba a  využitie sú predpokladom úspechu pri prevedení

kontrolných vyšetrení. Mikrobiologické skúšky sa vykonávajú podľa medzinárodných

ISO noriem.

Z hľadiska hygieny a bezpečnosti potravín je dôležité aby sa dodržiavali platné

legislatívne požiadavky pre surové mlieko. Pri prekročení stanovených limitov pre

jednotlivé mikroorganizmy v mlieku a mliečnych výrobkoch, musia byť tieto vylúčené

z dodávky na výrobu alebo zo spotreby ľuďmi a následne musia byť stiahnuté z trhu. Pri

34

stanovení kvality mlieka sa musia dodržiavať stanovené hodnoty obsahu jednotlivých

zložiek mlieka podľa platnej legislatívy a technickej normy.

35

Zoznam použitej literatúry

1. ARS – Agriculture Research Service, United States Department of Agriculture.

2005. Escherichia coli In Wikipedia [online] 2005 [cit. 2011-28-4]. Dostupné na

internete: <http://en.wikipedia.org/wiki/File:E_coli_at_10000x,_original.jpg>.

2. BLACKBURN, C. W. 2006. Food spoilage microorganisms. 1. Vyd. Cambridge

England : Woodehead Publishing Limited, 2006. 753 s., ISBN 978-1-85573-966-6.

3. BOROŠ, V. 1999. Hlavné faktory ovplyvňujúce kvalitu mlieka. Kvalita mlieka ako

surovina a nový systém jej hodnotenia. In Zborník referátov a referátových

materiálov z odborného seminára. Žilina : VÚM, 1999 s. 40-50.

4. BURDOVÁ, O. – BARANOVÁ, M. – PAŽAKOVÁ, J. 1998. Vplyv mikrobiálnej

kontaminácie surového mlieka na kvalitu mliečnych výrobkov. In Zborník

prednášok a posterov, „Hygiena alimentorum XIX“, 1998, Košice : UVL, s. 39-40,

ISBN 80-7148-028-2.

5. BURDOVÁ, O. 2001. Hygiena a technológia mlieka a mliečnych výrobkov.

Košice : Univerzita veterinárneho lekárstva. 2001, 300 s. ISBN 80-88985-58-7.

6. CDC – Centrum for Disease Control and Protection, United States,

Department of Health and Human Services. 2005. Citrobacter freundii. In

Wikipedia [online] 2009 [cit. 2010-29-12]. Dostupné na internete:

<http://en.wikipedia.org/wiki/File :Citrobacter_freundii.jpg>.

7. CDC ATLANTA – Centrum for Disease Control and Protection, Atlanta,

United States, Department of Health and Human Services. 2006. Klebsiella

pneumonie In Wikipedia [online] 2006 [cit. 2011-28-4]. Dostupné na internete:

<http://de.wikipedia.org/w/index.php?title=Datei:Klebsiella-pneumoniae.jpg&file

timestamp=20060417213229>.

8. ČANIGOVÁ, M. 2001. Príspevok k možnosti ovplyvňovania mikrobiologickej

kvality mlieka. In Slovenský chov, roč. 6, 2001, č. 5, s. 26 – 27. ISSN 1335 – 1990.

9. ČAPALA, J. – ZAJÁC, P. – VÁCZIOVÁ, Z. – GOLIAN, J. 2008.

Mikrobiologická kvalita surového kravského mlieka vo vybranej oblasti. In Zborník

prác z medzinárodnej vedeckej konferencie, „Bezpečnosť a kontrola potravín“, II.

diel. Nitra: SPU, 2008, s. 226-231, ISBN 978-80-552-0028-6.

10. FOLTYS, V. - MIHINA, Š. et al. 1996. Dojenie a získavanie kvalitného mlieka.

Nitra : VŠP, 1996, 40 s. ISBN 80-7137-327-3.

36

11. GORNER,F. – VALÍK, Ľ. 2004. Aplikovaná mikrobiológia požívatín. 1.vyd.

Bratislava: Malé centrum, 528 s., ISBN 80-967064-9-7.

12. GRIEGER,C. – HOLEC, J. 1990. Hygiena mlieka a mliečnych výrobkov.

1.vyd.Bratislava: Príroda, 397 s., ISBN 80-07-00253-7.

13. HERT, J. A. - GROHN, Y. T. – LEACH, J. D. G. – BAR, D. – BENNETT, G. J.

– GONZÁLEZ, R. N. – RAUCH, B. J. – WELCOME, F. L. – TAUER, L. W. –

SCHUKKEN, Y. H. 2010. Effects of clinical mastitis caused by gram-positive and

gram-negative bacteria and other organisms on the probability of conception in New

York State Holstein dairy cows. In Journal of Dairy Science, roč. 93, 2010, č. 4, s.

1551-1560.

14. KUANG, Y. – TANI, K. – SYNNOTT, A. J. – OHSHIMA, K. – HIGUCHI, H. –

NAGAHATA, H. – TANJI, Y. 2009. Characterization of bacterial population of

raw milk from bovine mastitis by culture-independent PCR-DGGE method. In

Biochemical Engineering Journal, roč. 45, 2009, č. 1, s. 76-81.

15. MARTÍN, M. C.- MARTÍNEZ, N. – RIO, B. – LADERO, V. – FERNANDÉZ,

M. ALVAREZ, M. A. 2010. A novel real-time polymerase chain reaction-based

method for the detection and quantification of lactose-fermenting

Enterobacteriaceae in the dairy and other food industries. In Journal of Dairy

Science, roč. 93, 2010, č. 3, s. 860-867.

16. MOTARJEMI, Y. – ADAMS, M. 2006. Emerging Foodborne Pathogens. 1. vyd.

Woodhead Publishing : Cambridge, England. 2006. 614, s. ISBN 978-1-85573-963-

5.

17. NAAS, H. – TKÁČIKOVÁ, Ľ – CABADAJ, R. et al. 1998. Diagnostické metódy

používané pri detekcii E.coli O157:H7 v potravinách. In Zborník prednášok

a posterov, „Hygiena alimentorum XIX“, 1998, Košice : UVL, s. 150-153, ISBN

80-7148-028-2.

18. NAM, H. M. – LIM, S. K. – KANG, H. M. – KIM, J. M. – MOON, J. S. –

JANG, K. C. – KIM, J. M. – JOO, Y. S. – JUNG, S. C. 2009. Prevalence and

antimicrobial susceptibility of gram-negative bacteria isolated from bovine mastitis

between 2003 and 2008 in Korea. In Journal of Dairy Science, roč. 92, 2009, č. 5, s.

2020-2026.

37

19. NARIADENIE EURÓPSKEHO PARLAMENTU A RADY (ES) Č. 1662/2006 zo

6. novembra 2006, ktorým sa mení a dopĺňa nariadenie Európskeho parlamentu a

Rady (ES) č. 853/2004, ktorým sa ustanovujú osobitné hygienické predpisy pre

potraviny živočíšneho pôvodu. Ú. v. EÚ L 320, 18.11.2006, s. 1 – 10.

20. NARIADENIE EURÓPSKEHO PARLAMENTU A RADY (ES) Č. 852/2004 z 29.

apríla 2004 o hygiene potravín. Ú. v. EÚ L 139, 30.4.2004, s. 1 – 54.

21. NARIADENIE EURÓPSKEHO PARLAMENTU A RADY (ES) Č. 853/2004

Európskeho parlamentu a Rady z 29. apríla 2004, ktorým sa ustanovujú osobitné

hygienické predpisy pre potraviny živočíšneho pôvodu. Ú. V. EÚ L 139, 30.4.2004,

s. 55 – 205.

22. NATARO, J. P., KAPER, J. B. 1998. Diarrheagenic Escherichia coli. In Clinical

Microbiology Reviews. roč. 11, 1998, s. 142-201.

23. ROBINSON, R. K. et al., 2000. Encyclopedia of Food Microbiology, Volumes 1-3.

Elsevier, 2000, 2405 s. ISBN 978-0-12-227070-3.

24. SEMJAN, Š. 1994. Mliekarstvo. 2. prepracované vydanie. Nitra : Vysoká škola

poľnohospodárska, 1994. 84 s. ISBN 80-7137-157-2.

25. STN ISO 4832 (560085) (1.11.2009) - Mikrobiológia. Všeobecné pokyny na

stanovenie počtu koliformných baktérií - metóda počítania kolónií.

26. STN ISO 6887-1 (1.11.2001) a STN ISO 6887-1/Oa (1.10.2004) – Mikrobiológia

potravín a krmív. Úprava analytických vzoriek, príprava základnej suspenzie

a desaťnásobných riedení na mikrobiologické skúšanie. Časť 1: Všeobecné pokyny na

prípravu základnej suspenzie a desaťnásobných riedení (ISO 6887-1:1999).

27. STN ISO 6887-5 (1.1.2011) – Mikrobiológia potravín a krmív. Úprava analytických

vzoriek, príprava základnej suspenzie a desaťnásobných riedení na mikrobiologické

skúšanie. Časť 5: Špecifické pokyny na úpravu mlieka a mliečnych výrobkov (ISO

6887-5:2010).

28. STN ISO 7218 (1.1.2008) - Mikrobiológia potravín a krmív. Všeobecné pravidlá

a pokyny na mikrobiálne skúšanie (ISO 7218:2007).

29. TANČIN, V. – HLUCHÝ, S. – MIHINA, Š. – UHRINČAŤ, M. – HETÉNYI, L.

2001. Fyziológia získavania mlieka a anatómia vemena. 1. vyd. Nitra : Výskumný

ústav živočíšnej výroby Nitra vo vydavateľstve Slovenský chov, 2001. 122 s. ISBN

80-88872-13-8.

38

30. TANČINOVÁ, D. – MAKOVÁ, J. – FELSOCIOVÁ, S. et al. 2005.

Mikrobiológia potravín. Nitra : SPU, 2005, 144 s. ISBN 80-8069-568-7.

31. TKÁČIKOVÁ, Ľ. – TÓTH, L. – NAAS, H. T. – MIKULA, I. 1998. Výskyt

E.coli O157:H7 vo vzorkách mlieka v mliečnicach východoslovenského regiónu. In

Zborník prednášok a posterov, „Hygiena alimentorum XIX“, 1998, Košice, s. 212-

213, ISBN 80-7148-028-2.

32. TRÚCHLA, V. – SOKOL, J. – LANČ, A. 1998. Hygiena získavania mlieka. In

Zborník prednášok zo seminára, ,,Predpoklady a aktuálne problémy výroby

a získavania mlieka“, Nitra : SPU, 1998, s. 47 – 57.

33. URL 1 Hygienické požiadavky na priamy predaj a dodávanie malého množstva

prvotných produktov živočíšneho pôvodu, surového mlieka [online] 2007 [cit. 2010-

29-12]. Dostupné na internete: <http://predajzp-sm.sk/index.php?content=2>.

34. VASIĽ, M. 2000. Kvalita mlieka a syrov vo vzťahu k mastitídam dojníc a výskytu

patogénnych baktérií. In Mliekarstvo, roč. 31, 2000, č. 3, s. 8-12.

35. YE, Y. – WU, Q. – XU, X. – YANG, X. – DONG, X. – ZHANG, J. 2010. The

phenotypic and genotypic characterization of Enterobacte rsakazakii strains from

infant formula milk. In Journal of Dairy Science, roč. 93, 2010, č. 6, s. 2315-2320.

36. Zákon č. 152/1995 o potravinách v znení zákona Národnej rady Slovenskej

republiky č. 290/1996 Z. z., zákona č. 470/2000 Z. z., zákona č. 553/2001 Z. z.,

zákona č. 23/2002 Z. z., zákona č. 450/2002 Z. z., zákona č. 472/2003 Z. z. a zákona

č. 546/2004 Z. z..

39