酿酒葡萄的次生代谢和逆境栽培管理

酿酒葡萄的次生代谢和逆境栽培管理

黄卫东中国农业大学葡萄酒科技发展中心

植物的初生代谢及初生代谢产物（ Primary metabolites）是维持细胞生命活动所必需的。

但是，植物在长期的进化过程中，植物遇到各种各样的逆境，包括生物逆境和非生物逆境，为了生存和适应这些逆境，植物逐步分化出次生代谢。

植物的次生代谢产物（ Secondary metabolites）是指植物体中一大类并非生长发育所必需的小分子有机化合物。其产生和分布通常有种属、器官组织、生长发育期和遭遇逆境的特异性。

植物的次生代谢即指次生代谢物在植物中合成与分解的过程。

一些小分子有机物在代谢途径上与次生代谢比较相似或有关，但是，它们具有明显的生理功能，如萜类物质赤霉素、脱落酸等，它们被称为植物生长调节物质或植物激素，目前，不把它们视为次生代谢物。但是，随着科学的深入，植物的次生代谢物的概念会发生改变。

次生代谢是植物在长期的进化过程中对生态环境适应的结果。

许多植物在受到病原微生物侵染后，产生并积累次生物质，用以增强自身的抗性，这些小分子物质称为植保素（ Phytoalexin）。如很多的萜类、生物碱和异黄酮等。

一些次生代谢物，如水杨酸、茉莉酸等，作为信号分子参与调控植物的生理活动。

酿酒葡萄的次生代谢产物是酿酒葡萄果皮和果肉代谢库的主要成分，它在品质调控上具有重要的作用，甚至决定了葡萄和葡萄酒的质量。

一、酿酒葡萄次生代谢产物的类型

酿酒葡萄的次生代谢产物很多，一般归类为三大类，酚类化合物、萜类化合物和含氮化合物。主要有：酚类、黄酮类、糖苷、生物碱、萜类、香豆素、有机酸等。

1、酚类广义的酚类包括黄酮类、简单酚类和醌类。莽草酸途径是这些芳香族化合物的来源的主要途径。

1.1 黄酮类是一大类以苯色酮环为基础，具有

C6、 C3、 CH6结构的酚类化合物。

黄酮类化合物的生物合成前体为苯丙氨酸和马龙基辅酶 A(Malonyl CoA)。

根据 B环的连接位置不同可分为 2-苯基衍生物（黄酮、黄铜醇等）、 3-苯基衍生物（异黄酮）和 4-苯基衍生物 (新黄酮）。

根据其三碳结构的氧化程度可分为花色苷类、黄酮类、黄酮醇类以及黄烷酮类。

黄酮类是酿酒葡萄和葡萄酒的主要成分。很多黄酮类有利于人的心血管系统的保护和有关疾病的治疗；许多异黄酮类在酿酒葡萄植物中作为植保素存在。

1.2 简单酚类是含有一个被羟基取代苯环的化合物。具有调节植物生长的作用，有些也是植保素的重要成分。

1.3 醌类由苯式多环烃碳氢化合物（如萘、蒽等）衍生的芳香二氧化合物。可分为苯醌、萘醌及蒽醌等。

醌类的存在是植物呈色的主要原因之一。

2、萜类萜类是异戊烯单元（ 5碳）组成的化合物，通过异戊二烯途径（又称甲羟戊酸途径）产生。

2.1 低等萜类由 2个、 3个和 4个异戊烯单元分别组成单萜、倍半萜和二萜。

单萜和倍半萜是酿酒葡萄挥发油的主要成分，也是香料的主要成分。

许多倍半萜和二萜化合物也是植保素。

2.2 高等萜类甾类化合物和三萜的合成前体都是含 30碳原子的鲨烯。甾类化合物由 1个环戊烷并多氢菲母核和 3个侧链基本骨架组成。

植物体内三萜皂苷元和甾体皂苷元分别与糖类结合形成三萜皂苷和甾体皂苷。

胡萝卜素类也是高等萜类，但是，一般不把它划在次生物质内。

3、含氮化合物 3.1 生物碱是一类含氮的碱性天然产物。有 2000多种。有些也是植保素。

3.2 胺类是 NH3中的氢的不同取代产物，根据取代基数分为伯、仲、叔、季胺 4种。通常由氨基酸脱羧或醛转氨而产生。

3.3 非蛋白氨基酸是不组成植物蛋白的氨基酸，常有毒。多集中豆科植物中，酿酒葡萄尚未发现。

4、有机酸等有机酸广泛分布于植物各部位。有些有机酸如茉莉酸是植物重要的信号分子。

二、与酿酒葡萄抗病栽培有关的次生代谢产物

适应和抵抗逆境的作用是植物次生代谢物的一个重要生理功能，是植物长期进化的结果。

参与防卫的次生物质很多，包括各种类型的植保素、木质素和其他一些次生代谢物。

1、植保素植保素是植物受侵染后产生的一类相对分子质量（Mr)较低的抗病原物的次生物物质，其产生的速度和积累的量与植物的抗病性有关。

异黄酮豌豆素是第一个被分离鉴定的植保素。植保素成分类型不一，其中研究最多的是黄酮类和萜类。

植保素是受诱导产生的，致病或不致病的小种均能诱导植保素的形成，一些非生物因素如紫外光、重金属等也可诱导植保素的产生。近年来发现，一些真菌培养液滤液和菌丝体提取物（称为诱导物， Elicitor）也能诱导植保素的形成。

此外，还有许多次生代谢物质在植物的防御机理中起作用，它们通常在酿酒葡萄受到侵染后发生量和质的变化，如原儿茶酚和儿茶酚、绿原酸等。

2、作为系统获得性抗性反应（ SAR）中的信号分子

植物在受到病源菌侵染或非生物逆境后，引发局部防御反应——过敏反应，导致侵染或受伤部位积累抗性物质，或限制或杀伤病原菌，或破坏自身局部细胞结构，形成防护层；另外，同时导致信号分子的产生，信号分子的传输又引发植物的其他部位产生抗性反应，这就是系统获得性抗性反应（ SAR）。

一些次生代谢物质作为信号分子参与了酿酒葡萄系统获得性抗性反应（ SAR）。

如 SA，就是近年来研究的热点，并取得了很大的进展。在生物或非生物逆境下，酿酒葡萄的 SA 明显增加，显示明显的信号分子特征，外施 SA可以明显诱导产生防卫蛋白，如几丁质酶、过氧化酶系统等，诱导与抗性相关的蛋白的基因转录，又诱导次生代谢等。

又如茉莉酸（ JA），也是近年来研究较多的信号分子，特别是作为伤信号分子。

JA可以明显诱导与抗伤害有关的基因的表达和蛋白转录，提高抗伤害能力。

三、次生代谢途径关键酶的分子克隆与调控

次生代谢产物的前体有：乙酸、莽草酸以及甲羟戊酸等少数几个。它们产生于初生代谢，经过酶催化形成几大类基本骨架，再由各种类型的酶促反应进行修饰，产生各种各样的次生代谢产物。

一些可诱导的代谢关键酶基因已经被克隆，打下了植物防御反应调控机制研究的基础。

（一）代谢关键酶基因的克隆

1、苯丙烷类代谢酶系黄铜类植保素、木质素、 SA等的生物合成都是通过苯丙烷类生物合成途径。许多酶已经克隆。

苯丙氨酸解氨酶（ PAL）、肉桂酸 -4-羟化酶（ CA4H）和 4-香豆酸 CoA连接酶（ 4CL）是这个途径的关键酶。

1.1 果实发育期，苯丙烷类代谢酶系的表达和 SA的调控

PAL和 4CL常常为多个成员组成的基因家族所编码， PAL有的多达 20多个，不同的基因的表达受发育和环境信号的调节。

28s

18s

DNA

葡萄果实发育过程中原花色素合成葡萄果实发育过程中原花色素合成相关酶转录水平的变化规律相关酶转录水平的变化规律

Cabernet Sauvignon ChardonnaySkin

PAL

CHS

F3H

DFR

LDOX

M 20d 40d 70d 90d 100d M 20d 40d 70d 90d 100d

Cabernet Sauvignon ChardonnayFlesh

PAL

CHS

F3H

DFR

LDOX

M 20d 40d 70d 90d 100d M 20d 40d 70d 90d 100d

Cabernet Sauvignon ChardonnaySeed

PAL

CHS

F3H

DFR

LDOX

M 20d 40d 70d 90d 100d M 20d 40d 70d 90d 100d

果实发育过程中，原花色素合成相关酶表达受到严格的控制，与果实发育时期密切相关；且不同部位表达规律互不相同。

赤霞珠果皮中，各基因均在幼果期和成熟期大量表达；而霞多丽果皮中，则仅在幼果期大量表达（ PAL

例外，成熟期表达量也较高）。

果肉中，各基因均在幼果期大量表达，而随果实发育，表达量有所下降。

种子中各基因表达与果肉相似。

SA 明显诱导相关基因表达

SA 孵育果实（花后 70天，转色期）圆片

SA低压渗透（花后 100天，成熟期）

PAL、 CHS、 F3H、 DFR、 LDOX基因表达变化规律

长度Size(bp)

序列同源性Sequence Identity (%)

PAL-P 376 92.55%

CHS-P 330 96.67%

F3H-P 460 100.0%

DFR-P 267 99.63%

LDOX-P 240 98.75%

ACTIN1-P 168 99.40%

探针序列同源性

Identity of probe sequence

探针制备

cDNA 定量

圆片孵育低压渗透 M CK 30min 1h 3h 5h M CK 8h 16h 24h 32h 48h

圆片孵育低压渗透

CK 30min 1h 3h 5h CK 8h 16h 24h 32h 48h

PAL

CHS

F3H

DFR

LDOX

SA能够诱导葡萄果实PAL、 CHS、 F3H、 DFR、 LDOX的表达。

不同处理方式，各基因响应时间不同。圆片处理，各基因均在处理后 30 min 表达量达最大值。而低压渗透则在 16、 24h 表达量达最大。

1.2 查耳酮合成酶（ CHS）基因的克隆与 T 载体的构建

查尔酮合成酶（ CHS）是将苯丙烷代谢途径引向黄酮类合成的第一个酶。我们以酿酒葡萄为试材，进行了查耳酮合成酶（ CHS）基因的克隆与 T 载体的构建。

查耳酮合成酶（ CHS）二聚体结构

CHS

图 2.1： PCR克隆 chs 全长基因Fig.2.1. PCR amplification.

PCR克隆葡萄chs 全长基因

PCR产物凝胶回收

图 2.2： PCR产物凝胶回收电泳检测Fig.2.2. Agarose-gel electrophoresis of purified PCR product（

1225 bp） stained with ethidium bromide.

图 2.3： pMD -chs重组质粒构建图Fig.2.3. Construction of the recombined pMD –chs plasmid.

T 载体构建示意图

图 2.4：重组质粒的鉴定Fig.2.4. Identification of the insertion of the recombined

plasmid

重组质粒的鉴定

1. 实验使用高保真的 TaKaRa Ex Taq DNA polymerase，以 chs质粒 DNA为模版，进行 PCR反应，经过小提质粒、酶切鉴定和测序鉴定得到葡萄 chs 全长基因，与Sparvoli等（ 1994）在葡萄叶片克隆的结果同源性达到 99 ％，且开放阅读框没有移码错误，为进一步构建表达载体奠定坚实的基础。

2. 实验在设计引物的时候在引物两端添加了EcoR I和 Sal I 双酶切位点（ Takara），除了具备其切割后产生不同的粘性末端外，同时通用 buffer的使用能够明显的提高切割效率。

原核表达载体 pET-chs的构建

IPTG诱导下在大肠杆菌中高效表达 CHS 融合蛋白

Ni-NTA 琼脂糖凝胶纯化

双酶切并回收纯化目的 chs & pET-30a（+）片段

图 3.1： EcoR I和 Sal I 双酶切回收 chs和 pET-30a (+) 片断Fig.3.1. Digestion with EcoR I and Sal I of pMD-chs and pET-30a

(+)

原核表达载体的构建

图 3.2.：原核表达载体 pET-chs 构建图Fig.3.2. Construction of the recombined expressed plasmid

pET-chs.

重组表达质粒的鉴定

图 3.3：酶切鉴定重组表达质粒Fig.3.3. Identification of the plasmid pET-chs by digestion with restriction enzymes

IPTG诱导表达原核蛋白

图 3.4： IPTG诱导融合蛋白在大肠杆菌中的原核表达（ SDS-PAGE分析）

Fig.3.4. Expression of fusion pET-CHS protein in E.coli strain BL21(DE3) pLysS under inducing by IPTG (SDS-PAGE

assay)

Ni-NTA 琼脂糖凝胶树脂纯化前后SDS 电泳分析 & Western bolt

分析

图 3.5： SDS分析纯化前后的 CHS 融和蛋白（ a）和蛋白质免疫印记分析（b）

Fig.3.6. Purification of recombinant CHS fusion protein showing staining (a) and immunblotting (b) detection of the

purified CHS

1. 实验采用 EcoR I和Sal I 双酶切分别得到目的基因 chs和原核表达载体片段并通过 T4 DNA连接酶进行定向连接，得到表达质粒pET-chs，并通过小提质粒、酶切鉴定以及测序鉴定得到开放阅读框读码正确的原核表达载体。

2. 实验采用室温条件下，使用0.6 mM的 IPTG在适当振荡速度条件下诱导表达融合蛋白，表达量达到全菌量的40 ％左右。SDS分析结果与Cain等（1997）在拟南芥中得到的结果相似。

3. 实验利用His• Tag 单克隆抗体进行蛋白质免疫印迹分析，杂交得到 47 kD单一蛋白条带，验证了表达和纯化的正确性。

4.经过Ni-NTA 琼脂糖树脂纯化后的CHS 蛋白，电泳纯达到 99 ％以上，可以用于制备抗体用的抗原。

葡萄查耳酮合成酶（ CHS）多克隆抗体的制备与纯化

蛋白质电泳分析多克隆抗体

图 4.1 CHS多克隆抗体血清纯化各阶段获得的抗体组分的 SDS-PAGE分析

Fig.4.1 Coomassie brilliant blue R-250-stained sodium dodecyl SDS-PAGE of IgG fractions obtained at each stage

of purificationof the anti-CHS antiserum.

抗体的灵敏度检测

图 4.2：稀释 3000 倍的查尔酮合成酶抗体与纯化的查尔酮合成酶的 Protein Dot Blot分析

Fig.4.2. Protein dot blot of 1/3000 dilution of the anti-CHS antibody

图 6.

酶联免疫分析

图 4.3：查尔酮合成酶抗体的效价分析（ ELISA）Fig.4.3. Analysis of anti-CHS titer (ELISA).

葡萄不同组织部位（ a）以及果实发育过程（ b）可溶性蛋白提取液中

CHS的免疫印迹分析

图 4.4 葡萄不同组织（ a）以及果实发育过程中（ b）可溶性蛋白粗体液中 CHS的免疫印迹分析

Fig.4.4. Immunodetection of CHS prtein in the soluble crude extracts from the different tissues of grape (a)

and throughout the berry development.

免疫后血清经过 (NH4)2SO4 沉淀和DEAE 离子交换层析后得到纯化的anti-chs 的 IgG。

蛋白质斑点杂交和 ELISA分析表明抗体具有良好的检测灵敏度。

使用葡萄果实不同组织部位和发育过程各个时期的蛋白提取液进行免疫反应均可以得到一条 43 kDa 左右的蛋白条带。

表达质粒 pET-chi的构建原核表达条件筛选亲和纯化查耳酮异构酶多克隆抗体的制备与纯化

1.3 查耳酮异构酶多克隆抗体制备

Fig.1 Agarose gel electrophoretic analysis of PCR product of chi gene M, DNA maker DL2000; C, PCR product of grape chi gene

PCR 扩增葡萄查耳酮异构酶 CHI 全长基因

chi RT-PCR产物

T4 DNA连接酶

EcoRI 和 XhoI双酶切，回收目的基因

EcoRI 和 XhoI双酶切，回收目的基因

ATG TAApET-30a

5422bp

kan

ori

lac1

T7 promoter

f1 Origin XhoI

EcoRI

pET-chi

6124bp

kan

ori

lac1

T7 promoter

f1 OriginXhoI

EcoRI

chi

图 1-1 原核表达质粒 pET-CHI的构建Fig.1-1. Construction of recombinant prokaryotic expression plasmids pET-CHI

小提质粒，双酶切鉴定

Fig. 2 Restriction enzyme digestion analysis of pET-chiM1, DNA maker DL2000; M2, DNA maker, DL 15000; 1, EcoR I and Xho I digestion.

The arrow indicates the position of the fragments produced by EcoR I and Xho I digestion (702 bp).

Fig. 3 Induced expression results for different temperatureM, low molecular protein maker; Lane 1-4, 25 , 30 , 37 , 42℃ ℃ ℃ ℃.

蛋白表达诱导温度的优化

IPTG诱导剂加入量的优化

Fig.4 Induced expression results for different IPTG concentrationM, low molecular protein maker; lane 1-7, pET-chi BL21 with different IPTG concentration 0.05, 0.1, 0.2, 0.5, 0.6, 0.8, 1.0 mmol/L)

蛋白表达诱导时间的优化

Fig.5 Induced expression results for different time M, low molecular protein maker; lane 1-6, pET-chi BL21 with different time (0, 1, 2, 3, 4, 5h)

亲和层析纯化和回收 CHI 蛋白

Fig.6. Purification of recombinant CHI fusion protein showing staining (a) and immunblotting (b) detection of the purified CHI.

Lane 1, lysates of soluble fraction after induction with IPTG for 3h; lane 2, purified fusion protein;

lanes 3 and 4, immunoblotting of the total protein before purification and after purification. The patterns were stained by Coomassie brilliant blue R-250; lane M, molecular mass standards.

CHI多克隆抗体制备 DEAE-Sephadex A-50 初纯化抗体

Fig. 7. Coomassic brilliant blue R-250-stained sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel of IgG fraction obtained at each stage of purification

of the anti-CHI antiserum. Lane 1, (NH4)2SO4 precipitation resuspentionate; lanes 2, purification of anti-CHI antiserum; lane M,

protein molecular mass standards.

CHI抗体效价分析（ ELISA）

Antibody dilution (-fold)

Opt

ical

den

sity

at 4

90nm

0.0

.2

.4

.6

.8

1.0

1.2

1.4

1.6

1.8

2.0

1000

2000

4000

8000

3200

0

1600

0

1280

00

6400

0Fig. 9. Analysis of anti-CHI titer. Antibody titer was measured by ELISA. The

antibody at different dilution or (1000-128000-fold) was reacted with the equal amount of the purified fusion protein (1µg). Antibody titer is defined as the dilution of the antibody corresponds to antibody dilution of 0.500 at 490nm.

The arrow indicates the 0.500 absorbance value that corresponds to antibody

dilution times of about 20,000. values in the figure were the means ±SE(n=3).

CHI的 Protein Dot Blot分析

Fig. 8. Protein dot blot of 1/3000 dilution of the anti-CHI antibody. Dots 1-10 contain, respectively, 153.6, 76.8, 38.4, 19.2, 9.6, 4.8, 2.4, 1.2, 0.6, 0.3ng of the purified CHI protein.

The antibody used in this figure was the purified anti-CHI IgG.

（二）代谢关键酶的调控

1、UV 照射对 chs基因的诱导作用

葡萄果实总 RNA 提取 & RT-PCR分析

图 4.1：葡萄果实 RNA 提取（ a）与 RT-PCR分析 (b)Fig.4.1. Electrophoresis of Total RNA and analysis

of RT-PCR from grape berries(b)

a b

UV对果实酚类物质的影响

图 4.2： UV处理对葡萄果实总酚（ A）、总类黄酮（ B）、总花色苷（ C）

含量的影响Fig. 4.2

Changes of the total

phenols (A) total

flavonoids(B) and

anthocyanin (C)contents

after UV irradiation

UV对 chs基因的表达和蛋白数量的的影响

图 4.3： UV处理对葡萄果实chs 转录水平&CHS 蛋白数量的影响Fig 4.3

Changes of chs gene

expression & CHS

quantity after UV

inducement

1.8 KJ/m2的UV 处理转色期的葡萄果实，能够促进果实体内积累大量类黄酮代谢物质，诱导代谢基因（ chs）的转录和蛋白数量的增加，进而达到保护自身免受紫外伤害的目的。与 Longemann等（ 1999）的结果相似。

2 、糖渗透处理对葡萄果实CHS的调控作用

果实发育过程中糖含量

图 5.1：葡萄果实发育过程中蔗糖、葡萄糖、果糖含量变化规律图中数据为：平均值 ±SD（ n ＝ 3）

Fig .5.1 Changes of Sucrose, Glucose and Fructose during grape berry development

图 5.2 糖处理对葡萄果实总酚、总类黄酮以及花色苷含量的影响图中数据为：平均值 ±SD（ n ＝ 3）

Fig 5.2 Change of the total phenols total flavonoids and anthocyanin contents after sugers

induction

糖处理对果实酚

类物质的影响

图 6.3 糖处理对 chs基因表达的

影响Fig.6.3. Effict of sugars on the

chs gene expression in the

grape berry.

糖处理对幼果期果实c

hs

基因转录水平的影响

糖处理对转色期果实c

hs

基因转录水平的影响

图 6.4 糖处理对 chs基因表达的

影响Fig.6.4. Effict of sugars on the

chs gene expression in the

grape berry.

图 6.5：糖处理对葡萄果实

CHS 蛋白数量的影响Fig.6.5. Effict of sugars on the CHS in

the grape berry.

糖处理对幼果期果实C

HS

蛋白数量的影响

糖处理对幼果期果实C

HS

蛋白数量的影响

图 6.6：糖处理对葡萄果实 CHS蛋白数量的

影响Fig.6.5. Effict of sugars on the CHS in

the grape berry.

葡萄浆果中蔗糖含量很低，可溶性碳水化合物主要是葡萄糖和果糖，果实发育过程中可溶性糖含量逐渐增加，进入转色期后，葡萄糖和果糖含量迅速增高。

糖渗透处理能够促进葡萄果实酚类物质的积累，从不同发育时期来比较发现，转色期诱导处理效果更明显。

蔗糖能够明显诱导 chs基因的转录和蛋白数量的积累，葡萄糖和果糖具有同样的作用，但效果不如蔗糖明显。

3、苯丙烷类代谢关键酶（ PAL、C4H、 4CL）

----活性、数量变化及 SA的影响

果实发育过程中 PAL活性和数量变化 90 kD

67 kD

果实发育过程中 C4H活性和数量变化

62 kD

果实发育过程中 4CL活性和数量变化 60 kD

果实发育过程中 PAL、 C4H、 4CL活性变化与酚酸类物质变化的相关性分析

果实发育过程中， PAL、 C4H、 4CL 均呈现两个活性高峰，且它们的变化存在着伴随性， PAL、 C4H、 4CL活性变化与总酚、总类黄酮含量及 6种对羟基苯甲酸类酚酸总含量、 5种对羟基肉桂酸类酚酸总含量和 11种酚酸总含量变化密切相关。

水杨酸激活了葡萄果实苯丙烷类代谢酶系

水杨酸温育果实圆片对苯丙烷类代谢的影响

水杨酸温育果实圆片明显提高了果实中总酚的含量

1 3

Tot

al p

heno

ls

(mg

galli

c ac

id.g

-1.F

.W)

0

5

10

15

20

CK

SA

AIP

SA+AIP

SA+Cycloheximide

SA+Actidione D

Time of preincubation / h 0 .5 1 3 5

Tota

l phe

nols

(mg

galli

c ac

id.g

-1.F

.W)

6

8

10

12

14

16

18

20 CK

SA

Time of preincubation / h

水杨酸温育果实圆片激活了苯丙氨酸解氨酶（ PAL）的活性

0 .5 1 3 5

PA

L ac

tivity

(m

ol c

inna

mic

aci

d.m

g-1.p

ro.h

-1)

6

8

10

12

14

16 CKSA

Time of preincubation / h Time after preincubation (h)

1 3P

AL

activ

ity

(m

mol

cin

nam

ic a

cid.

mg-1

.pro

.h-1

)

0

2

4

6

8

10

12

14

16

18

CKSAAIPSA+AIPSA+Cycloheximide SA+Actidione D

水杨酸温育果实圆片激活了 PAL 蛋白表达

A ： 1-9 分别为 CK 0h、 CK0.5h、 CK1h、 CK3h、 CK5h、 SA30min、 SA1h、 SA3h、 SA5hB ： 1-10 分别为 CK 1 h 、 CK 3 h 、 AIP 1 h 、 AIP 3 h 、 SA+AIP 1 h 、 SA+AIP 3 h 、 SA+ Cycloheximide 1 h 、 SA+ Cycloheximide 3 h、 SA+ Actidione D 1 h、 SA+ Actidione D 3 h.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

A B

67kD

水杨酸温育果实圆片明显提高了 C4H的活性

0 .5 1 3 5

C4H

act

ivity

(U.m

g-1

.pro

.h-1

)

50

60

70

80

90

100

110 CKSA

Incubation time / h 1 3

C

4H a

ctiv

ity

(U.m

g-1

.pro

.h-1

)0

20

40

60

80

100

120

CKSAAIPSA+AIPSA+CycloheximideSA+Actidione D

Incubation time / h

水杨酸温育果实圆片激活了 C4H 蛋白表达 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8

A ： 1-9 分别为 CK 0h、 CK0.5h、 CK1h、 CK3h、 CK5h、 SA30min、 SA1h、 SA3h、 SA5hB： 1-8分别为 AIP 1 h、 AIP 3 h、 SA+AIP 1 h、 SA+AIP 3 h、SA+ Cycloheximide 1 h 、 SA+ Cycloheximide 3 h 、 SA+ Actidione D 1 h、 SA+ Actidione D 3 h.

A B

62kD

水杨酸温育果实圆片明显提高了 4CL的活性

1 3

4C

L ac

tivity

(U.m

g-1

.pro

.h-1

)0

20

40

60

80

100


Incubation time / h0 .5 1 3 5

4C

L ac

tivity

(U.m

g-1

.pro

.h-1

)

45

50

55

60

65

70

75

80CK

SA

Incubation time / h

水杨酸温育果实圆片激活了 4CL 蛋白表达

1 2 3 4 5 6 7 8 9 1 2 3 4 5 6 7 8

60 kD

A ： 1-9 分别为 CK 0h、 CK0.5h、 CK1h、 CK3h、 CK5h、 SA30min、 SA1h、 SA3h、 SA5hB ： 1-8 分别为 AIP 1 h 、 AIP 3 h 、 A+AIP 1 h 、 SA+AIP 3 h 、 SA+ cycloheximide 1 h 、 SA+ Cycloheximide 3 h 、 SA+ Actidione D 1 h、 SA+ Actidione D 3 h.

A B

水杨酸采后渗透完整果实对苯丙烷类代谢的影响

SA 采后渗透完整果实明显提高了总酚的含量

0 8 16 24 32 40 48

Tot

al p

heno

ls(m

g ga

llic

acid

.g-1

.F.W

)

10

15

20

25

30

35

40

45


SA 采后渗透完整果实明显提高了果实中 11种酚酸的总含量

0 8 16 24 32 40 48

Co

nte

nts

(g.

g-1.F

.W)

150

200

250

300

350

400

450


SA 采后渗透完整果实明显提高了 PAL、 C4H、 4CL的活性

0 8 16 24 32 40 48

PA

L a

ctiv

ity

(m

ol c

innam

ic a

cid.m

g-1.p

ro.h

-1)

0

1

2

3

4

5


0 8 16 24 32 40 48

C

4H

act

ivity

(U.m

g-1.p

ro.h

-1)

2

4

6

8

10

12

14


0 8 16 24 32 40 48

4

CL

act

ivity

(U.m

g-1.p

ro.h

-1)

4

6

8

10

12

14

16

18

20


PAL C4H

4CL

SA 采后渗透完整果实激活了 PAL、 C4H、 4CL酶蛋白的表达

1-9 分别为 CK 0 h 、 CK16 h 、 AIP 16 h 、 SA+AIP 16 h 、 SA+ Cycloheximide 16 h、 SA+ Actidione D 16 h、 SA 16h、 SA 24 h、SA 32 h PAL Western blotting 结

果

67 kD

1 2 3 4 5 6 7 8 9

C4H Western blotting 结果

1 2 3 4 5 6 7 8 9

62 kD

1-9 分别为 CK 0 h 、 CK 24 h 、 AIP 24 h 、 SA+AIP 24 h 、 SA+ Cycloheximide 24 h 、 SA+ Actidione D 24 h 、 SA16h、 SA 24 h、 SA 32 h

4CL Western blotting 结果

1 2 3 4 5 6 7 8 9

60 kD

1-9 分别为 CK 0 h 、 CK 24 h 、 AIP 24 h 、 SA+AIP 24 h 、 SA+ Cycloheximide 24 h、 SA+ Actidione D 24 h、 SA16h、 SA 24 h、SA 32 h

应用外源水杨酸（ SA）预温育葡萄果实圆片和渗透完整果实的实验体系，均证实了 SA 处理明显促进了PAL、 C4H、 4CL的活性，且三者之间的活性变化存在着伴随性。

Western blotting分析证实了 SA对 PAL、 C4H和 4CL活性的促进作用是通过增加其蛋白表达量来实现的；蛋白合成抑制剂环已亚胺和mRNA 转录抑制剂放线菌素 D 均可抵消 SA的效应。

SA 处理亦显著提高了果实中总酚、糖结合态酚酸类物质和总酚酸类物质的含量。

四、酿酒葡萄的生物逆境栽培的应用

1、贵腐酒贵腐酒是源自匈牙利的一种很珍贵的甜葡萄酒，由于它利用侵染于葡萄皮上的一种称之为“贵族霉”（贵腐霉菌， Botrytis cinerea ）的作用并经过保糖发酵酿制而成，故名“贵腐酒”。

贵腐酒的问世纯属偶然。有一年因葡萄收获得太晚了，受贵腐霉菌感染的葡萄呈半腐烂的干瘪状态。通常人们只能将其遗弃了，但有位名叫托卡依的匈牙利果农却利用它酿成了口味异乎寻常的甜酒，这就是后来的“贵腐酒”。

侵染于葡萄皮上的霉菌及酵母、细菌等各种微生物的种类很多，而“贵腐霉菌”的特殊之处在于：若侵染于尚未成熟的葡萄皮上，则会导致葡萄果实的腐烂，故果农们很讨厌它；但它若侵染于已经成熟的葡萄皮上，则会繁殖而穿透葡萄皮，促使葡萄中的水分得以挥发，使果实脱水干皱，葡萄中的糖分、有机酸等有效成分呈高度浓缩的状态。

当年的托卡依若没有半点葡萄种植和葡萄酿造的经验，他就不可能有如此与众不同的想法和实践。因此贵腐酒的诞生同世界上很多新事物的产生一样，在偶然中带有很大的必然性。

要酿造贵腐甜白酒，必须使用感染了贵腐霉菌 (Botrytis cinerea) 的白葡萄。这种微小的霉菌会进入葡萄并使葡萄失去水分，增加糖份和其他物质，葡萄也会因为贵腐霉菌的侵染而产生抗性反应，产生许多次生代谢产物和特殊的香味，而这些产物对葡萄酒的品质刚好又是起正面作用的。

贵腐霉菌的生长也需要特定的环境，比如贵腐酒的知名产区法国加隆河的苏德纳（ Sauternes）、匈牙利波多克河谷的托卡依（ Tokoji）以及德国的莱茵河流域，气候特别干燥，病原菌侵入以后一直处于潜伏状态，当果实成熟后，环境和果实的湿度增加，该霉菌快速生长，通过葡萄表面许多的小洞口，使浆果中的水份蒸发，葡萄汁被浓缩，从而导致果粒糖度增高，酸度降低，用这种果粒为原料酿造而成的葡萄酒就特别香甜和味浓。

法国贵腐甜酒的黄金产区位在 Bordeaux 南方二十多公里外的加龙河 (Garonne) 两岸，由于邻近河流的水温差距造成多雾， (来自兰德（ Landes）低地的西隆（ Ciron）溪水温较低，在巴萨克村注入到水温高的加龙河，冷热河水混合形成潮湿的雾气 ) 让附近的葡萄园很容易滋长贵腐霉。

五、非生物逆境栽培的应用紫外诱导紫外（UV）光是诱导葡萄果实产生白藜芦醇的重要条件，而白藜芦醇又是葡萄酒的重要抗氧化剂，也是防衰老、避免心血管系统发生病变的重要物质。

因此，利用不同的海拔高度和适宜的紫外线，就可以诱导葡萄果实产生较多的白藜芦醇，提高葡萄酒的质量。

干旱诱导在果实成熟期间，葡萄酒生产者都盼望天不要下雨，果实能在较干旱的逆境下产生更多的多酚类物质，以提高葡萄酒的风味和色泽。

适宜的干旱条件，有利于葡萄的次生代谢，这些在前面已经论述。

昼夜温差果实成熟期间，较大的昼夜温差有利于提高果实的含糖量，有利于花色素的形成，但是，过大的昼夜温差又不利于酸的形成，酸太低则不利于陈酿酒的培育。

生长调节剂的诱导植物的生长最重要的调节就是由植物生长调节物质所调控的，因此，利用科学的研究成果，采用人工合成的生长调节剂来调节葡萄的次生代谢，有利于花色素、多酚等葡萄酒品质构成因素的形成。

常用的生长调节剂有：水扬酸（ SA）、茉莉酸等。

谢谢！

酿酒葡萄的次生代谢 和逆境栽培管理

Documents

酿酒葡萄的次生代谢和逆境栽培管理