1

การแยกเช อจลนทรยบรสทธ และการเกบรกษา การแยกเช อบรสทธ

v เช อบรสทธ (pure culture) หมายถงเช อจลนทรยท ประกอบดวยเซลลของจลนทรยชนดเดยวกนซ งมลกษณะเหมอนกนทกประการ

Axenic culture หมายถง เช อชนดเดยวกนแตนามาจากตางท กนแลวนามาเกบรวมกน

เทคนคในการเพาะเช อใหบรสทธ (Pure culture techniques )1.ภาชนะท ใชเล ยงเช อตองไรเช อ ปลอดเช อ (Sterile)2.จะตองปองกนไมใหเกดการปนเป อน (Contamination)

การลดการปนเป อน – ถายหรอเพาะเช อในinoculation room, transfer room inoculating chamber, transfer hood, laminar flow

การถายเช อ – transfer of cultureการเพาะเช อ – inoculation, inoculateเช อท นาไปเพาะ – inoculumเทคนคการปลอดเช อ – Aseptic techniqueการถายเช อ ใช loop, needle, pipette

การแยกเช อใหบรสทธ ( Isolation of Pure Culture )

Plating method – เปนการแยกและทาใหจลนทรยแตละตวหยดการเคล อนท (immobilization) บนหรอในอาหารท ทาใหแขงดวยวน(agar) หรอ jelly 1) Streak plate (looping out ) ลาก – streak – รอยลาก การเจรญท ตดตอกน – confluent growth 2) Pour plate – serial dilution 3) Spread plate – spreader 4) Drop plate – calibrated Pasteur pipette

2

การแยกเช อบรสทธ

1. การขดเช อในจานเพาะเช อ (streak plate) เปนวธการท ใหเช อแบคทเรยท มความเขมขนมากๆ คอยๆกระจายตวออกไป หรอมความเจอจางพอท จะทาใหเซลลแตละเซลลแยกออกจากกน โดยแตละเซลลจะเจรญจนเปนโคโลนท มองเหนดวยตาเปลา

1.1 simple streakเปนการขดเช อแบบงายโดยการใช หวงเข ยเช อ (loop)

ลนไฟจนรอนแดงและท งใหเยน จากน นแตะท เช อจลนทรยท ตองการแยกใหบรสทธ โดยนามาขดบนอาหารวนแขง ลากเปนแนวกน เช อจลนทรยจะเกดการแยกของเซลลจากปรมาณหนาแนน จะเหลอนอยละจนแยกเปนโคโลนเด ยวๆ ได

Simple Streak

1.2 Cross streakการขดเช อแบบตดกน นยมใชมากในหองปฏบตการ ทาเชนเดยวกนวธ simple streak แตจะทาการขดเสนบนอาหารวนแขงตามแนวประมาณ 3-4 แนว ซ งทกคร งท ทาการขดเช อในแตละแนวตองลนไฟท loop และรอใหเยน โดยลากเช อใหตดกน (cross) กบแนวเช อท ลากผานมาแลวเลกนอย ซ งจะลากเสนจากหางไปถ จนไดโคโลนเด ยวๆแยกออกมา โดยการนาอาหารเล ยงเช อท ผานการขดเช อแลวไปบมท อณหภม เหมาะสมนาน 24-48 ชม.

3

Cross streak plate ขอแตกตางของการแยกเช อบรสทธ

2. Pour plate

ทาการเช อใหเจอจางตวอยางลงเร อย ๆ และนาไปผสมกบวนท หลอมเหลวและเยนลง (ประมาณ 50 oC) ในจานอาหารท ผานการฆ าเช อแลวเม อท งไวใหแขงและนาไปเพาะโคโลนกจะเจรญในหรอบนวน วธน นอกจากจะใชแยกเช อใหบรสทธ แลว ยงสามารถใชในการคานวณหาจานวนโดยประมาณของจลนทรยไดอกดวย

การเจอจาง 10 เทา (Ten fold serial dilution)

สารเจอจาง ทาหนาท ในการเจอจางจานวนเซลลของจลนทรยใหอย ในชวงท แหมาะสม

สารท ใชเปนสารเจอจางไดแก Nutrient Broth, 0.85 % NaCl, Peptone water เปนตน

4

วธ Pour Plate

1. เตรยมหลอดอาหาร NA ปรมาตร 15 ml ท ผานการฆ าเช อแลว2. เตรยมปเปตขนาด 1 ml ท ผานการฆ าเช อแลว3. ปเปตเช อท ผานการเจอจางอตราการเจอจาง 10-1 ปรมาตร 1.0 ml ปลอยลงในจานเพาะเช อดวยเทคนคปลอดเช อ4. เทอาหารจากหลอดอาหาร NA 15 ml ลงในจานเพาะเช อท มเช ออย แลว5. หมนจานเพาะเช อเพ อใหเช อและอาหารผสมเขากนด รอจนอาหารกลายเปนวนแขงดแลวจงคว าจานเพาะเช อ แลวนาไปบมท 35-37 oC 24-48 ช วโมง ทาซ าโดยใชเช อท ผ านการเจอจางท 10-2 แทน

Pour Plate

3. Spread plate

นาเช อท ทาใหเจอจางแลวท ความเจอจางท เหมาะสม มากระจาย (Spread) บนผวของอาหารแขง โดยใช Spreader ท ทาดวยแกว หรอโลหะ รปตว L

วธน อาจใชหาจานวนโดยประมาณของจลนทรย ไดเชนกน

ข นตอนการ Spread plate1. ปเปตตวอยางปรมาตร 0.1 มลลลตร ลงท ตาแหนงตรงกลางจานเพาะเช อ2. จมแทงแกวรปตวแอล (spreader) ในแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 95 แลวเอยง spreader ท ขอบของบกเกอรเพ อแยกแอลกอฮอลสวนเกนออก3. นาแทงแกวเกล ย spreader ท ผานการจมแอลกอฮอลไปเผาไฟจนแอลกอฮอลไหมหมด และปลอยให spreader เยน

4. นา spreader เกล ยเช อใหท วจานจานเพาะเช อ และระมดระวงไมใหมอสมผสกบขอบดานในของจานเพาะเช อ5. จม spreader ในแอลกอฮอลเขมขนรอยละ 95 และกาจดแอลกอฮอลสวนเกนโดยใหแทงแกวสมผสกบของบกเกอร นาเผาไฟจนแอลกอฮอลไหมหมด ปลอยใหเยน และนาไปเกล ยเช อแบคทเรยจานในจานเพาะเช อท เหลอ โดยข นตอนการ Spread plate 6. กลบจานเพาะเช อใหดานท มอาหารเพาะเช ออย ดานบน แลวนาไปบมท อณหภม 37 องศาเซลเซยส นาน 24-48 ช วโมง

5

Spread plateSpread Plate

Pour plate

Spread plate

4. Drop plate

นาเช อท ทาใหเจอจางแลวท ความเจอจางท เหมาะสม มาหยด (Drop) บนผวของอาหารแขง โดยใช Calibrated Pasteur pipette

วธน อาจใชหาจานวนโดยประมาณของจลนทรย ไดเชนกน

6

Calibrated Pasteur pipette

Digital pipette

Drop plate

Drop plate

7

Dilution shake culture

PDA + Tartaric acid

8

Single cell isolation

- ใชกลองจลทรรศนและ capillary pipette ท ปลายเลกมากๆ ,microprobe - ด ดจลทรยจากตวอยาง มา 1 เซลล- นาไปลางเอาส งเจอปนท มขนาดเลกกวาออก โดยการถายลงในอาหารท ผานการฆาเช อหลายๆ คร ง- จลนทรยท มขนาดเลกท ตองการใชกาลงขยายเกน 100X ตองใช Micromanipulator

micromanipulator

จดสภาพใหเหมาะสมตอการเจรญ มการเตมสารท เรงการเจรญของเช อท ตองการ

Enrichment media

Membrane filtration method

กรองตวอยางและนาแผนกรองมาเล ยงบนอาหารท เหมาะสม

9

(1)

Liquid parafilm

การเททบดวยน ามน

(2)

Bath Freezer

Lyophilizer (3)

10

Lyophilization

deep freeze

Liquid nitrogen tank

(4)

(5)

Refrigerator