بسمه تعاليجمهوري اسالمي ايران

دانشگاه علوم پزشكي و خدمات بهداشتي درماني جندي شاپور اهوازمعاونت توسعه پژوهش و فناوري

طرح تحقيقاتي پيشنهادي

پايان نامه طرح تحقيقاتي عنوانطرح :

تاثیر غلظت های مختلف آلژینات با غلظت باالی گلورونیک اسید، بر زنده ماندن و تمایزسلول های مزانشیمی استخراج شده از بند ناف انسانی به سلول های استئوبالست

تاريخ:پيشنهاد

1394/8/22

1

بخش دوم ـ اطالعات مربوط به طرح پژوهشيعنوان طرح پژوهشي:ـ 1ـ2

الف(فارسي:

تاثیر غلظت های مختلف آلژینات با غلظت باالی گلورونیک اسید، بر زنده ماندن و تمایز سلولهای مزانشیمی استخراج شده از بند ناف انسانی به سلول های استئوبالست

ب(انگليسي:

The effect of different concentrations of alginate with a high concentration of glucuronic acid on viability and differentiation of human umbilical cords - derived mesenchymal stem cell into osteoblast

ـ نوع طرح: 2ـ2 بنيادي ـ كاربردي بنيادي

كاربردي

ـ مقدمه و معرفي طرح )بيان مسئله( : 3ـ2 استخوان ها اعضای مهم سیستم اسکلتی بدن هستند که باعث حفظ شکل و تسهیل حرکت در ب>>دن

ام>>روزه آم>>ار زی>>اد(. ام>>ا 1می شوند و همچنین مواد معدنی مورد نیاز برای بدن را ف>>راهم می کن>>د) تصادفات و شکس>>تگی ه>>ای اس>>تخوانی متع>>اقب آن یکی از عوام>>ل مهم در بوج>>ود آم>>دن مش>>کالت عملکردی و روانی متعدد برای افراد حادثه دیده می باشد. اگر چه ق>>درت ب>>االی ب>>افت اس>>تخوان در امر ترمیم و برخی درمان های ارتوپدی در بسیاری از موارد توانسته است مش>>کالت این اف>>راد را ت>>ا حدود زیادی بر طرف نماید اما گاهاً شکستگی و خردشدگی استخوان به گونه ای است ک>>ه ض>>رورت

.5-10(. نزدی>>ک ب>>ه 2تامین یک منبع بافت اس>>تخوانی ج>>ایگزین جهت ت>>رمیم را ض>>روری می س>>ازد) (. برای بهب>>ود شکس>>تگی ه>>ا3درصد شکستگی ها سریع بهبود نمی یابند ونیاز به درمان بیشتر دارند)

چند فاکتور شرکت دارند که اگر این فاکتورها از بین بروند در پروسه بهبودی وقفه ایجاد شده و عدم :1 اتفاق می ا فتد .این فاکتورها شامل - یا به اصطالح دیگر)نان یونیون (ستخوان اجوش خوردگی

سلول ه>>ای بنی>>ادی موج>>ود در ب>>افت اس>>تخوانی ک>>ه ب>>ه این2فاکتورهای القا کننده استئوبالست - آنج>>ا(. از 4داربست برای حمایت سلول وچسبیدن وتم>>ایز آن اس>>ت )3سیگنال ها پاسخ می دهند -

درمان بیماری های اسکلتی عضالنی برای مریضان هزینه های زیادی دارد که ( به عنوان مثال درکه (. از این رو مهندسی بافت پیشنهاد خوبی برای این5دالر هزینه دارد ) )میلیون 200آمریکا بیش ازافراد میباشد .

مهندسی بافت رشته ای با توانایی طراحی و ساخت بافت یا ارگان یا بازگرداندن عملک>>رد آن عض>>و(7-6می باشد )

)بیوراکتور ، محلول ، تحریک مکانیکی( به عنوان س>>هالقایی سه عامل داربست، سلول و فاکتورهای (8ضلع اصلی مهندسی بافت شناخته شده اند )

داربست ها ساختارهای سه بعدی برای حمایت و هدایت رش>>د ،ش>>کل دهی وکلون>>یزه ک>>ردن س>>لول هستند. از طرفی وسیله ای ب>>رای تم>>ایز س>>لول ه>>ا و س>>یگنال ه>>ایی فیزیولوژی>>ک ب>>رای پیش>>رفت و توسعه بافت می باشند .بنابراین داربست ساختار و عملکرد بیوشیمیایی ماتریکس خارج سلولی را تا زمانی که سلول ها توانایی تولید ماتریکس خارج سلولی را برای خودشان دارند شکل می دهد . می دانیم که ماتریکس خارج سلولی یک بستر با مولکول های فعال زیستی را ک>>ه پروس>>ه ه>>ای س>>لولی مانند چسبندگی، تمایز ؛مهاجرت ،تکثیروزنده ماندن سلول وحمایت آن ه>>ا را کن>>ترل می کن>>د ف>>راهم

(. اخیرا استراتژی های بکار گرفته شده برای مهندسی بافت بسته به مواد اس>>تفاده(>> 12-9می کند (. داربس>>ت ه>>اي م>>ورد اس>>تفاده14-13شده در ساختمان داربست و نوع بافت متفاوت می باشد )

ممکن است مصنوعی یا طبیعی باشد. موفقیت داربست ها در مهندسی بافت وابسته به ع>>واملی از قبیل انتقال مناسب گازها ،مواد غذایی ،پروتئین ها و مواد زائد آن ه>>ا ب>>ه درون و ی>>ا خ>>ارج داربس>>ت

انتش>ار ی>ک مولک>ول وابس>ته ب>ه دو چ>یز اس>ت ،م>واد می باشد. در یک داربست نس>بت و مس>افت ( . اخیراً در مهندسی ب>>افت آلژین>>ات م>>ورد توج>>ه محققین ق>>رار15داربست و خصوصیات مولکولی)

2

گرفته است .آلژینات یک پلی ساکارید طبیعی است ک>>ه اولین ب>>ار از ن>>وعي جلب>>ک دری>>ایی قه>>وه ای استخراج شد . آلژینات به صورت ترکیبی خطی از مونومرهایی شامل مانورونیک اس>>ید و گلورونی>>ک اسید می باشد و این مونومرها مرتبا در آلژینات تکرار می شوند و مقدار آنها بسته به مک>>ان و س>>ن

مونومره>>اجلبکي می باش>>د ک>>ه از آن گرفت>>ه می ش>>وند.ت>>رکیب، مق>>دار،وزن مولک>>ولی و ت>>والی فیزیکی آن را مشخص می کند و ویسکوزیتی آلژینات وابسته به وزن مولک>>ولی م>>واد آنخصوصیات

می باشد. و حالت ژالتینی آن زمانی که بایک یون دارای دوبار مثبت مانند کلسیم ،ب>>اریم،استرانس>>یم ( . که17( آلژینات دارای چند خصوصیت منحصر به فرد می باشد )16واکنش دهد اتفاق می افتد .)

شامل:

یک محیط آبی نسبتا بی اثر در ماتریکس .1انکپسوله کردن آن در دمای اتاق بدون نیاز به حالل های آبی.2تخلخل باالی ژل که اجازه عبور و انتشار مولکول های درشت را می دهد .3توانایی کنترل منافذ آن با یک پوشش ساده .4انتقال وتجزیه بیولوژیکی در شرایط طبیعی فیزیولوژیک .5

دالت>>ون1600 با وزن مولکولی کمتر از B12برای مثال مولکول هایی مثل گلوکز ،اکسیژن وویتامین به راحتی از بیدهای کروی آلژینات عب>>ور می کنن>>د ام>>ا مولک>>ول ه>>ای ب>>ا وزن مولک>>ولی بیش>>تر مث>>ل آلبومین، میوگلوبین وفیبرینوژن عبور نمی کنند .چگالی اتصاالت و خصوصیات فیزیکی و سایز منا فذ

ی آلژین>>ات و وزن مولک>>ولی زنج>>یره ه>>ایمونومرهاژل می توانند به آس>>انی بوس>>یله تف>>اوت غلظت (. اما بعد از انتخاب داربس>>ت مناس>>ب عام>>ل دوم در م>>وفقیت مهندس>>ی16پلیمری تغییر داده شود)

ب>>افت منب>>ع س>>لولی مناس>>ب می باش>>د س>>لول ه>>ای بنی>>ادی س>>لول ه>>ایی ب>>ا دو خاص>>یت واض>>ح به طور کلی سلولهای بنی>>ادی دارای دو منش>>اء(.>> 18وروشن ،یعنی خود ترمیمی وقدرت تمایز بوده)

(. براساس توان تمایزی و برگشت پذیری آن ها،19( هستند )Adult و بزرگساالن)Embryonicجنینی))سلول ها را می توان به انواع ذیل تقسیم نمود:

( اين سلولها داراي اس>>تعداد نامح>>دود هس>>تند و توان>>ايي تب>>ديل ش>>دن ب>>هTotipotentالف- همه توان) سلولهاي سازنده پرده هاي جنيني و تمام انواع س>>لولهاي موج>>ود در ب>>دن و همچ>>نين توان>>ايي تب>>ديل

شدن به سلولي مثل خود را دارند : مانند سلولهاي بنيادي جنيني اوليه.

( اين سلولها توانايي تبديل شدن به همه بافتهاي يك موجود زنده بجزPluripotentب- پرتوان) تشکیالت مربوط به جفت و بافت های خارج رویانی را دارند : مانند سلولهاي توده سلولي داخلي

.جنين در مرحله بالستوسیست ( اين سلولها قابل تبديل و تكامل به گروهي از انواع سلولها هستنند كهMultipotent ج-چند توان )

داراي عملكرد مشابه باشند، مثل سلولهاي بنيادي خونساز. به اين دسته از سلولهاي بنيادي،( .20سلولهاي بنيادي بالغين نيز گفته مي شود زيرا در انسان يا جانور پس از تولد نيز وجود دارد)

سلولهای بنیادی مزانشیمی بدلیل دسترسی اسانتر به منبع سلولی، تکثیر سلولی فراوان، انتخاب مناسب تری می باشد. سلولهاي بنيادي مزانشيمي را می توان از چندین منبع تهيه كرد از

جمله: مغز استخوان، پريوستئوم ، استخوان ترابكوال، بافت چربي، سينوويوم، ماهيچه اسكلتي،دندانهاي شيري، پانكراس، ر يه ، كبد رويان ، مايع آمنيوتيك ، خون بندناف و ژله وارتون بند ناف .

از میان موارد فوق الذکر سلولهای بنی>>ادی مزانش>>یمی بن>>د ن>>اف ب>>دلیل وی>>ژگی ه>>ای زیرانتخ>>اب . ج>>دا3. دسترسی اسانتر به منبع س>>لولی 2. عدم وجود مشکالت اخالقی 1مناسب تری می باشد.

كردن سلولها ي بنيادي ازدیگر منابع مانند مغز استخوان، يك عمل تهاجمي و درد آور بوده و تع>>داد و . توانايي تمايزي سلولها ي بني>>ادي بن>>د ن>>اف4توانايي تمايزي آنها با افزايش سن نیز كاهش مي يابد

3

. استروماي بند ناف داراي سلولهايي با توانایي تكثير ب>>اال5بيشتر از سلولهاي مزانشيمي دیگر است (.21-22و خطر آلودگي ويروسي پايين است )

.غش>>ای1 ناحیه می باشد: 3( شامل 10 سانتی متر )60-65گرم و طول 40 بند ناف با وزن تقریبی شریان و یک ورید(. استروما نیز خود ب>>ه2. عروق خونی)3. استروما )بنام ژله وارتون( و2امنیوتیک

. پ>>ری واس>>کوالر تقس>>یم3.اینترواس>>کوالر و 2. ساب امنیوتیک 1 ناحیه هیستولوژیک شامل نواحی 3 می گردد. ناحیه ساب امنیوتیک درست در زیر پرده امنیون قرار گرفته است و ناحیه پ>>ری واس>>کوالر

(23و اینترواسکوالر به بافت همبند اطراف عروق و بین عروقی اطالق می گردد) سلول های بنی>>ادی س>لول ه>>ایی بس>یار حس>>اس نس>>بت ب>>ه مح>>رک ه>>ای محیطی اط>راف همچ>>ون سیگنال های خارجی ،ماتریکس خ>>ارج س>>لولی و محی>>ط کش>>ت هس>>تند و همین ب>>اعث می ش>>ود ب>>ه

(. سلول های مزانشیمی ژله وارتون می توانن>>د این>>ترلوکین ه>>ا و24سمت تمایز یا ترمیم پیش روند) بسیاری از فاکتور های رشد را آزاد کنند، لذا برای دور ماندن این سلول ها از دستگاه ایم>>نی میزب>>ان می توان آنها را با انکپسوله کردن در بی>دهای آلژین>ات ک>ه دارای ی>ک کپس>ول نیم>>ه ت>>راوا و انتخ>ابی هستند محافظت کرد. پروسه انکپسوله کردن توانایی نگهداری و حفظ حیات سلول ها و کارایی آنه>>ا

( . از آنجایی که میزان ب>>االی25را به مدت طوالنی تری نسبت به کشت دو بعدی افزایش می دهد) مونومر گلورونیک اسید در آلژینات سبب استحکام بیشتر بیدها شده و همچنین نگه داری بیشتر یون های کلسیم ب در ساختار بیدها میشود و از طرفی فاکتور غلظت آلژینات نس>بت ب>>ه دیگ>>ر متغییره>>ا

لذا در این تحقیق سعی ب>>رمثل وزن مولکولی از اهمیت بیشتری در ساختار آلژینات برخوردار است % از8/1% و 2/1آن اس>>ت ت>>ا ب>>ا کش>>ت س>>لول ه>>ای مزانش>>یمی بن>>د ن>>اف در دو غلظت متف>>اوت

آلژینات قدرت زنده ماندن و تمایز آنها به استئوبالست مورد مقایسه قرار گیرد. با امی>>د ب>>ه اینک>>ه در صورت مشاهده نتایج مطلوب، در آینده از این روش جهت درمان شکس>تگی ه>ای غ>یر قاب>>ل ت>رمیم

استفاده شود.

4

در صورت نياز می توانید از صفحات )Literature Reviewـ بررسي متون 4ـ2( : اضافي استفاده نمایید

Marita در سلول های مزانشیمی جنین انسانی با انکپسوله کردن 2014 و همکارانش در سال % و بیدهای ترکیب شده با آانزیم آلکالین فسفاتاز و مقایسه آن ها نشان دادند که2بیدهای آلژینات

هردو مانند ماتریکس خارج سلولی عمل کرده و باعث افزایش تمایز سلول ها به سمت سلول استخوانی می شوند و مواد معدنی تولید می کنند نسبت به داربست دو بعدی اما بیدهای ترکیب

(.26شده با آلکالین فسفاتاز دارای توانایی بیشتری برای تولید مواد معدنی هستند)

Helen سلول های مزانشیمی استخراج شده از چربی انسانی با2014 و همکارانش در سال % با غلظت باالی گلورونیک اسید2استفاده از لیپوساکشن چربی شکم وانکپسوله کردن در آلژینات

در ترکیب با تیتانیوم دی اکسید و سیمووستاتین نشان دادند که در داربست هایی که دارای سیمووستاتین بوده درمقایسه با داربست هایی که بدون این ماده بودند از طریق اندازه گیری ژن های استخوانی وفاکتور رشد اندوتلیال و انجام تست آلکالین فسفاتاز نشان داد که دارای بیان ژن

(. 27بیشتری بوده وهمچنین تمایز به سمت سلول های استخوان ساز بیشتر بوده)

Xiaoning در مطالعه ای سلول های مزانشیمی استخراج شده از مغز2014 و همکارانش در سال % قرار دادند وبه منظور1استخوان ران و تیبا موش ئر داربستی از جنس کیتوسان وآلزینات

نشان دادند که این داربست هیچ گونهBMP-2مشاهده تاثیر این داربست بر روی آزاد سازی سمیتی برای سلول ها ندارد وسبب حفظ حیات سلول ها می شود و همچنین سبب افزایش تمایز

(.28سلول ها به سمت سلول های استخوا ن ساز می شود )

Moshaverinia سلول های بنیادی لیگامان اطراف دندانی وسلول های2014وهمکارانش در سال % در ترکیب با گالیسین آسپارات اسید1مزانشیمی اطراف لثه را در داربستی از جنس آلژینات

تری پپتید قرار دادند و پس از پیوند آن به موش هایی که دارای نقص استخوان جمجمه بودند نتایج حاصله نشان داد که حیات سلول ها به خوبی حفظ شده و سلول ها به سمت سلول استخوان ساز

(.29تمایز پیدا کرده اند و بهبودی حاصل شده )

Moshaverinia در مطالعه ای دیگر سلول های مزانشیمی گرفته2014و همکارانش در سال وترکیب شده با آلژینات با غلظتBM-2شده از مغز استخوان زنان بالغ وترکیب آن ها با آنتی بادی

باالی گلورونیک اسید نشان دادند هم در محیط آزمایشگاهی وهم پیوند آن ها به موش هایی که دارای نقص جمجه بودند که در اثر اتصال این آنتی بادی با گیرنده خود بر روی سلول مزانشیمی

باعث تمایز بیشتر سلول ها به سمت سلول استخوان ساز شده و بهبودی نقص جمجمه می شود)30)

Hashemibeini با انکپسوله کردن سلول های مزانشیمی گرفته شده از2013 و همکارانش در سال % و تمایز به سلول های استئوبالست و انتقال ان به سگ1.2چربی شانه و گردن سگ در آلژینات

هفته بهبود یافته و ترمیم8هایی که دارای نقص استخوان تیبیا بوده نشان دادند که در آن ها بعدار (.31شده است)

Chen با انکپسوله کردن سلول های مزانشیمی بند ناف در آلژینات2012 و همکارانش در سال % و قرار دادن آن ها در پنج گروه مختلف از سیمان کلسیم فسفات در ترکیب با فیبرونکتین و1

آرژنین گالیسن آسپارات نشان دادند که در گروه ترکیبی سیمان کلسیم فسفات با آرژنین گالیسین آسپارات تراکم سلولی چهار برابر گروه کنترل بوده و همچنین میزان تمایز به سلول استئو بالست و

(.32بروز ژن های استخوان و شدت معدنی شدن سلول ها دوبرابر گروه کنترل بود)

5

Tangباانکپسوله کردن سلول های مزانشیمی جنین انسانی در الژینات2012و همکارانش در سال روز نشان دادن که سلول ها در این21%و قرار دادن آن در سیمان کلسیم فسفات به مدت 1.2

مدت بقای خود را حفظ کرده و نشان دادند که می توانند در این داربست به استخوان تمایز یافته و مواد معدنی استخوان تولید کنند و بیان ژن های استئو کلسین و آلکالین فسفاتاز مربوط به استخوان

21 برابر افزایش داشته و فعالیت الکالین فسفاتاز در روز 100و10 به ترتیب 21و14در روزهای (. 33هفت برابر بود )

Alireza moshaverinia توانایی تمایز به سلول استخوان و سلول2012 و همکارانش در سال چربی را در سلول های بنیادی گرفته شده از لیگامنت پریودنتال و سلول های بنیادی گرفته شده از

% سنجیده و نشان دادند که انکپسوله کردن نمی تواند تاثیری1لثه را با انکپسوله کردن در آلزینات (.34بر خصوصیات سلول های بنیادی داشته باشد )

Baek-Hee Lee تاثیر ساختار ژل آلژینات را برروی تکثیر وتمایز 2011 و همکارانش در سال MC3T3-E1 به کار برده شد و2%و1 بررسی کردند. به این ترتیب که محلول سدیم الژینات با دو غلظت %

میلی200و100 با غلظتهای CaCl2برای تولید دانه های الژینات محلول سدیم الژینات در دو محلول %و1مول مورد استفاده قرار گرفت. نتایج نشان داد که میزان تکثیر سلولی در الژینات باغلظت

%ومحلول2میلی مول بیشتر و به عکس تمایزدر الژینات باغلظت 100 با غلظت CaCl2محلول CaCl2 35میلی مول بیشتربود )200 با غلظت.(

Metchichit با انکپسوله کردن سلول های بنیادی جنین انسانی در دو2010 و همکارانش در سال % همراه با فیبروبالست جنین انسانی را با هم2/2%و آلژینات باریم 1/1نوع آلژینات کلسیم

مقایسه کردند و نشان دادندکه حیات سلول ها به خوبی نگه داری نمی شود و در مقابل آن سلول % همرا با فیبرو بالست جنین انسانی حیات خوبی دارند1/1های انکپسوله شده در آلژینات کلسیم

(.36وا نتشار مواد غذایی فاکتورهای رشد بیشتر است نسبت به آلژینات باریم )

Wang با انکپسوله کردن سلول های بنیادی جنینی نشان دادند که2009 و همکارانش در سال (.37% توانایی حیات بهتری دارند )2% نسبت به آلژینات کلسیم 1سلول ها در آلژینات کلسیم

Purcell با انکپسوله کردن سلول های بنیادی عصبی در آلژینات با2009 و همکارانش در سال غلظت باالی گلوکورونیک اسید فعالیت ترشحی فاکتورهای نوروتوروفینی بهبود می یابد و بالعكس

(.38پایداری کپسول در غلظت باالی مانومریک اسید کاهش می یابد )

Sanai سلول های استخوانی بر روی دو محیط کشت تک الیه ایی وسه2008وهمکارانش در سال بعدی )آلژینات( کشت داده شد آن ها دریافتند که ژل آلزینات شرایط بهتری را جهت کشت

( .39استئوبالست ها فراهم می آورد )

Abbah نشان دادند که کندروسیت های پستانداران و سلول های2008 و همکارانش در سال دیسک بین مهرهای توانایی حیات و سرعت تمایز باالتر و تولید باالی گلیکوزآمینوگلیکان سولفات

(.40باالتری دارند زمانی که در آلژینات کلسیم انکپسوله شده اند نسبت به آلژینات باریم )

norhayati siti سلول های بنیادی جنین انسانی را در آلزینات کلسیم2008 و همکارانش در سال روز بدون تمایز نگه داری و تکثیر دهند و به260% انکپسوله کرده و توانستند آن ها را به مدت 1/1

6

منظور نشان دادن حفظ خاصیت پلوری پوتنت بودن آن ها به مشتقات مزودرمی و آندودرمی و( .41اکتودرمی تمایز دادند )

Abbah با کشت سلول های بنیادی بافت چربی در آلژینات و تمایز آن2006 و همکارانش در سال به استئوبالست نشان دادند که محیط این ژل ،تکثیر و بقای استئوبالست را تسهیل می کند این

نیز سلول های بنیادی حاصل از مغز استخوان2008محقق و همکارانش در تحقیقی دیگر در سال را در ژل آلژینات کشت دادند و آنها را به استئوبالست تمایز دادند و نتایج تحقیقات قبلی را در مورد

(.43( و )42ژل آلژینات تایید کردند )

Liao برایآلژینات سلول های استئو بالست کشت داده شده بر روی 2005 و همکارانش در سال ترمیم نقص استخوان کرانیال خرگوش استفاده کردند و مشاهده گردید که این ژل داربست مفیدی

(.44در ترمیم نقص می باشد )

Asberg سلول های استئوبالست نمونه حیوانی را بر روی ژل آلژینات2003 و همکارانش در سال کشت دادند و میزان کارایی ان در ترمیم استخوان را ارزیابی نمودند این گروه مشاهده نمودند که

(.45ژل آلزینات در زمینه ی ترمیم نقش بسزایی دارد )

Stabler با انکپسوله کردن سلول های شبه انسولینی بتا تری مورین در2001 و همکارانش در سال آلژینات با غلظت باالی گلوکورونیک اسید نشان دادند که این غلظت مانع رشد وکاهش متابولیسم و

(.46فعالیت ترشحی سلول می شود )

Dembczynski در تحقیقی نشان دادند که تغییر در غلظت آلژینات بر2001 و هکارانش در سال (.47نفوذپذیری غشا کپسول تاثیر دارد که هرچه غلظت افزایش یابد سایز منافذکاهش می یابد )

Majmudar موفق به کشت استئوبالست های مشتق شده از کالواریای1991 و همکارانش در سال (.48 ماه گزارش شد )8جنین مرغ در آلژینات شده و مدت زنده ماندن این سلول ها

7

( OBJECTIVES & HYPOTHESISـ اهداف و فرضيات )5ـ2( General Objective- هدف اصلي طرح )2-5-1

تاثیر غلظت های مختلف آلژینات با غلظت باالی گلورونیک اسید، بر زنده ماندن و تمایز سلول هایمزانشیمی استخراج شده از ژله وارتون بند ناف انسانی به سلول های استئوبالست

(Specific Objectives- اهداف ويژه طرح )2-5-2

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر زنده بودن سلول های استخراج شده2/1 اثر غلظتتعیین % از ژله وارتون بند ناف

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر زنده بودن سلول های مزانشیمی8/1 اثر غلظت تعیین % استخراج شده از ژله وارتون بند ناف

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر تمايز سلول های استخراج شده از2/1 اثر غلظتتعیین % ژله وارتون بند ناف به سلول هاي استئوبالست

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر تمايز سلول های مزانشیمی8/1 اثر غلظت تعیین % استخراج شده از ژله وارتون بند ناف به سلول هاي استئوبالست

- اهداف كاربردي2-5-3 با توجه به استفاده زیاد از آلژینات به عنوان یک داربست سه بعدی در مهندسی بافت واکثر فعالیت های پژوهشی در این تحقیق سعی شده است تا با فراهم آوردن یک محیط کشت مناسب برای زنده مانده و

تمايز سلول های مزانشیمی گامی درجهت پیشبرد وکمک به سایر محققین در انتخاب داربست مناسب برايتمايز سلول هاي مزانشيمي بند ناف به سلول هاي استخواني برداشته شود.

- فرضيات يا سؤاالت پژوهش2-5-4

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر زنده بودن سلول های استخراج شده از ژله2/1غلظت % چقدر است؟وارتون بند ناف

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر زنده بودن سلول های مزانشیمی استخراج8/1غلظت % چقدر است؟شده از ژله وارتون بند ناف

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر تمايز سلول های استخراج شده از ژله وارتون2/1غلظت % چقدر است؟بند ناف به سلول هاي استئوبالست

گلورونیک اسید سدیم آلژینات بر تمايز سلول های مزانشیمی استخراج شده از8/1غلظت % چقدر است؟ژله وارتون بند ناف به سلول هاي استئوبالست

8

ـ روش اجراي طرح و انتخاب نمونه 6ـ2

- نوع مطالعه: 2-6-1اپيدميولوژيك تحليليپايه*

كيفياپيدميولوژيك توصيفيتوليديکار آزمایی باليني

مبتني بر اطالعات بيمارستاني و(تجربی) آزمایشگاهی*درمانگاهي

مداخله ای ) نیمه تجربی (

- خالصه روش اجراي طرح و تکنیک های مورد استفاده:2-6-2 ابتدا بند نافها را طبق ضوابط واصول اخالقی و رضایت از مادرانی که تازه زایمان کرده اند جمع

با گلوکز پایین شاملDMEMآوری کرده و تحت شرایط استریل فورا در محیط کشت حاوی 100U/mL ، 100 پنی سلینmg/mL ، 0.25 استرپتومایسینmg/mL درجه4 آمفوتریپسین بتا در دمای

سانتی گراد به محیط آزمایشگاه منتقل و در زیر هود المینار تحت شرایط استریل قرار داده و قبل همراه با آنتی بیوتیک آنها را چندین بار شستشو دادهPBSاز اینکه آنها را تکه تکه کنیم با محلول

تکه تکه کرده و عروق خونی و غشا آمینیون دور آن را جدا4cm-2سپس بند ناف را به قطعات است دوباره به قطعات مزانشیمی سازی کرده و باقی مانده آنرا که همان ژله وارتون حاوی سلول

25cm² شسته و در فالسکهایی به ابعاد PBS تکه تکه کرده و سه بار با 5mm-3کوچکتری در اندازه ال2mM با گلوکز پایین با DMEMقرار داده می شوند. سپس محیط کشت کامل شامل ترکیبی از

پنی سلین/ استرپتومایسین را اضافه نموده و آنها را در100U و FBS% 10گلوتامین همراه با نگه داری کرده و هر دو تا سه روز محیط کشت را تعویض نموده تاCO2%5درجه و 37آنکوباتور

سلولها تکثیر شده و آماده برای انکپسوله شدن شوند. حل نموده و در دمایNaCl برای تهیه محلول آلژینات غلظت های مختلف آن را در آب مقطر حاوی

حرارت داده و پس از سرد شدن، به کمک فیلترهای سرنگی استریل و در ادامه با سلول درجه 60 اضافه کرده تا بیدها تشکیلCaCl2ها ترکیب نموده و با استفاده از سرنگ به محلول پلیمریزه کننده

شستشو می دهیم.PBSشوند سپس بیدهای حاوی سلول را با جهت ارزیابی میزان زنده بودن سلول های کپسوله در غلضت های مختلف آلژینات ، آن ها را-1

درصد سرم کشت داده و سپس از رنگ10 حاوی DMEMبه مدت دو هفته در محیط کشت استفاده و نتایج با میکروسکوپ فلورسنت ثبت و مقایسه می شود. Live/dead assayامیزی

p=N L

N L+N D

N Lتعداد سلولهای زنده: N Dتعداد سلولهای مرده :

جهت تمایز به سلول های استخوان ساز، سلول های کپسوله شده در غلضت های مختلف-2 روز(21آلژینات، را در معرض محیط تمایزی استخوان ساز قرار داده و در پایان دوره تمایز)

جهت وجود تشخیص ماتریکس معدنی استفاده alizarin red s وvan kossaرنگ آمیزی های می شود.

9

شستشو داده وPBS بیدهای آلژینات به زیر هود انتقال داده دوبار باvan kossa*در رنگ آمیزی با انجام مراحل آبگیری وقالب گیری وتهیه مقاطع الم ها با استفاده از رنگ مورد نظر رنگ آمیزی

می شود .

% فیکس شده سپس با رنگ مورد10 ابتدا بیدها توسط فرمالدهید alizarin red s*در رنگ آمیزی نظر رنگ آمیزی انجام شده ودر نهایت مکان های غنی از رسوب کلسیم به رنگ قرمز دیده میشوند.

ابتدا سلول های کپسولهALP assayبرای ارزیابی تمایز استئوبالست ها با استفاده از کیت -3 شده با استفاده از سیترات سدیم دکپسوله شده وطبق دستور شرکت سازنده از این ماده

ردد. استفاده شده ونتایج با میکروسکوپ فلورسنت بررسی می گ

- روش محاسبه اندازه نمونه و نحوه نمونه گيري:2-6-3هر آزمایش سه بار تکرار می شود

- روش های آماري تجزيه و تحليل نتايج:2-6-4

وchi-square و repeated measure anova و ANOVAمحاسبات اماری با ازمون های اماری انجام می گیرد.0.05 با سطح معنی دارکمتر از SPSSتوسط نرم افزار

10

- جدول متغيرها:2-6-5

مشخصاتمتغير

مستقل

وابسته

كيفيكميمقياتعريف عملي

س پيوسته

گسست رتبهاسميه

اي نوعی داربست**آلژینات

از جنس پلیساکارید

درصد

زنده بودنسلول ها

رنگ سبز**) سلول زنده(

رنگ قرمز) سلول

مرده(

درصد

تمایز سلول ها به

استئوبالست

وجود رسوبات** کلسیم در فضای بین

سلولی

شدت رنگ

پذیری

-2-211-14-7-0**روز3…

11

ـ مالحظات اخالقي : )فرم رضایت نامه در صورت لزوم ضمیمه7ـ2گردد(

)لطفاً پس از تكميل سطرهايـ زمان الزم براي اجراي كامل طرح : 8ـ2اضافي را حذف كنيد(

فدي

ر مدت

)ماه)

12345678910

11

12

13

14

15

16

17

18

19

20

21

22

23

24

تکمیل پروپوزال1

داوری پروپوزال2

تهیه مواد3

استخراج سلول از4بند ناف

5 ازمون های زنده بودن و تمایز به

استخوان

تجزیه و تحلیل6اماری نتایج

نوشتن مقاله7

8 نوشتن و

تکمیل پایاننامه

12

بخش سوم ـ اطالعات مربوط به هزينه هاي انجام طرح

ـ آيا براي اين طرح از سازمان های ديگر درخواست اعتبار شده1ـ3 بلي خير است؟

در صورت مثبت بودن جواب لطفاً نام سازمان و نتيجه حاصل را ذكر فرمایید.

ـ هزينه پرسنلي با ذكر مشخصات كامل هر نوع فعاليت و حق الزحمه2ـ3آن ها :

رديف

نام و نام مرتبهنوع فعاليتخانوادگی

علمي تعدادافراد

ساعات موردنياز

حق الزحمهجمع ) ريال (در ساعت

جمع هزينه هاي پرسنلي

) تمام آزمایشات باید در پردیس ـ هزينه آزمایش ها و خدمات تخصصي:3ـ3دانشگاهی انجام گیرد(

موضوع آزمايش ياخدمات تخصصي

مركز سرويسدهنده

تعداد كل

دفعات

هزينه برايجمع )ريال(هر دفعه

جمع هزينه هاي آزمایش ها و خدمات تخصصي

13

مصرفي الزم براي اجراي اين طرح كهغیرـ فهرست مواد و وسايل 4ـ3بايد خريداري شود: معاونت توسعه مديريت و منابع از معاونت توسعه مديريت و منابع از19/3/9419/3/94 مورخ مورخ 1/4/81/4/8/د//د/386386)به استناد نامه شماره )به استناد نامه شماره

فرم پروپوزال حذف گرديد(فرم پروپوزال حذف گرديد(

ـ فهرست مواد و وسايل مصرفي الزم براي اجراي اين طرح كه بايد5ـ3خريداري شود:

)لطفاً پس از تكميل سطرهاي اضافي را حذف كنيد(

فدي

ر

Orangeپیپت پاستور1بهساما

ن380000380000بسته1بله

خانه24ظرف كشت 2Orange

بهسامان

300003000000عدد 100بله

6000600000عدد100بله15فالکن 37000700000عدد100بله50فالکن 4

1000سر سمپلر 55000001000000بسته2بلهمیکرولیتری

100سرسمپلر 65000001000000بسته2بلهمیکرولیتری

350003500000عدد100بله./2فیلتر سرنگی 7

18000180000بسته10بلهدستکش التکس8

9Tissue Flask T-25Falcon280002800000عدد100بله

10000100000بسته10بلهدستکش پالستیکی10

11Tissue plate 6 wellFalcon50500002500000بله

12Live/dead assay kitinvitrogen35000003500000کیت1بلهآمریکا

13DMEM

Sigma10بله lit8000008000000

14

14Alginate HGNova matrix900000018000000گرم2بله

15Penicillin10000001000000 گرم10بلهامریکابهسامان

16CaCl2250بلهامریکابهسامان گرم

200005000000

17FBSSigma40000008000000دو ویالبلهامریکا

18Streptomycin Sulfate

40000004000000یک ویالبلهامریکابهسامان

19Dimethylsulfoxide20000004000000 ویال2بلهامریکابهسامان

20 500بلهامریکاSigmaتریپسین ا.د.ت.آ

میلیلیتر

35000003500000

21L ascorbic acidsigma100آمریکاگرم

40000004000000

بتا گلیسرول22فسفات

sigma50000005000000آمریکا

23

بستهآمریکاsigmaدگزا متازون10

میلی0گرمی

80000008000000

24Van kosa stainsigmaبستهآمریکا گرمی25

40000004000000

25Alizarin red s stain

sigmaبستهآمریکا گرمی25

40000004000000

26formaldeydesigma2.5آمریکالیتر

28000002800000

27paraformaldehydesigma1آمریکاکیلوگرم

12000001200000

99760000جمع هزينه هاي وسايل :

15

ـ هزينه مسافرت )در صورت لزوم(:6ـ3 تعداد و هدف از مسافرت درمقصد

مدت اجراي طرح نوع وسيله

نقليه تعدادمبلغ ) ريال (افراد

جمع هزينه هاي مسافرتـ هزينه تايپ و تكثير:7ـ3

تايپ ، تكثير و صحافي گزارش نهايي1) ريال (

تايپ و تكثير پرسشنامه ) در صورت2وجود ( ) ريال (جمع هزينه ها ) ريال (

ـ هزینه هایی كه از ساير سازمان ها تأمین خواهد شد؟8ـ3- نام سازمان تأمین كننده اعتبار، مبلغ و نحوه مصرف آن :3-7-1

ـ جمع هزينه هاي طرح: 9ـ3- هزينه پرسنلي1- هزينه آزمایش ها و خدمات تخصصي2- هزينه وسايل مصرفي3- هزينه مسافرت4- هزينه تايپ و تكثير5- جمع كل هزینه ها :6- مبلغ تأمین شده توسط سازمان های ديگر7 - باقيمانده اعتبار مورد نياز كه بايد توسط8

معاونت پژوهشي تأمین گردد: صحت مطالب، ليست وسايل و مواد و هزينه هاي مطالب مندرج در طرح پيشنهادي مورد تأييد

می باشد.

16

بخش چهارم – اطالعات ديگر مربوط به طرح

ـ مشكالت اجرائي احتمالي در انجام طرح و روش حل مشكالت : 1ـ4

( : Referencesمنابع و مأخذ ) ـ 1ـ4

1.Marlot D,Knezervic M, Vunjak Novakovic, Bone tissue engineering with human stem cellsBio Med centeral ltd,2010

2.Cancedda R, Dozin B, Giannoni P, Quarto R, Tissue engineering and cell therapy of cartilage and bone,matrix boil,2003;22(1):81-91

3.Coppola C, Del Buono A, Maffulli N, teriparatide in fracture non-unions. Translational medicine @unisa,2015-issn2237-9747 ,

4.M Emara KH, Ahmed Diab R, KHaled Emara A, recent biological trends in management of fracture non union,jornal of orthopedics,2015,issn 2218-5836

5.Hongzhi ZH, Hockin H.K.XU, the fast release of stem cells from alginate-fibrin microbeads injectable scaffold fr bone tissue -engineering, Biomaterials,2011

6. Palma santana B,Nedel F,Piva E, Varella de carvalho R, Fernando Demarco F, Villarreal carreno N L , preparation,modification,and characterization of alginate hydrogel with nano-/microfibers: a new perspective for tissue engineering, Bio Med research international, vol.2013,ID 307602,6

7.Nedel F, Andere D.D.A, Oliveira I.O.A., et al.,stem cells therapeutic potential in dentistry, the journal of contemporary dental practice,vol.10,no.4,pp.90-96,2009

8 .Seo M., et al., Differentiation of human adipose stromal cells into hepatic lineBiochem Biopage in vitro and in vivo. hys Res Commun, 2005. 328: p. 258-641

9.Zhu j,bioactive modification of poly(ethylene glycol) hydrogel for tissu engineering,biomaterials,vol.36,no.11,pp.18051811,2010

10.Demarco f.f., Casagrande Z, Zhang Z, et al.,effects morephogen and scaffold porogen on the differentiation of dental pulp stem cells,journal of endodontics,vol.36,no.11,pp.1805-1811,2010

11.Woo K.M., Chen V.J, Ma P.X, nano-fibrous scaffolding promotes osteoblast differention and biomineralization,biomaterials,vol.28,28,no.2,pp.335-343,2007

12.Choi B-H, Choi Y.S, Kang D.G, Kim B.G, Song Y.H, cell behavior on extracellular matrix mimc materias based on mussel adhesive protein fused with functional peptides,biomaterials,vol.31,no.34,pp.8980-8988,2010

17

13.Simidsrod O, Skjak-Break G ,alginate as immobilization matrix for cells.trends biotech 1990;8:71-8

14.LU S, Anseth KS, release behavior of high molecular weght solutes from poly(ethylene glycol)-based degradeble networks macromolecules,2000;33:2509-15

15.LI Rh, Altreuter Dh , Gentile FT, transport characterization of hydrogel matricies for cell encapsulation, Biotech Bioeng,1996;50:365-73

16 .L.Drury j, G.Mooney D, hydrojels for tissue engineering: scaffold design variables and applications, Biomaterials 24(2003) 4337-4351,doi:10.1016/s0142-9612(03)00340-5

17.Wayne R.Gombotz, Wee S.F, protein release from alginate matrices,elsevier science,1998

18.Azandeh S ,Orazizadeh M, Hashemitabar M, Khodadadi A, Shayesteh A.K, Bijan Nejad D., et al, mixd enzymatic-explant protocol for isolation of mesenchymal stem cells from wharton’s jelly and encapsulation in 3D culture ,vol 5.no.10(2012),article id:23780.7,doi:10.4236/jbise.2012.510071

19.Stadlbauer, V., et al., Artificial Liver Support Systems in the Management of Complications of Cirrhosis. seminars in liver diseas, 2008. 28

20. Fujikawa, T., et al., Stem-cell therapy for hepatobiliary pancreatic disease. J Hepatobiliary Pancreat Surg 2005. 12: p. 190-195

21. MS, R. and M. MP, Stem cells and aging: expanding the possibilities Mech Ageing Dev 2001. 122: p. 713-34.

22. Lu, L., et al., Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis- supportive function and other potentials Hematopoietic Stem Cells, 2006. 91: p. 1017-26.

23.Penolazzi L, Tavanti E, Vecchiatini R, Lambertini E, Vesce F, Gambari R, encapsulation of mesenchymal stem cells from Wharton’s jelly in alginate microbed, tissue engineering,vol.16,2010,doi:10.1089/ten.tec.2008.0582

24. Can, A. and S. Karahuseyinoglu, human umbilical cord stroma with regard to the source of fetus-derived. Stem Cells ,2007. 25: p. 2886-2895

25 .L.Wilson G, Najia M.A, Saeed R, C.McDevitt T, alginate encapsulation parameters ifluence the differention of microencapculated embryonic stem cell aggregetes,biotechnology and bioengineering, 2014,vol.111,no.3, ,doi:10.1002/bit.25121

18

26.Westhrin M, Xie M, Q.OlderQy M, Sikorski P, L.Strand B, standal T, osteogenic differentiation of human mesenchaymal stem cell in mineralized alginate matrices .open access,2015,dio:10.1371/journal.pone.0120374

27. Pullisaar H, Reseland JE, Haugen HJ, Brinchmann JE, Østrup E. Simvastatin coating of TiO 2 scaffold induces osteogenic differentiation of human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells. Biochemical and biophysical research communications. 2014 Apr 25;447(1):139-44.

28. He, Xiaoning, Yang Liu, Xue Yuan, and Li Lu. "Enhanced healing of rat calvarial defects with MSCs loaded on BMP-2 releasing chitosan/alginate/hydroxyapatite scaffolds." (2014): e104061.

29. Moshaverinia A, Chen C, Xu X, Akiyama K, Ansari S, Zadeh HH, Shi S. Bone regeneration potential of stem cells derived from periodontal ligament or gingival tissue sources encapsulated in RGD-modified alginate scaffold. Tissue Engineering Part A. 2013 Nov 5;20(3-4):611-21.

30. Moshaverinia A, Ansari S, Chen C, Xu X, Akiyama K, Snead ML, Zadeh HH, Shi S. Co-encapsulation of anti-BMP2 monoclonal antibody and mesenchymal stem cells in alginate microspheres for bone tissue engineering. Biomaterials. 2013 Sep 30;34(28):6572-9.

31.hashemibeini B, Esfandiari E, Sadeghi F, Heidary F, Roshankhah SH, Mardani M, Goharian V, An animal model study for bone repair with encapsulated differetiated osteo blast from adipose –derive stem cell in alginate,iranian journal of basic medical sciences,2014;17:854-859

32.Chen W,Zhou H, D.Weir M, Bao CH, H.K.XU H, umbilical cord stem cells released from alginate-fibrin microbead inside macroporous and biofunctionlized calcium phosphate cement for bone regeneration,acta Biomaterialia,2012,doi:10.1016/j.acta.2012.02.021

33.Tang M, Chen W, Weir M.D, Thein-Han W, XU H.H.K, human emberyonic stem cell encapculation in alginate microbeds in macroporous calcium phpsphate cement for bone tissue engineering,actaBiomaterialia,2012,dx.doi.org/10.1016/j.actbio.2012.05.016

34.Moshaverinia A, Chen CH, Akiyama K, Ansari S, XU X, W.Chee W, R.Schricker S, Shi S ,alginate hydrojel as a promising scaffold for dental-derived stem cell:anin vitro study , j Mater sci:M ater Med,2012,doi:101007/s10856-012-4759-3

19

35. Lee B-H, Li B, A.Guelcher S, Gel microstructure regulates proliferation and differentiation of MC3T3-E1encapsulated in alginate beads.J Acta Biomaterialia 8(2012)1693-1702

36. Chayosumrit M, Tuch B, Sidhu K, Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm .J Biomaterials 31(2010),505-514

37.Purcell Ek, Singh A, Kipke DR, alginate composition effects on a nural stem cell-seeded scaffold,tissue engineering part c 15:541-550.

38. Wang N, Adams G, Buttery L, Falcon FH, Stolnik S, Alginate encapsulation technology supports embryonic stem cells differentiation into insulin producing cells.J Biotechnol 2009,doi:10.1016\j.jbiotec.2009.08.008

39.Sanai M,the investigation for osteoblast proliferation in monolayer and alginate scaffold for tissue engineering purpuses.isfahan university of medical sciences;2008.

40 .Abbah SA, LU WW, Peng SL, Aladin DMK, Li ZY, Tam WK, extracellular matrix stability of primary mammalian chondrocytes and intervertebral disc cells culture in alginate-based microbead hydrojels,cell transplant,2008;17(10-11):1181-92

41.Norhayati S-I, E. Bioshop A, M.Polak J, Mantalaris A, the benefit of human embryonic stem cell encapcullation for prolonged feeder-free maintenance,biomaterials,2008,doi:10.1016/j.

42..Abbah SA, LU WW, Chan D, Cheung KM, Liu WG, Zhao F, et al ,in vitro evaluation of alginate encapsulated adipose-tissue stromal cells for use as ingectable bone graft substitute.biochemical biophys res commun2006;374(1):185-91

43..Abbah SA, LU WW, Chan D, Cheung KM, Liu WG, Zhao F, et al .,osteogenic behavior of alginate encapsulated bone marro stromal cells:an in vitro study.j mater sci mater med 2008;19(5):2113-9

44.Lio W, Yang Z, Deng L, Li X, Sun T, Luo J, et al., morphological and biomechanical study on in vivo osteogenesis after repair of cranial dfects with plastic engineered bone in rabbits,2005;19(6):460-3

20

45.Alsberg E, Kong HJ, Hirano Y, Smith MK,Albeiruti A, Mooney DJ, regulating bone formation via controlled scaffold degradation,j dent res,2003;82911):903-8

46. Stabler C, Wilks K, Sambanis A, the effects of alginate compositon on encapsulated TC3cells.Biomaterials,2001, 22:1301-1310

47.Dembczynski R,et al.,determination of pore dimeter and molecular weight cut-off of hydrogel-membrane liqid-core capsules for immunoisolation,j biomater sci poly Ed,2001;12(9):1051-8

48.Majmudar G,et al.,bone cell culture in athree-dimensional polymer bead stabilizes the differentiated phenotype and provides evidence that osteoblastic cells synthesize typeIII collagen and fibronectin.j bone miner res,1991;6(6):869-81

21

خالصه : ) در این قسمت خالصه ای از طرح شامل عنوان، اهداف ویژه وروش کار آورده شود.(

تاثیر غلظت های مختلف آلژینات با غلظت باالی گلورونیک اسید، بر زنده ماندن و تمایز سلولعنوان:های مزانشیمی استخراج شده از بند ناف انسانی به سلول های استئوبالست

تاثیر غلظت های مختلف آلژینات با غلظت باالی گلورونیک اسید، بر زنده ماندن و تمایزهدف اصلي:سلول های مزانشیمی استخراج شده از ژله وارتون بند ناف انسانی به سلول های استئوبالست

با توجه به استفاده زیاد از آلژینات به عنوان یک داربست سههدف كاربردي: بعدی در مهندسی بافت واکثر فعالیت های پژوهشی در این تحقیق سعی شده است

تا با فراهم آوردن یک محیط کشت مناسب برای زنده مانده و تمايز سلول های مزانشیمی گامی درجهت پیشبرد وکمک به سایر محققین در انتخاب داربست مناسب

براي تمايز سلول هاي مزانشيمي بند ناف به سلول هاي استخواني برداشته شود

ابتدا بند نافها را طبق ضوابط واصول اخالقی و رضایت از مادرانی که تازه زایمانروش كار: با گلوکز پایینDMEMکرده اند جمع آوری کرده و تحت شرایط استریل فورا در محیط کشت حاوی

آمفوتریپسین بتا در دمای0.25mg/mL استرپتومایسین ، 100mg/mL پنی سلین ، 100U/mLشامل درجه سانتی گراد به محیط آزمایشگاه منتقل و در زیر هود المینار تحت شرایط استریل قرار4

همراه با آنتی بیوتیک آنها را چندین بارPBSداده و قبل از اینکه آنها را تکه تکه کنیم با محلول تکه تکه کرده و عروق خونی و غشا آمینیون دور4cm-2شستشو داده سپس بند ناف را به قطعات

است دوباره مزانشیمی آن را جدا سازی کرده و باقی مانده آنرا که همان ژله وارتون حاوی سلول شسته و در فالسکهایی بهPBS تکه تکه کرده و سه بار با 5mm-3به قطعات کوچکتری در اندازه

با گلوکز پایینDMEM قرار داده می شوند. سپس محیط کشت کامل شامل ترکیبی از 25cm²ابعاد پنی سلین/ استرپتومایسین را اضافه نموده و آنها100U و FBS% 10 ال گلوتامین همراه با 2mMبا

نگه داری کرده و هر دو تا سه روز محیط کشت را تعویضCO2%5درجه و 37را در آنکوباتور نموده تا سلولها تکثیر شده و آماده برای انکپسوله شدن شوند.

حل نموده و در دمایNaCl برای تهیه محلول آلژینات غلضت های مختلف آن را در آب مقطر حاوی درجه حرارت داده و پس از سرد شدن، به کمک فیلترهای سرنگی استریل و در ادامه با سلول60

اضافه کرده تا بیدها تشکیلCaCl2ها ترکیب نموده و با استفاده از سرنگ به محلول پلیمریزه کننده شستشو می دهیم.PBSشوند سپس بیدهای حاوی سلول را با

جهت ارزیابی میزان زنده بودن سلول های کپسوله در غلضت های مختلف آلژینات ، آن ها را-1 درصد سرم کشت داده و سپس از رنگ10 حاوی DMEMبه مدت دو هفته در محیط کشت

استفاده و نتایج با میکروسکوپ فلورسنت ثبت و مقایسه می شود.Live/dead assayامیزی

جهت تمایز به سلول های استخوان ساز، سلول های کپسوله شده در غلضت های مختلف-2 روز(21آلژینات، را در معرض محیط تمایزی استخوان ساز قرار داده و در پایان دوره تمایز)

جهت وجود تشخیص ماتریکس معدنی استفادهalizarin red s وvan kossaرنگ آمیزی های می شود.

ريال 99760000 هزينه پيش بيني شده: مورخ..................................... صورتجلسه شورای پژوهشی گروه

.......................

22

پایان نامه خانم/

آقای .......................................................................................... در

مقطع ......................................................

با

عنوان .................................................................................................

.........................................................................................

به راهنمایی ................................................. در جلسه

مورخ ............................. شورای پژوهشي گروه ...................................

با مبلغ ...................................... ریال مطرح و مورد بررسی قرار گرفت و به

تصویب اعضای شورای پژوهشی گروه رسيد.

امضای اعضای شورای پژوهشي گروه :

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.1

امضاء .........................................

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.2

امضاء .........................................

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.3

امضاء .........................................

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.4

امضاء .........................................

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.5

امضاء .........................................

23

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.6

امضاء .........................................

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.7

امضاء .........................................

نام و نام خانوادگي ...................................................... مهر و.8

امضاء ........................................

مهر و امضای مدیر گروه

پژوهشگر محترم: ردیف های ستاره دار بطور دقیق مطالعه و بر اساس اطالعات پژوهش مورد نظر جهت طرح در کمیته اخالق در پژوهش نسبت به تکمیل آن اقدام شود. در نهايت فرم

تكيمل شده مي بايست در يك صفحه تهيه و به امضاي پژوهشگر برسد.*عنوان طرح پژوهشي

*نام مجري در این قسمت باید طرح تحقیقاتی به زبان بسیار ساده و قابل فهم برای بیمار توضیح داده شود و بیمار بداند برای*معرفی پژوهش

وی چه روش درمانی یا تشخیصی، چگونه و به چه مدت بکار برده می شود. در صورتیکه از بیمار در طی طرح تحقیقاتی خونگیری بعمل می آید در این قسمت میزان خون گرفته شده و دلیل*خونگیری

این عمل باید به وضوح توضیح داده شود. در این قسمت فواید شرکت در پژوهش مورد نظر باید برای بیمار به زبان ساده و قابل فهم بیان شود.*مزایا

ها و مضرات احتمالی روش انتخابی جهت تشخیص یا درمان بیماری فرد برای وی به زبانSide effect در این قسمت *خطراتساده و قابل فهم بیان شود.

در این قسمت باید مشخص گردد که جبران عوارض احتمالی روش تشخیصی یا درمانی جدید به عهده مجری یا*جبران خطراتمجریان طرح تحقیقاتی می باشد و نحوه جبران خسارت نیز باید ذکر گردد.

در این قسمت باید ذکر گردد که چنانچه در طرح تحقیقاتی اقدام تشخیصی یا درمانی غیر متعارف یا غیر ضروری*هزینهانجام شود، هزینه به عهده مجری یا مجریان طرح خواهد بود و بیمار هزینه ای را پرداخت نخواهد کرد.

در این قسمت باید شرح داده شود که در صورت عدم پذیرش روش انتخابی پژوهشگر، بیمار از چه روشهای درمانی*روشهای جایگزینیا تشخیصی دیگر می تواند استفاده نماید.

در این قسمت باید ذکر گردد که نتایج آزمایشها و روشهای به کار رفته به اطالع بیمار خواهد رسید و این نتایج*محرمانه بودن بصورت کامالً محرمانه و صرفاً جهت مقاصد پژوهش به کار خواهد رفت و هویت بیمار در چارچوب قانون محرمانه

خواهد ماند. ، كدكارآزمايي باليني در فرم نهايي ارائه شده به شركت كنندگانwww.irct.ir پس از اخذ كد اخالق و ثبت طرح در *كدكارآزمايي باليني

در طرح در اين قسمت ثبت گردد.آدرس

پژوهشگر در این قسمت آدرس مجری یا مجریان طرح در اختیار بیمار داده شود*

تا وی در هر زمانی که مایل بود بتواند پرسشهای خود را در مورد روشهای به کار رفته جهت تشخیص یا درمان وی یا بروز عوارض احتمالی

آن روشها مطرح و مشاوره دریافت نماید.

مهر و امضاء پژوهشگر

شماره تماس پژوهشگر

در این قسمت باید آدرس و شماره تلفن تماس مجری یا مجریان طرح* در اختیار بیمار داده شود تا وی در هر زمانی که مایل بود بتواند

پرسشهای خود را در مورد روشهای به کار رفته جهت تشخیص یا درمانوی یا بروز عوارض احتمالی آن روشها مطرح و مشاوره دریافت نماید.

اين بخش مي بايست توسط فرد مورد پژوهش تكميل گردد.

تاریخ:...................................

معاونت توسعه پژوهش وفناوری

راهنماي تكميل فرم رضایت آگاهانهشرکت در طرح تحقیقاتی

24

رضايتتوضيحات حضوري مجرياينجانب با آگاهي کامل از موارد فوق و شرکت نمايم.به صورت كامال اختياري و آزادمي دهم که به عنوان يک فرد مورد مطالعه در پژوهش

کليه اطالعاتي که از من گرفته مي شود و نيز نام من محرمانه باقي خواهد ماند و نتايج تحقيقات به صورت کلي و در قالب اطالعات گروه مورد مطالعه منتشر مي گردد و نتايج فردي درصورت نياز بدون ذکر نام و مشخصات فردي عرضه خواهد گرديد و همچنين برائت پزشک يا پزشکان اين طرح را ازکليه

اقدامات مذکور در برگه اطالعاتي در صورت عدم تقصير درارائه اقدامات اعالم مي دارم. اين موافقت مانع از اقدامات قانوني اينجانب در صورتي که عملي خالف وغير انساني انجام شود نخواهد

بود.آدرس

فرد مورد پژوهش امضاء واثر انگشت فرد يا قيم فرد مورد

پژوهش

شماره تماس فرد مورد پژوهش

لطفا پيشنهادات و نظرات و يا مشكالتي و هرگونه خالفي كه در پروسه انجام اين تحقيق وجودداشته يا دارد با شماره تلفن research@ajums.ac.ir دفتر كميته اخالق دانشگاه علوم پزشكي جندي شاپور اهواز و يا با پست الكترونيك 33361984-061

با ما در ميان بگذاريد.

25

26

27

28