ppractica de microbiologia

Microsoft Word - Guin de Prcticas de Microbiologa 2006-2007 Revisado.doc

MICROBIOLOGA

SEGUNDO CURSOGUIN DE PRCTICASCurso 2007-2008INDICENormativa de las prcticas de Microbiologa............................................................................................................. Pag. 3

Normas y reglas en el laboratorio de Microbiologa .................................................................................................. Pag. 4

Material de laboratorio ............................................................................................................................................... Pag. 5

Objetivo de las prcticas de Microbiologa ................................................................................................................ Pag. 6

Esquema de trabajo .................................................................................................................................................... Pag. 7

Toma de muestra ........................................................................................................................................................ Pag. 8

Preparacin de medios de cultivo ............................................................................................................................... Pag. 9

Mtodos de siembra .................................................................................................................................................. Pag. 10

Mtodos de incubacin ............................................................................................................................................. Pag. 15

Observaciones macroscpicas................................................................................................................................... Pag. 15

Observaciones microscpicas ................................................................................................................................... Pag. 17

Morfologa de las bacterias ....................................................................................................................................... Pag. 21

Identificacin bacteriana ........................................................................................................................................... Pag. 22

Tiras Multisustrato .................................................................................................................................................... Pag. 30

Antibiograma ............................................................................................................................................................ Pag. 31

Prctica de Virologa................................................................................................................................................. Pag. 36

Prctica de Micologa................................................................................................................................................ Pag. 41

Anlisis de alimentos ................................................................................................................................................ Pag. 56

Medios de cultivo...................................................................................................................................................... Pag. 59

Pruebas bioqumicas ................................................................................................................................................. Pag. 62

Supuesto prctico ...................................................................................................................................................... Pag. 72

NORMATIVA DE LAS PRCTICAS DE MICROBIOLOGIA- Las prcticas de Microbiologa e Inmunologa son obligatorias para todos los alumnos matriculados en la asignatura y deben ser superadas para poder acceder al examen final de la misma.- Se exceptan de esta norma aquellos alumnos que las hayan superado en el curso anterior en esta Facultad. Los alumnos que hayan cursado prcticas de Microbiologa en otras Universidades debern presentar un certificado acreditativo que ser evaluado por el Depar- tamento para juzgar si procede o no a su convalidacin.

- Los alumnos sern convocados mediante listas que se expondrn con la debida ante- lacin en el tabln de anuncios del Departamento (Pabelln de Sanidad Animal) y debern venir provistos de bata de laboratorio y guin de prcticas, as como de dos artculos de divulgacin, extrados de la prensa diaria reciente (peridicos o revistas que se puedan com- prar en kioscos, y que no sean especficamente cientficos; tambin puede ser de Internet del mismo tipo de publicaciones on-line).

- Las practicas transcurren a lo largo de dos semanas consecutivas. De martes a vier- nes, en las que se realizarn las enseanzas prcticas de correspondientes a la asignatura de Microbiologa.

- Los horarios sern de maana para los alumnos que cursan estudios por la tarde y de tarde para los que cursan estudios por la maana. La duracin de cada una de las sesiones prcticas es variable, estimndose en unas 3 h.

- Es obligatoria la asistencia a todas las sesiones prcticas que integran cada grupo. Las faltas debern ser debidamente justificadas y la ausencia en ms de una sesin supondr el paso directo al examen final de prcticas.

- Una parte importante de las prcticas corresponder a la realizacin de una identificacin bacteriana de una muestra problema. Al finalizar la misma, el alumno deber entregar al profesor de prcticas un informe sobre el proceso seguido, en el que se incluya la bibliografa consultada, y otros datos que considere de inters.

- La calificacin del alumno en lo que respecta a las prcticas de esta asignatura se ba- sar en tres criterios: actitud del alumno a lo largo de las prcticas, conocimientos adquiridos, e informe presentado.

- Los alumnos que no superen la evaluacin prctica podrn presentarse al examen final de prcticas que tendr lugar antes del examen final terico de la asignatura.

- Tendrn derecho al examen final de prcticas todos los alumnos de la asignatura que por cualquier causa no las hayan superado con anterioridad.

- Excepcionalmente podrn repetir las prcticas voluntariamente aquellos alumnos que no habiendo superado la prueba correspondiente a su grupo, as lo soliciten y sean informados favorablemente por el Profesor responsable de su grupo.

- Los cambios de grupos de prcticas slo se admiten en las siguientes circunstancias:

* Por razn de incompatibilidad con el horario laboral debidamente justificada y siempre que se haga constar con claridad en la ficha de la asignatura.

* Por acuerdo con otra persona que deba tambin realizarlas pero en un turno diferente, hacindolo constar igualmente muy claramente al rellenar la correspondiente ficha por parte de ambas personas.

*Por razones de enfermedad debidamente justificadas.

NORMAS Y REGLAS EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGIAPor escaso que sea el nivel de conocimientos que se posea de esta asignatura, cualquiera puede imaginarse fcilmente que en el trabajo cotidiano en un laboratorio de Microbio- loga, uno de los problemas que hay que cuidar es el de las contaminaciones con microorganismos no deseables, ya que su presencia en un cultivo es origen, en el mejor de los casos, de errores en las pautas de identificacin, cuando no atentan contra la seguridad del microbilogo y de su entorno. Por este motivo, se deben respetar y cumplir unas reglas esenciales:

A - Evitar la contaminacin del material a estudiar.

B - Evitar la contaminacin por el material a estudiar. Las normas bsicas de actuacin se concretan en:

1.- Del microbilogo:

1.1 La prenda adecuada para trabajar en un laboratorio de Microbiologa es la bata blanca, que debe estar siempre limpia y usarse slo en el interior de los laboratorios.

1.2 Normas generales de higiene:

* Limpieza de manos antes y despus del trabajo.

* Si la longitud de los cabellos es notable, stos debern estar recogidos.

1.3 Normas generales de comportamiento:

* El material, mobiliario y dems utensilios deben cuidarse con el mayor es- mero.

* No se puede fumar, beber o comer en el laboratorio bajo ningn concepto.

* Hay que evitar desplazamientos intiles y movimientos bruscos.

2.- Del lugar de trabajo:

2.1 Cada alumno dispone de un puesto de trabajo en el que podr encontrar:

* Un papel de filtro que cubre el lugar de trabajo.

* Un mechero de gas emplazado en el centro. El mechero debe permanecer encendido durante la realizacin de los experimentos que requieran su utiliza- cin, apagndose cuando no sea necesario.

* Los instrumentos y elementos especficos para la realizacin de cada prctica concreta.

3.- Del trabajo:

3.1 No se debe comenzar el trabajo hasta haber recibido las instrucciones precisas.

3.2 Se deben preguntar siempre todas las dudas que aparezcan antes de realizar el trabajo.

3.3 La mayor parte de los instrumentos que se utilizan deben ser y permanecer estriles, por lo cual se manejan siempre en una zona aproximada de unos 15 cm alrededor de la llama del mechero encendido.

3.4 La esterilizacin de algunos utensilios (asas de platino, boca de los tubos, etc) se consigue mantenindolos en posicin oblicua sobre la llama. Estas operaciones se realizan siempre antes y despus de utilizar tales instrumentos.

3.5 No se debe dejar nunca el tubo o la placa abiertos ms tiempo del estrictamente necesario, para evitar una posible contaminacin del cultivo. Tampoco se debe depositar el tapn del tubo con el que estamos trabajando sobre la mesa, debindose mantener siempre en la mano hasta el momento de tapar el tubo.

3.6 La organizacin del trabajo vara segn la prctica que se est realizando, pero en general:

* Deben evitarse las precipitaciones.

* Deben evitarse riesgos de confusin etiquetando o marcando el material.

* Deben evitarse riesgos de contaminacin (evitar contacto de la boca con las manos, evitar chupar objetos del laboratorio, etc.).

* Deben tomarse todas las precauciones posibles para evitar accidentes (corta- duras, quemaduras, etc.).

3.7 Despus del trabajo, tambin debe seguirse un plan ordenado.

* El material utilizado debe transportarse al lugar donde contine su procesa- miento.

* El material y utensilios utilizados deben ser lavados y esterilizados para su posterior uso o bien eliminarse previa esterilizacin si son de un solo uso.

* El puesto de trabajo debe quedar al final ordenado y limpio, tal como se en- contr al inicio de la sesin.

MATERIAL DE LABORATORIOEl material utilizado en un laboratorio de Microbiologa es muy variado y depende fundamentalmente de las lneas de trabajo a las que est dedicado; evidentemente, no se preci- sa el mismo equipamiento en un centro de investigacin con un alto grado de especializacin que en un laboratorio de Bacteriologa Clnica.

Por tanto, aqu slo nos referiremos al material bsico que se suele encontrar en un laboratorio mnimamente dotado.

A) Material de uso corriente:

* Material de vidrio o plstico que se usa para contener o medir: aqu se incluyen tubos de ensayo, vasos de precipitado, matraces, embudos, probetas, pipetas, dosificadores, etc., todo ello de distintos tamaos y capacidades. Tambin incluimos las placas de Petri, los portaobjetos y cubreobjetos, cmaras de recuento, cestillos y cubetas para efectuar tinciones, jarras para incubar en anaerobiosis, etc.

* Material de siembra: constituido principalmente por asas y filamentos de platino, asas de

Drigalski y pipetas estriles.

* Material para toma de muestras e inoculaciones: escobillones estriles, tubos y frascos estriles, jeringas y agujas, trcares, cnulas, catteres y material de diseccin.

B) Aparatos productores de calor:

Se utilizan con diversas finalidades:

* Para esterilizacin: autoclave (calor hmedo), horno Pasteur (calor seco) y mechero Bun- sen (esterilizacin por calentamiento directo).

* Para incubacin: estufas, baos de agua, de aceite o parafina y de arena.

C) Aparatos productores de fro:

* Refrigeradores: son indispensables para conservar los medios de cultivo, productos biolgicos y patolgicos, as como mantener la supervivencia de algunos mo. Su temperatura oscila alrededor de los 4C.

* Congeladores: alcanzan temperaturas entre -20 y -70 C y son indispensables para conservar determinados productos biolgicos (sueros, clulas, mo).

* Neveras porttiles: para trasladar muestras al laboratorio en condiciones de refrigeracin.

D) Material ptico:

Es de capital importancia en el laboratorio ya que permite la observacin de los mo..

* Microscopios: en su distintas versiones (campo claro, campo oscuro, contraste de fases, fluorescencia).

* Lupa estereoscpica: permite observar colonias bajo distintas condiciones de ilumina- cin.

E) Otro tipo de material y aparatos:

* Agitadores y homogeneizadores.

* Centrfugas.

* Balanzas.

* Liofilizadores.

* pHmetros.

* Espectrofotmetros.

* Destiladores, etc.

OBJETIVO DE LAS PRACTICAS DE MICROBIOLOGIALas clases prcticas de Microbiologa tienen como objetivos bsicos los siguientes:

- Familiarizar al alumno con las normas generales de trabajo en el laboratorio.

- Iniciarle en el uso de los elementos y medios propios de la asignatura.

- Ensearle las tcnicas bsicas empleadas para el estudio de microorganismos.

Aislamiento e identificacin bacteriana.

Preparacin e interpretacin de antibiogramas.

Anlisis de microorganismos en alimentos.

Recuento de bacterias

Estudio e identificacin de hongos.

Observacin de la patogenicidad celular de virus.

ESQUEMA DE TRABAJOA) BACTERIOLOGA1) Anlisis clnico.

- Recogida de muestras:

* Condiciones de esterilidad

* Emisin de informe

* Envo rpido al laboratorio- Anlisis

- Aislamiento:

* Medios de cultivo slido

* Siembra por agotamiento

* Incubacin:

* 37C

* 24/48 h

* Aerobiosis/anaerobiosis- Identificacin:

* Anlisis macroscpico de colonias

* Anlisis microscpico:

- Formas y dimensiones

- Tincin de Gram

- Estructuras especiales

* Pruebas bioqumicas

* Pruebas serolgicas

* Identificacin por comparacin de datos

* Identificacin por tiras multisustrato

2) Antibiograma* Preparacin

* Interpretacin

3) Anlisis de microorganismos en alimentosB) MICOLOGIA* Obtencin de cultivos puros

* Pautas de identificacin

D) VIROLOGA* Efecto citoptico.

TOMA DE MUESTRABajo la denominacin de muestra se incluye cualquier elemento orgnico, natural o patolgico, procedente del animal vivo, del cadver, o de su entorno, que sea susceptible de contener microorganismos. Son muestras por tanto, lquidos fisiolgicos (sangre, orina, sali- va, heces), lquidos patolgicos (exudados, pus, esputos, vmitos) y slidos como biopsias o piezas procedentes del cadver; tambin son muestras los alimentos, camas y el propio ambiente en el que se encuentran situados los animales.

Recogida de muestras:

Las muestras deben ser recogidas con la mxima asepsia con el fin de no introducir en ellas microorganismos ajenos al proceso. Esta asepsia se refiere:

* Al proceso y condiciones de la toma de muestras, que debe evitar las contaminaciones.

* A los utensilios empleados, que deben estar estriles.

* A los recipientes destinados a la recogida y envo al laboratorio, que igualmente deben estar estriles.

Una vez recogidas, las muestras se deben enviar al laboratorio con la mayor rapidezposible.

Toda muestra debe ir acompaada de un informe en el cual, de forma ordenada y pormenorizada, se expondrn todos aquellos datos que tengan relacin con la misma y que puedan ser tiles para orientar al laboratorio en su labor analtica. Estos datos suelen ser de tipo clnico (sintomatologa, lesiones, tratamientos efectuados) y epidemiolgicos (n de animales afectados, n de bajas, edad, sexo, tipo de alimentacin, sistema de explotacin, vacuna- ciones, enfermedades ms frecuentes en la zona, etc.).

En el momento de su recepcin en el laboratorio, toda muestra debe ser conveniente- mente identificada a travs de un nmero de orden y de su inclusin en el libro de anlisis.

PREPARACION DE MEDIOS DE CULTIVO1. Tipos de medios:

a) Por su objetivo:

- Aislamiento

- Enriquecimiento

- Identificacin

- Conservacin

- Recuento

b) Por su especificidad para los microorganismos:

- Comunes

- Selectivos

c) Por su composicin:

- Naturales o empricos

- Sintticos

- Semisintticos

d) Por su estado fsico:

- Slidos: por el empleo de agentes solidificantes.

* Agar:1,5-2 % medios slidos

0,2 % medios semislidos* Gelatina.

- Lquidos

e) Por su forma de almacenamiento y empleo:

- En placa

- En tubo:* lquido

* slido vertical

* slido en pico de flauta

2. Material necesario:

- Preparacin: balanza, matraz, vaso de precipitados, esptula, probetas, tubos, tapones.

- Esterilizacin: autoclave/filtracin.

3. Mtodo de preparacin:

- Pesar las cantidades fijadas para cada medio de cultivo.

- Hidratar con agua destilada hasta el volumen preciso.

- Ajustar el valor del pH.

- Homogeneizar por calentamiento para una buena solubilizacin de los componentes.

- Esterilizacin.* Por autoclave: material que no se altere por

** Caramelizacin: ciertos azcares.

** Precipitacin: ciertos minerales.

** Desnaturalizacin: ciertas protenas.

* Por tyndalizacin: material que se altere a temperaturas de autoclave.

* Vapor fluente.

* Filtracin:** Filtros adaptables a jeringuillas.

** Sistemas de filtros Millipore.

4. Medios incompletos:

Son aqullos a los que hay que aadir algn otro componente tras la esterilizacin (normalmente es un componente sensible al calor); p.e., yema de huevo, sangre, etc..

METODOS DE SIEMBRAEl primer paso a seguir en la identificacin de un microorganismo es proceder a su obtencin en cultivo puro, pues es obvio que las reacciones de cultivos mixtos no podrn ser usadas en la identificacin.

El mtodo ms comn de obtencin de un cultivo puro consiste en tomar una sola colonia del medio de aislamiento y proceder a su siembra por agotamiento.

Pauta general:

1. Coger el asa de platino como se indica en la figura 1.

2. Flamear el asa de platino hasta que tome color rojo. Flamear tambin el resto del vstago

(figura 2).

3. Toma de muestra

3.I Si se parte de una muestra lquida (o cultivo lquido):

3.I.a. Agitar el tubo (figura 3).

3.I.b. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4).

3.I.c. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5).

3.I.d. Introducir el asa en el tubo de forma que el extremo quede justo por de- bajo de la superficie (figura 6).

3.I.e. Esperar a que deje de burbujear y extraer el asa. La pelcula formada estar cargada de microorganismos.

3.I.f. Volver a flamear el tubo.

3.I.g. Poner el tapn.

3.II. Si se parte de un cultivo slido:

3.II.a. Enfriar el extremo del asa en una zona del medio de cultivo donde no haya crecimiento.

3.II.b. Tomar una colonia bien aislada.

4. Siembra en el medio de cultivo.

4.I. Siembra en medio lquido:

4.I.a. Destapar el tubo sin depositar el tapn en la mesa (figura 4).

4.I.b. Flamear los bordes del tubo ligeramente (figura 5).

4.I.c. Introducir el extremo del asa, previamente cargada en el tubo con medio lquido y se agita con energa para desprender los microorganismos.

4.I.d. Volver a flamear el tubo.

4.I.e. Poner el tapn.

4.II. Siembra en medio slido:

4.II.a. Tomar una placa de medio slido no utilizada y por tanto estril.

4.II.b. Colocarla sobre la mesa de trabajo de forma invertida de tal forma que se encuentre el medio de cultivo en la parte superior. De esta forma se puede destapar la placa con una sola mano.

4.II.c. Una vez destapada, se apoya el extremo del asa cargada con microorganismos sobre la superficie y se efecta la siembra.

5. Flamear el asa hasta que se ponga incandescente.

6. Rotular las placas o los tubos de forma que se puedan identificar.

- Tipos de siembras:

a) Siembra por agotamiento: La finalidad de esta siembra es obtener colonias aisladas del microorganismo o microorganismos sobre el medio de cultivo slido. Consiste en

desplazar el asa de platino sobre la superficie del medio slido siguiendo cualquiera de los siguientes procedimientos:

* En zig-zag: consiste en desplazar el asa por el medio haciendo un movimiento en forma de zeta desde un borde de la placa hacia el opuesto. Cuando se llega al centro de la placa, se levanta el asa y se repite el movimiento empezando por el otro extremo de la misma (figura 7). Este tipo de siembra tambin se puede hacer en tubo con medio slido en pico de flauta.

* En estras: con el asa cargada se trazan dos o tres lineas tangenciales en un borde de la placa; se flamea el asa, se enfra en una zona no sembrada y de nuevo se trazan dos o tres estras que crucen a las anteriores; este procedimien- to se repite hasta que se completa la superficie de la placa (Figura 7).

b) Siembra en masa: primero se aade un volumen conocido de suspensin de microorganismos en una placa estril; despus se aaden 10-15 ml de medio de cultivo fundido a 45C, se mezcla el contenido de la placa con movimientos circulares y se deja solidificar.

c) Siembra en superficie: sobre una placa con medio solidificado se deposita una cantidad medida de suspensin de microorganismos y se extiende de forma uniforme con un asa de Drigalski (figura 8).

d) Siembra por picadura: se utiliza el filamento de platino que se introduce de forma vertical en un tubo con medio slido (figura 9).

e) Siembra por inundacin: sobre una placa con medio solidificado se vierte una suspensin densa de microorganismos de forma que "se inunde" toda la placa. Se espera unos

15 minutos para que se adsorban los microorganismos y se elimina el lquido restante guar- dando condiciones de esterilidad.

TCNICAS DE AISLAMIENTO: TOMA DE MUESTRASFigura 7.- Tcnicas de aislamiento: agotamiento de asa en placaA.- PASOS SUCESIVOS DEL AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA1. Estras

3. Estras

5. Estras

7. Estras

2. Flameado

Enfriar

4. Flameado

Enfriar

6. Flameado

Enfriar

B.- OBSERVACIN DE LOS RESULTADOS TRAS LA INCUBACINObtencin de colonias aisladas

OTROS SISTEMAS DIFERENTES DE AGOTAMIENTO DE ASA EN PLACA

METODOS DE INCUBACION1. Temperatura:

* Bacterias patgenas: 37C; excepcionalmente otras Tas.* Hongos: ver prctica correspondiente.

2. Atmsfera de incubacin:

* Aerobiosis: trasladar las placas a la estufa e incubarlas de forma invertida (tapa aba- jo; medio inoculado arriba). Los tubos se incuban siempre en posicin vertical.

* Microaerofilia:

** Mtodo de la vela: en la jarra se introduce una vela encendida que va con- sumiendo el oxgeno acumulado tras cerrar la jarra.

** Estufa de CO2: permite regular la cantidad de CO2 en la atmsfera de incubacin.

* Anaerobiosis (Mtodo de GasPak): en una jarra de anaerobiosis junto a las placas o tubos se introduce un preparado comercial que produce H2, el cual se combina con el O2 y produce agua.

OBSERVACIONES MACROSCOPICASA) Crecimiento en medio slido: las clulas microbianas se reproducen habitualmente con tal rapidez que en 18 - 24 horas dan lugar a la aparicin de masas visibles de clulas sobre medios slidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que est formada por un nico tipo de microorganismo.

Las colonias tienen una morfologa caracterstica que se estudia a simple vista o con la ayuda de una lupa. Los caracteres ms importantes de las colonias y cuyo estudio tiene inters en la caracterizacin son los siguientes:

1. Forma: Puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada

2. Tamao: Se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm.

3. Elevacin: Vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve), convexa, pulvinada (ms elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia central), o umbili- cada (con una depresin central).

4. Forma del borde: Puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado), filamentoso, y rizado.

5. Superficie:

* Lisa

* Rugosa

* Mate

* Brillante

* Transparente

* Opaca

6. Color:

Presencia de colores caractersticos y difusin de pigmentos en el medio.

7. Capacidad de emulsin en agua:

* Forma una suspensin uniforme

* Forma una suspensin grumosa

* No se emulsiona

B) Crecimiento en medio lquido: tiene inters los siguientes aspectos:

1. Cantidad de crecimiento:

* Ninguna

* Escasa

* Moderada

* Abundante.

2. Crecimiento en la superficie:

* Positivo

* Negativo

* Formacin de un anillo

* Pelcula superficial que se desintegra o no al agitar

3. Turbidez:

* Uniforme

* Floculante

* Negativa

4. Depsito en el fondo del tubo:

* Ausente

* Granular

* Floculante

* Viscoso

* Se desintegra o no al agitar

OBSERVACIONES MICROSCOPICASEl ndice de refraccin de las bacterias es similar al medio que las rodea y por tanto son difciles de ver al microscopio. En cambio son qumicamente muy diferentes; estas diferencias son las que permiten distinguir las bacterias por medio de TINCIONES. Las tinciones son de dos tipos:

a) Tinciones simples: Son aqullas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma, el tamao y la ordenacin de las bacterias.

b) Tinciones diferenciales: Son aqullas que utilizan dos o ms reactivos. Con ellas se pueden observar diferencias entre clulas o partes de clulas. Las ms importantes son:

1. Tincin de Gram.

2. Tincin de microorganismos cido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen).

3. Tincin de estructuras.

- Tincin de esporos.

- Tincin de flagelos.

- Tincin de cpsulas.

Los principales pasos para realizar una tincin para su posterior examen microscpicoson:

1. Extensin:

* A partir de un caldo de cultivo. Con un asa de platino se coloca una gota de caldo en el portaobjetos y se extiende con movimientos circulares (figura 10).

* A partir de una colonia en medio slido. Con el asa de platino se toma una gota de agua que se deposita en el portaobjetos; despus se toma una colonia, se mezcla y se extiende como antes (figura 11).

2. Secar: dejando la preparacin al aire hasta la evaporacin

3. Fijacin:

Tiene como objeto fijar los microorganismos al portaobjetos por la llama hasta que se seque, sin calentar demasiado (figura 12). El calor excesivo alterara la forma normal y la estructura de los microorganismos que se van a teir. El portaobjetos debe notarse caliente, pero no debe quemar cuando se coloca sobre el dorso de la mano.

4. Tincin: En funcin del objetivo existen distintos procedimientos de tincin.

Tincin de GramCuando se emplea este mtodo de tincin, debido a diferencias en la pared celular, las bacterias se dividen por lo general en dos grandes grupos, segn retengan o no el colorante primario ("GRAMPOSITIVAS" o "GRAMNEGATIVAS" respectivamente) tras sufrir la accin de un decolorante.

En esta tcnica se emplean cuatro reactivos diferentes:

METODO:* Un colorante primario (violeta de genciana) durante tres minutos.

* Lavar con agua.

* Un mordiente (lugol) durante dos minutos.

* Lavar con agua.

* Un agente decolorante (alcohol-acetona) durante diez segundos.

* Lavar con agua.

* Un colorante de contraste (safranina) durante treinta segundos.

* Lavar con agua y secar sobre un papel de filtro. (figuras 13, 14 y 15)

Las clulas que retienen el colorante primario se denominan "GRAMPOSITIVAS" (color violeta) y las que se decoloran con el alcohol-acetona y se tien posteriormente con la safranina reciben el nombre de "GRAMNEGATIVAS" (color rojizo).

* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin (punto 4).

Tincin de esporosLas bacterias de algunos gneros forman endosporos que son estructuras muy resistentes a las altas temperaturas, a la falta de humedad y a la accin de productos qumicos. Los endosporos son tambin resistentes a la penetracin de colorantes utilizados en Bacteriologa y por tanto en una extensin teida segn el mtodo de Gram se pueden distinguir como zonas incoloras en el interior de las formas vegetativas de las bacterias Gram positivas. Sin embargo, una vez teidas su decoloracin suele ser difcil.

METODO (Bartolomew y Mittwer)

* Se prepara una extensin en la forma habitual y se fija intensamente al calor para lo cual se pasa unas veinte veces por la llama.

* Se cubre la extensin durante 10 minutos con solucin acuosa saturada de verde ma- laquita, calentando hasta la emisin de vapores.

* Se lava con agua y se aade safranina durante 30 segundos, se lava con agua y se seca con papel de filtro.

* Observar al microscopio con el objetivo de inmersin

Segn este mtodo de tincin, los endosporos se tien en verde, pero el resto de la clula (o la clula que no posee endosporos) se tie de rojo dbil.

Tincin de cpsulasLos mtodos ordinarios de tincin no colorean la cpsula, aunque a veces se puede observar una zona clara rodeando al organismo teido. Para demostrar la presencia de cpsulas se emplea generalmente la tincin negativa con tinta china o nigrosina.

METODO

* Depositar una gota de tinta china o nigrosina sobre un portaobjetos.

* Mezclar con ella una colonia procedente de un medio slido, con ayuda del asa de platino.

* Cubrir con un cubreobjetos, evitando la formacin de burbujas de aire. Presionar con fuerza entre papel de filtro para eliminar los restos de tinta china que puedan enturbiar la observacin.

* Examinar al microscopio con el objetivo de inmersin

Las bacterias con cpsula aparecen rodeadas de una zona clara destacando del fondo gris oscuro. Las bacterias no capsuladas no presentan esta zona clara.

5. Observacin al microscopio con el objetivo de inmersinMETODO

* Depositar en la preparacin una pequea gota de aceite de inmersin. De esta forma se reduce la refraccin de los rayos de luz al pasar del portaobjetos al aire, consiguin- dose que un mayor nmero de ellos penetren en el objetivo (figura 16).

* Colocar el portaobjetos en la platina.

* Elevar el condensador del microscopio al nivel de la platina para lograr el mximo de luz.

* Bajar el objetivo de inmersin hasta que contacte con la gota de aceite y enfocar hasta observar la morfologa del microorganismo.

Rayos no refractados

Aceite de inmersinRayos de luz refractadosAirePreparacin

MORFOLOGIA DE LAS BACTERIASLas bacterias presentan una amplia diversidad de tamaos y de forma muy general pueden aparecer bajo la luz del microscopio ptico o electrnico con morfologa esfrica (cocos), alargada (bacilos), y espiral (espiroquetas).

Los cocos libres aparecen como clulas esfricas aisladas, en pares como DIPLOCO- COS, en cadenas como ESTREPTOCOCOS, o dependiendo de los planos de divisin, en te- tradas o en grupos arracimados.

Los bacilos pueden variar considerablemente en longitud desde los que son muy cor- tos, a veces denominados COCOBACILOS, hasta los bacilos largos que varan en longitud de dos a diez veces su dimetro. Los extremos de los bacilos pueden ser suavemente redondea- dos, o cuadrados. Las largas hileras aisladas se conocen como FILAMENTOS. Los bacilos bacterianos fusiformes, que aparecen en la cavidad bucal e intestinal, son aguzados en ambos extremos.

Los bastones curvos, o ESPIRILOS, varan desde microorganismos pequeos, en forma de coma, o levemente helicoidales con una sola curvatura, o en forma de espiroquetas ms largas y sinuosas.

FIGURA 17: MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS

a-e: cocosa: cocos arracimados b-c: diplococos

d: cocos en cadena e: cocos en ttradas

f: cocobacilosg-i: bacilosg: bacilos aislados

h: bacilos en cadenas

i: bacilos aislados, en empalizada y formando ngulosj-k: espirilos

IDENTIFICACION BACTERIANALos procedimientos para llevar a cabo la identificacin bacteriana van desde los simplemente descriptivos (morfologa y tincin), pasando por las pruebas bioqumicas simples para deteccin de productos metablicos o de una determinada reaccin enzimtica, llegando hasta tcnicas muy sofisticadas como puede ser el clculo del porcentaje G+C en bacterias o el empleo de sondas de ADN.

Un proceso exhaustivo de identificacin bacteriana incluira los siguientes pasos:

1 Caractersticas macroscpicas.

2 Caractersticas microscpicas.

3 Condiciones de crecimiento.

4 Propiedades bioqumicas.

5 Susceptibilidad a los antibiticos.

6 Estructura antignica (serotipia) y fagotipia.

7 Composicin qumica.

8 Produccin de bacteriocinas.

9 Patogenicidad.

10 Composicin del ADN.

Las pruebas bioqumicas nos indican una serie de caractersticas metablicas que, en conjunto, nos permitirn diferenciar unas bacterias de otras). Existe un gran nmero de estas pruebas, por lo que en un problema concreto nos decantaremos por la realizacin de una u otra prueba bioqumica basndonos en:

* Origen de la cepa: de dnde la hemos aislado.

* Condiciones bajo las que ha sido aislada.

* Morfologa.

* Tincin, especialmente la de Gram.

* Posibilidad de formacin de esporos.

* Posibilidad de formacin de cpsula.

Segn los resultados obtenidos de la observacin de estos parmetros, una vez consultada la bibliografa sobre taxonoma bacteriana, el amplio espectro bacteriano, va a quedar restringido a unos pocos gneros, por lo que el siguiente paso ser realizar las pruebas bioqumicas que nos ayuden a quedarnos con uno solo de ellos, y posteriormente llegar a la de- terminacin de especie.

Es muy importante comprender que estas pruebas no han sido elegidas al azar, sino siguiendo una pauta detallada con objeto de escoger aquellas que nos van a llevar a la identificacin de especie lo ms rpidamente posible.Son muchas las pruebas bioqumicas descritas, y es evidente que en cada caso intenta- remos realizar las menos posibles, siempre y cuando stas nos lleven a una completa y segura identificacin.

En la realizacin de pruebas bioqumicas hay que tener en cuenta que no todos los miembros de una determinada especie bacteriana reaccionarn de la misma manera: Se producen variaciones, y esto habr que recordarlo cuando se interpreten los cuadros para identificacin de bacterias. Al comparar los resultados obtenidos con un grupo tabulado de resultados patrn, se debe utilizar el criterio de "aproximacin mxima": si un microorganismo se desva de lo normal en uno o dos resultados de una batera de pruebas segn la tabla patrn, ello no supone que necesariamente haya que descartarlo de esa especie.

Los resultados definidamente positivos (+) o negativos (-) son aquellos en que como mnimo el 90% de las cepas de esa especie reaccionan de esa manera, mientras que los Varia- bles (V) se refieren al hecho de que un 11 a 89% pueden hacerlo en uno u otro sentido, por lo que no debe confiarse en stos para los fines de identificacin.

Las tablas siguientes son un resumen de las que se pueden encontrar en cualquier ma- nual de identificacin bacteriana y que nos servirn para identificar los microorganismos utilizados durante la primera semana de prcticas as como los empleados en el supuesto prctico.

CATALASA +

Ferm. Gluc. +: G. Staphylococcus (Tabla I) Ferm. Gluc. -: G. Micrococcus (Tabla I)

COCOS

CATALASA -

ClNa 6% + : G. Enterococcus (Tabla II)

ClNa 6% - : G. Streptococcus y Lactococcus (Tabla II)CATALASA +

MVILES

Regulares/pequeos: G. Listeria (mvil a 22C, inmvil a 37C) (Tabla VII) Regulares/grandes: G. Bacillus (Tabla V)

BACILOS

INMVILESG. Corynebacterium (Tabla III)

MVILES

G. Clostridium (Tabla VI)CATALASA -

INMVILES

G. Erysipelothrix (Tabla IV)COCOS

NO fermentativos, inmviles: G. Neisseria / Brahamella (Tabla VIII)No fermentativos

OXIDASA+

Bacilos/cido de glucosa: G. Pseudomonas (Tabla IX) Cocobacilos/no cido de glucosa G. Bordetella (Tabla X)OXIDASA G. Acinetobacer (Tabla XI)OXIDASA +Mviles/curvados: F. Vibrionaceae (Tabla XII)

CATALASA+Inmviles/cocobacilos: G. Pasteurella / Mannheimia (Tabla XIII)BACILOS

Fermentativos

G+ L+ Gas+ SH2-

G. EscherichiaG. KlebsiellaG. EnterobacterG. YersiniaOXIDASA (CATALASA +)

F. Enterobacteriaceae (Tabla XIV)

G+ L- GasV SH2-

G. SalmonellaG. ShigellaG. EnterobacterG. YersiniaG+ L- GasV SH2+

G. SalmonellaG. ProteusG. EdwarsiellaG+ L+ Gas+ SH2V+

G. CiterobacterCrecimiento

MacConkeyMetabolismoGneros

BACTERIAS GRAM NEGATIVASCOCOS (cocobacilos)NegativoOxidativo

Cat+/Ox+Neisseria spp.

Branhamella spp.

PositivoOxidativo o no reactivo

Cat.+/Ox-Acinetobacter spp.

BACILOSNegativoOxidativo

Cat+/Ox+Flavobacterium spp.

Fermentativo

Cat+/Ox+Pasteurella spp. (la mayora)

No reactivo

Cat+/Ox+Brucella spp.Haemophilus spp. Pasteurella anatipestifer Taylorella equigenitalis

No reactivo

Cat+/-/Ox+/-Moraxella spp.

Campylobacter spp.

No reactivo

Cat+/Ox-Francisella tularensis

PositivoOxidativo

Cat+/Ox+Pseudomonas spp. (la mayora)

Burkholderia cepacia

Fermentativo

Cat+/Ox+Aeromonas spp.*

Pasteurella heamolytica*

Plesiomonas spp.*

Fermentativo

Cat+/-/Ox+/-Actinobacillus spp.

Fermentativo

Cat+/Ox-Enterobacteriaceae*

Pasteurella caballi

No reactivo

Cat+/Ox+Bordetella spp.*

Alcaligenes spp.*

BACTERIAS GRAS POSITIVASCOCOSOxidativo

Cat+/Ox+/-Micrococcus spp.

Fermentativo

Cat+/Ox-Staphylococcus spp.

Fermentativo

Cat-/Ox-Streptococcus spp.

No reactivo

Cat+/Ox-Rhodococcus equi

BACILOSOxidativo

Cat+/Ox-Nocardia asteroides (algunos)

Bacillus spp.* (algunos)

Fermentativo

Cat+/Ox-Actinomyces viscosusBacillus spp.* (algunos) Corynebacterium spp. Listeria spp.*

Fermentativo

Cat-/Ox-Actynomyces spp.** (la mayora)

Actinomyces pyogenes Erysipelothrix spp. Clostridium spp.**/* Eubacterium spp.** Lactobacillus spp.

No reactivo

Cat+/Ox-Rhodococcus equi

Cat=catalasa; Ox=oxidasa; +: reaccin positiva; -: reaccin negativa; V= variable; *=mvil; **=anaerobioTABLA I. FAMILIA MicrococcaceaeGnero StaphylococcusGnero MicrococcusS. intermedius S. aureus S. simulans S. epidermidis M. luteus M. roseus M. varians Nitratos+++V+- ++ Motilidad - - -

--V+

O/Fglucosa F F F F O O OManitol V + + - + + +

Maltosa - + - + - - V Coagulasa + + - - - - - V.P. - + - V+ - - - DNAsa + + - - - - - Lecitinasa + + + dbil - - - - Ureasa + V+ + + V - +

O: Oxidativo; F: Fermentativo; V+: Mayora de cepas positivas; V: Variable.

TABLA II. Gneros Streptococcus, Enterococcus y LactococcusHemlisis CAMP

HidrlisisEsc. Hipur. Arg.

6,5%V.P.

AcidificacinSal.Raf.Sorb.Lac.Man.Rib.S. agalactiae, ,no +

- + + - +V+

- - V-

- + S. dysgalactiae , no -

- - + - -

-

- - +

- + S. uberis , no - + + + - +

+

-+ +

+ + S. suis

no

+ -ND - -

+

- - +

-ND S. bovis , no - + - - - +

+ + -V+

V - L. garvieae

- + - + - +

+

- - V-V+ + L. piscium

No - +ND - -ND

+ + - +

+ + E. faecalis ,no - + (+) ++ +

+

-+ +

+ + E. faecium , no - + + ++ +

+

- - +(+) + E. hirae No - + - + + + + D - + - +

hemlisis = incompleta; hemlisis = completa; Esc: esculina; Hipur: hipurato; Arg: arginina; V.P. Voges Proskauer; Sal: salicina; Raf: rafinosa; Sorb: sorbitol; Lac: lactosa; Man: manitol; Rib: ribosa; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas;V: Variable.

TABLA III. GENERO CorynebacteriumFermentacinNit.UreasaEsculinaGluc.Sac.Manit.Xyl.Malt.Rib.

C. pseudotuberculosisV+-+---++

C. renale-+-+----+

C. bovis-V--V+-----

C. urealyticum - + - - - - - - -

Nit. = reduccin nitratos; Glu = glucosa; Sac: sacarosa; Manit: manitol; Xyl: xylosa; Malt: maltosa; Rib:ribosa; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas;V: Variable.

TABLA IV. GNERO ErysipelothrixE. inopinataE. rhusiopathiaeE. tonsillarum

Lactosa-+-

RibosaV+-+

Trehalosa+--

Arabinosa - + V+

V+: Mayora de cepas positivas

TABLA V. GNERO BacillusMotilidad-V++++++++V++NitratosV.P. O/F+

+ F+

+ FV

- O+

+ O-

+ O+

+ F+

+ FV

- FV V

F-

+ FV

- O

Lecitanasa++---------

Arabinosa--V++++VV--

Xilosa--V++++VV--

Manitol--V++++VV-V

Crecimiento Anaerobiosis+++--++V+++

O: Oxidativo; F: Fermentativo; V+: Mayora de cepas positivas; V: Variable.

TABLA VI. GNERO ClostridiumC. tetaniC. perfringens

C. botulinum tiposIIIIII

C. difficileC. septicumMotilidad

V

-V+ VV+V+ Indol V-

- - -V-

-

- Lecitinasa

-

+ - - V

-

- Nitratos

-

+ - -

-

-V+ Esculina

-V+ + -

-

+

+ Hemlisis

+

V ++ +

-

+

Morf.esporos RT OS OS OS OS OS OS

RT: Redondos/Terminales; OS: Ovales/Subterminales; V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable.

TABLA VII. GENERO Listeria- Test de CAMPReduccin

Acidificacin de azcaresHemlisis

R. equi S .aureus

Nitratos

D-ManitolL-RamnosaD-XilosaL. monocytogenes + + C L. ivanovii ++ + P L. seeligeri + + cL. innocua - - - - - +/- -

L. welshimeri - - - - - +/- +

L. grayi - - - +/- + -/+ - C: En forma de cerilla. P: En forma de pala. c: En forma de cerilla, dbil.

TABLA VIII. GNEROS Moraxella, Brahamella y NeisseriaMorfologacbcbcbcccCcc

HemlisisV+---+----

MacConkey--V+------

Oxidasa+++++++++

CatalasaV+++++++++

Red. Nitratos-+V+++-+--

Ureasa - - + - - - - - -

C: Cocos. cb: Cocobacilos. V+: Mayora de cepas positivas.

TABLA IX. GNEROS Pseudomonas y BurkholderiaP. aeruginosaP. fluorescensP. putidaB. cepacia

MacConkeycrececrececrececrece

Nitratos+--V-

Citrato++-+

Lecitinasa-+-No relevante

PigmentacinverdeverdeVno

Acidificacin:

Maltosa---+

Glucosa++++

Lactosa---+

Manitol V + - +

V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable.

TABLA X. GNERO BordetellaB. aviumB. bronchisepticaB. parapertussis

Movilidad++-

MacConkey+++

Hemlisis-+

Reduccin nitratos-+-

Ureasa-++

Oxidasa + + -

TABLA XI. GNERO AcinetobacterA. baumanniA. calcoaceticusA. lwolffii

HemlisisCitratocido de glucosa-

+

+-

+

+-

-

-

Crecimiento 41-44 C + - -

TABLA XII. FAMILIA VibrionaceaeGnero VibrioGnero AeromonasGnero Plesiomonas

ClNa 6%+--

Sensibilidad O129V+resistentesensible

V. fluvialisV. vulnificusA. hydrophilaA. salmonicidaP. shigelloides

Motilidad+++-+

Lisina-DC-+V+-+Ornitina-DC-V---+

Sacarosa V+ - + - -

V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas

TABLA XIII. GNEROS Pasteurella y MannheimiaP. multocidaP. pneumotropicaM. haemolytica

MacConkeyIndolUreasaNo crece

+

-No crece

+

+Crece

-

-

ONPGV-++Ornitina-DCV++V--hemlisis--+

Acidificacin:ManitolV+-+Rafinosa-+V+ Lactosa V- V+ V+

V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas

TABLA XIV. FAMILIA EnterobacteriaceaeCitrobacterEnterobacterEscherichiaKlebsiellaSalmonellaProteusYersiniaV-V-V+--V.P. - - V+ V + + - V - - - - - - - V- Citrato + V+ V+ + + + - + - V+ + - V - - V- Urea - - - - - - - + - V+ - - + + + - ADH V - + - V+ + - - - - + - - - - -

Lisina-DC - - - - - - V + - + + + - - - + Ornitina-DC + - + - + + V- - - - + - + - + + Movilidad + + + + + + + - - - + + + + - - Lactosa + V + V- + + + + + + V- ND - - - -

ONPG + + + + + + + + + + + - - - + V V+: Mayora de cepas positivas; V-: Mayora de cepas negativas; V: Variable; ND:No determinado

TIRAS MULTISUSTRATODentro de las tiras multisustrato, el sistema API es un mtodo rpido de identificacin microbiana mediante el empleo de pruebas bioqumicas estandarizadas y miniaturizadas.

Cada tira API consta de un nmero variable de microtubos que contienen los sustratos deshidratados. Existen varios tipos de sistemas API compuestos por diferentes combinaciones de pruebas bioqumicas, con el objeto de identificar correctamente los diversos grupos micro- bianos. Los tipos de sistemas API ms utilizados son:

* API 20 E. Identificacin de Enterobactiaceae y otros Gram negativos.

* API 20 A. Identificacin de bacterias anaerobias.

* API Strep. Identificacin de Streptococcus.

* API Staph. Identificacin de Staphylococcus.

* API 50 CH. Estudio del metabolismo de hidratos de car-bono.

* API Z. Deteccin de Salmonella, Shigella y Yersinia.

* API S. Deteccin de enterobacterias.

* API 20 EC. Deteccin de enterobacterias coliformes.

* API 20 NE. Identificacin de Gram negativos no enterobacterias.

* API 20 C AUX. Identificacin de levaduras.

* API 20 B. Deteccin de bacterias hetertrofas anaerobias.

* API ZYM. Estudio de actividades enzimticas.

* API 10 M 5 FC. Deteccin de levaduras.

Los componentes del sistema API son:

* Tira o galera con pruebas bioqumicas.

* Cmara de incubacin.

* Medio de suspensin. Unicamente se provee en los casos en que se requiere un medio especial, en el resto la suspensin se realiza en solucin salina estril.* Hoja de resultados.

Deben conservarse en refrigeracin (2-8C) y utilizarse antes de la fecha de caducidad indicada en el envase.

Modo de empleo1. Preparacin de la cmara de incubacin. Se aade agua (unos 5 ml) en los alveolos de la base de la cmara, con el fin de proporcionar una atmsfera hmeda.

2. Preparacin del inculo. Tomar colonias del microorganismo a analizar y diluirlas homogneamente en un medio de suspensin mediante agitacin.

3. Inoculacin de la tira. Se utilizarn micropipetas o puntas de pipeta estriles. Deben llenarse los microtubos de cada prueba bioqumica, evitando la formacin de burbujas. En caso de que el nombre abreviado de la prueba aparezca rodeado por tres barras (p.ej. |CIT ), tambin debe llenarse la cpula del microtubo, y si aparece subrayado (p.ej. ADH), la cpula debe completarse con aceite de parafina o de vaselina estril.

4. Incubacin. Introducir la tira en la cmara de incubacin. La temperatura y condiciones de aerobiosis o anaerobiosis dependern del anlisis. El tiempo normal de incubacin es de 18-24 horas, en caso de que las reacciones sean dudosas debe reincubarse durante otras 24 horas.

5. Lectura de resultados. Se aadirn reactivos en las pruebas que necesiten revelado. Se anotarn en la hoja de resultados las pruebas positivas y negativas (en las hojas hay algunas pruebas que deben hacerse aparte, p.ej. catalasa, motilidad, oxidasa, crecimiento en agar McConkey, etc., que tambin deben anotarse).

6. Identificacin. Mediante el empleo del programa de ordenador Apilab Software. Tam- bin pueden utilizarse tablas y manuales especficos para sistemas API.

ANTIBIOGRAMAPodemos definir en lneas generales como agentes antimicrobianos a aquellas sustancias que inhiben el crecimiento de los microorganismos o producen suinactivacin. Por lo tan- to, y dependiendo de la accin que dichos agentes ejercen sobre los microorganismos, podemos dividirlos en:

* Agentes microbiostticos: son aquellos en los que la inhibicin del crecimiento que producen desaparece cuando dejan de actuar sobre el microorganismo.

* Agentes microbicidas: son aquellos que producen una accin letal irreversible sobre los microorganismos.

Dependiendo de su naturaleza y procedencia, las sustancias antimicrobianas pueden ser productos qumicos de sntesis o bien productos naturales producidos por microorganismos u otros organismos vivos. A estos ltimos se les considera Antibiticos si bien algunos de ellos, que fueron primero descubiertos en la naturaleza, se obtienen en la actualidad sinttica o semisintticamente, de una forma ms sencilla y barata. Entre las sustancias antimicrobianas qumicas de sntesis se ha englobado dentro del concepto de Quimioterpico a aquellas que pueden interferir directamente en la proliferacin de los microorganismos a concentraciones toleradas por el husped. Por lo tanto, al ser sustancias que poseen una toxicidad selectiva, pueden utilizarse teraputicamente (de ah su nombre) para inhibir a un determinado microorganismo sin ocasionar lesiones importantes en el hospedador.

Esta serie de propiedades (toxicidad selectiva, especificidad y extremada actividad) justifican la aplicacin de este tipo de sustancias en la clnica cuando las defensas corporales no bastan para que el individuo supere la enfermedad. De esta manera, el individuo puede re- cuperarse sin consecuencias graves, permitiendo la destruccin o eliminacin del agente etiolgico sin excesivos riesgos (o por lo menos menores que los producidos por la infeccin) en el hospedador.

La resistencia bacteriana a quimioterpicos y antibiticos tom su verdadera importancia cuando se comprob la posibilidad de su adquisicin por mecanismos de transforma- cin, conjugacin y transduccin. De esta manera se obtiene la resistencia a gran cantidad de antibiticos y quimioterpicos al contactar cepas patgenas con cepas saprofitas que, al ser huspedes habituales del hombre y los animales, estn continuamente expuestas a gran cantidad de estas sustancias. El suministro de estos agentes antimicrobianos a los animales y hombre provoca la seleccin (que no el acostumbramiento) de los mutantes resistentes a estas sustancias. Si esta resistencia es extracromosmica, puede ser transferida a otros microorganismos menos frecuentes y ms patgenos.

VALORACION DE SUSTANCIAS ANTIMICROBIANAS: ANTIBIOGRAMALa accin de los agentes antimicrobianos debe estudiarse sobre cultivos "in vitro" del agente en cuestin. Con los datos obtenidos puede planificarse la posible utilidad teraputica del producto ensayado.

Entre estos datos puede ser interesante conocer los tipos de microorganismos sobre los que acta un antibacteriano (espectro antimicrobiano), las concentraciones necesarias para inhibir el crecimiento de un microorganismo (sensibilidad), el efecto de las condiciones am- bientales sobre la sensibilidad (pH, temperatura, etc.), si posee accin microbicida o micro- biosttica, etc.

Uno de los datos que ms se maneja a nivel clnico y que ms trascendencia tiene es el de la sensibilidad; para calcularla se enfrentan los microorganismos problema a diversas concentraciones de sustancias antibiticas o quimioterpicas. Mediante este sistema definimos la Concentracin Mnima Inhibitoria (CMI) que es la menor concentracin de una sustancia que es capaz de inhibir el crecimiento visible de un microorganismo.

La realizacin de esta tcnica es lo que se conoce como antibiograma, permitiendo el conocimiento de la CMI y la posible aplicacin teraputica, para cada caso clnico en particular, de la sustancia adecuada a la dosis correcta.

Para la realizacin del antibiograma se pueden utilizar varias tcnicas, siendo la ms difundida y sencilla el Tcnica de Difusin en Agar, que a continuacin se detalla.

ANTIBIOGRAMA POR TECNICA DE DIFUSION EN AGAREsta prueba consiste en enfrentar a un microorganismo a diversas sustancias antimicrobianas a una concentracin determinada para establecer la sensibilidad o resistencia de di- cho microorganismo a las mismas. Hay que sealar que el antibiograma se debe realizar con un solo tipo de microorganismo cada vez, es decir, con un microorganismo en cultivo puro, no debindose utilizar una poblacin mixta de microorganismos para realizar el antibiograma. Por tanto, debern realizarse tantos antibiogramas como microorganismos significativos en- contremos en la muestra clnica.

* Medio de cultivo: el medio que se utiliza es el Mueller-Hinton. Las placas se secan

30 minutos a 37C antes de su empleo.

* Inculo: la cepa que se estudia se cultiva durante 24 horas en medio de cultivo slido, normalmente a la temperatura de 37C; posteriormente se realiza una suspensin en solucin salina estril, de manera que obtengamos aproximadamente una concentracin de 106 de

bacterias/ml.

* Discos de antibiticos. Tcnica:

1. Siembra: se realiza una siembra por inundacin, utilizando 3-5 ml de la dilucin preparada. Se deja reposar 5 minutos. Posteriormente se elimina el sobrenadante inclinado la placa en varias direcciones, para dejar secar la placa durante 10 minutos a 37C en posicin invertida.

2. Aplicacin de los discos antibiticos: los discos se ponen a unos 15 mm de la peri- feria de la placa con ayuda del aplicador, apretando ligeramente los discos que no hayan en- trado totalmente en contacto con el medio usando para tal fin el asa de platino esterilizada a la llama. Se pueden colocar aproximadamente 6 discos por placa, teniendo en cuenta que las zonas de inhibicin de los diferentes discos no deben entrecruzarse para que se puedan efectuar la lectura de los dimetros de los halos de inhibicin en varias direcciones.

3. A continuacin se dejan secar las placas de 15 a 30 minutos a temperatura ambiente para que se sequen por completo.

4. Incubacin de las placas a 37C durante 18-24 horas.

Tras este periodo se observar el crecimiento bacteriano y los halos de inhibicin, si los hubiera.

* Lectura de la zona de inhibicin: se mide el dimetro (en milmetros) de la zona de inhibicin con una regla o comps (Figura 18). Cuando el borde no es neto, la lectura se realiza en la zona que corresponda aproximadamente al 80% de inhibicin. Ciertos antibiticos producen a veces extensas colonias perifricas que no hay que tener en cuenta en la medicin del dimetro si stas son escasas.

* Interpretacin del antibiograma: se comparan los dimetros de los halos de inhibicin producidos por cada uno de los antibiticos utilizados con los que se detallan en la Tabla

1 adjunta. En esta tabla se relacionan las zonas de inhibicin con la potencia de los discos y la sensibilidad bacteriana, por lo que debemos asegurarnos que la potencia de los discos que re- fleja la tabla coincide con la usada por nosotros.

Para el uso clnico se han clasificado las bacterias en tres grandes grupos, segn su sensibilidad antibitica:

- Cepa sensible: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento a la dosis habituales por va general.

- Cepa intermedia: es aquella que puede ser afectada por un tratamiento local, mediante un aumento de las dosis por va general, o por una concentracin fi- siolgica particular (orina, bilis, etc.).

- Cepa resistente: es aquella que probablemente no ser afectada con las dosis habituales, sea cual sea el tipo de tratamiento.

CONSEJOS PARA LA REALIZACION DE UN ANTIBIOGRAMA1. No se debe realizar el antibiograma sobre una poblacin mixta de microorganismos, debindose proceder previamente al aislamiento y cultivo en pureza de los distintos microorganismos encontrados en la muestra clnica, para, posteriormente, realizar un antibiograma para cada uno de los distintos tipos de microorganismos de significacin clnica halla- dos.

2. No deben incluirse un nmero muy elevado de antibiticos.

3. Hay que realizar las siguientes consideraciones:

3.a. Se debe limitar el estudio de la sensibilidad a los antibiticos a aquellos que presumiblemente sean activos sobre el microorganismo implicado en el proceso infeccioso. Ha de tenerse en cuenta que, a pesar de que el espectro antibacteriano es el mismo para una misma familia de antibiticos, los fenmenos de resistencia no son siempre extrapolables a todos los miembros de dicha familia.

tratar.

3.b. Se deben tener en cuenta las contraindicaciones de la especie animal aTABLA 1:CRITERIOS PARA ESTABLECER CATEGORAS EN ANTIBIOGRAMAS

AntimicrobianoDiscoDimetro (Interpretacin) SIRAplicable en:Referencia

cido NalidxicoNA 30g 1914 18 13EnterobacteriasNCCLS 2002(V)

cido OxolinicoOA 2g 11 10

AmpicilinaAM 10g 1714 16 13

29- 28

17- 16

2619 25 18Enterobacterias

Estafilococos

Enterococos

Estreptococos (salvo S. pneumoniae)NCCLS 2002(V)

AmoxicilinaAMX 25g 21 14SFM 2001

Amoxicilina+claAMC 30g 20 19

1814 17 13Estafilococos

Otros organismosNCCLS 2002(V)

AmikacinaAN 30g 1715 16 14NCCLS 2002(V)

ApramicinaAPR 40g 14 13VAV

AztreonamATM 30g 2216 21 15EnterobacteriasNCCLS 2002(H)

CeftazidimaCAZ 30g 1815 17 14EnterobacteriasNCCLS 2002(H)

CeftiofurEFT 30g 2118 20 17Actinobacillus pleuropneumoniaePasteurella multocidaSalmonella entericaNCCLS 2002(V)

CefotaximaCTX 30g 2315 22 14EnterobacteriasNCCLS 2002(H)

CefoxitinaFOX 30g 1815 17 14EnterobacteriasNCCLS 2002(H)

CiprofloxacinaCip 5 g 2116 20 15EnterobacteriasNCCLS 2002(H)

CloranfenicolC 30g 1813 17 12

2118 20 17Salvo Estreptococos

Estreptococos (no S. pneumoniae)NCCLS 2002(V)

ColistinaCL 50g 15< 15SFM 2001

DoxiciclinaD 30g 1613 15 12Estafilococos, Enterobacterias y

PseudomonasNCCLS 2000(H)

EnrofloxacinaENR 5g 2317 22 16

2117 20 16P. multocida, E. coli (Aves)

Mannheimia haemolytica, P. multocida y

H. somnus (bovino)NCCLS 2002(V)

EritromicinaE 15g 2314 22 13

2116 20 15Salvo Estreptococos

EstreptococosNCCLS 2002(V)

EstreptomicinaS 10g 1512 14 11EnterobacteriasNCCLS 2002(H)

EspectinomicinaSPC 100g 1411 13 10M. haemolytica, P. multocida y

H. somnus (bovino)NCCLS 2002(V)

FlorfenicolFFC 30g 1915 18 14M. haemolytica, P. multocida y

H. somnus (Bovino)NCCLS 2002(V)

FlumequinaAR 30g 1914 18 13

GentamicinaGM 10g 1513 14 12NCCLS 2002(V)

ImipenemIMP 10g 1614 15 13NCCLS 2002(V)

KanamicinaK 30g 1814 17 13NCCLS 2002(V)

LincomicinaL 15g 21< 17SFM 2001

MarbofloxacinaMAR 5g 1815 17 14ROSCO

MarbofloxacinaMAR 5g 1815 17 14VTOQUINOL

NeomicinaN 30g 1713 16 12LIOFILCHEM

PenicilinaP 10g 29- 28

15- 14

2820 - 27 19Estafilococos

Enterococos

Estreptococos (salvo S. pneumoniae)NCCLS 1999(V)

Sulfafurazol (sul-

famidas)SF 300g 1713 16 12NCCLS 2002(V)

TetraciclinaTE 30g 1915 18 14

2319 22 18Otros salvo Estreptococos

EstreptococosNCCLS 2002(V)

TiamulinaT 30g 20 16LIOFILCHEM

TilmicosinaTIL 15g 1411 13 10

11 10M. haemolytica (Bovino)

P. multocida, A. Pleuropneumoniae (Por- cino)NCCLS 2002(V)

TilosinaTY 30g 20 16LIOFILCHEM

TrimetoprimTM 30g 1611 15 10Enterobacterias , EstafilococosNCCLS 2002(H)

PRCTICA DE VIROLOGAINTRODUCCINLos virus son agentes infecciosos extraordinariamente pequeos compuestos por pro- tena y un nico tipo de cido nucleico, ARN o ADN pero no ambos. Aquellos que tienen en- voltura, adems poseen lpidos y, en algunas ocasiones, las protenas ms superficiales poseen grupos azcares (glucoprotenas).

Dada su extrema simplicidad estructural, los virus son incapaces de llevar una vida in- dependiente y necesitan parasitar clulas que les van a aportar aquellos materiales de los que carecen y van a permitir su replicacin. Por lo tanto, en el ciclo de vida de los virus se puede hablar de dos fases:

a) fase extracelular, en la que actan como partculas inertes sin actividad metablica alguna, simplemente para pasar de clula a clula;

b) fase intracelular, en la cual desarrollan su ciclo de vida, y de la cual se deriva su efecto patognico.

Algunos virus pueden prescindir de la fase extracelular porque son captados por otra clula no infectada segn geman o emergen, o porque aprovechan que la clula se est divi- diendo para transmitirse a las clulas hijas. Pero ningn virus puede prescindir de fase intracelular. Por este motivo, el estudio de los virus siempre requiere el uso de clulas vivas. Afortunadamente, en la actualidad se dispone de lneas celulares continuas: clulas que se multiplican en un medio adecuado en frascos de cultivo en el laboratorio y que cuando hay muchas se prescinde de parte de ellas para que las que permanecen puedan seguirse multipli- cando, y as bsicamente de una forma indefinida.

Las clulas as mantenidas son muy susceptibles a alteraciones accidentales tales como contaminaciones, variaciones de temperatura, de pH, de presin de oxgeno, etc. Han de ser cultivadas en unos ambientes muy restringidos, manteniendo las condiciones lo ms cons- tantes posible. Por este motivo, el acceso a la sala de cultivos debe ser restringido y no es aconsejable incluir en las prcticas el manejo de las clulas, bien infectadas o bien sin infectar por virus.

Los virus son demasiado pequeos para ser observados con el microscopio ptico. Sin embargo, al desarrollar su ciclo de replicacin utilizan productos celulares y alteran la vida de la clula, y en muchas ocasiones esto s que se puede observar con el microscopio ptico. Como se indic ms arriba, ste es el llamado efecto citoptico. Los posibles efectos citopticos son numerosos. Entre ellos se cuentan la aparicin de sincitios, la lisis celular, el desa- rrollo de cordones, la vacuolizacin, la aparicin de clulas gigantes, etc. Al final de la des- cripcin de esta prctica hay algunas fotos demostrativas. En la WebCT de la Microbiologa, en Laboratorio Virtual de Microbiologa Veterinaria, en la parte destinada a Laboratorio de Virologa hay imgenes de efectos citopticos y cmo se van desarrollando.

OBJETIVOEl objetivo de esta prctica es hallar la cantidad de virus presente en una muestra de origen infeccioso. Para ello, realizaremos una titulacin, a fin de determinar la Dosis Infectiva en Cultivo Tisular 50 (TCID50), o cantidad de muestra que produce efecto citoptico en 50%

de los cultivos. Los clculos son muy similares a los que se realizan para determinar cualquier otra dosis infectiva, letal, etc 50.

DESARROLLOTodo el proceso debe realizarse en condiciones de la mxima esterilidad. Se dis- pondr de una placa de 96 pocillos en la que se van a hacer dos titulaciones. Las placas son muy parecidas a las de ELISA pero estn tratadas para que las clulas se adhieran a las mismas. A diferencia de las bacterias, los virus no crecen bien en cualquier clula y son muy especficos. En el laboratorio generalmente hay que disponer de una veintena o ms de lneas celulares para garantizar que un virus procedente de un aislamiento concreto puede crecer en alguna de ellas. Sin embargo, en estas prcticas se va a titular un virus que sabemos que crece sobre la lnea celular CRFK, fibroblastos de rin felino. Para la titulacin, haremos diluciones del virus que iremos aadiendo a los pocillos. Transcurridas 24 h veremos el efecto citoptico.

Protocolo de la prcticaEn la placa, en cada uno de los 96 pocillos hay alrededor de 20.000 clulas en 100 l en un medio de cultivo especfico para cultivos titulares. Cada placa ser empleada para dos titulaciones, aadiendo 100 l de cada dilucin del virus a cuatro pocillos diferentes.

1. Realizar diluciones de la muestra de virus en base cinco.

Preparar una batera de tubos Eppendorf estriles, hasta un total de 10 tubos. Aadir 800 l de medio de cultivo (RPMI con suero fetal bovino y antibiticos, para evitar en la medida de lo posible el crecimiento de bacterias) a cada uno.

Tomar con una micropipeta 200 l de muestra de virus, y transferirlos al primer Eppendorf. En este tubo, el virus habr quedado diluido 1:5.

Mezclar concienzudamente, y transferir 200 l del tubo 1:5 al siguiente tubo, quedando el virus diluido 1:25.

Repetir el paso 5 hasta el final, partiendo siempre del ltimo tubo en donde se ha realizado la dilucin.

2. Una vez estn todas las diluciones hechas, pasar 100 l de cada dilucin a cuatro pocillos distintos. La dilucin final del virus en cada pocillo ser la mitad que la inicial, ya que en el volumen final, tan slo la mitad corresponde a la dilucin del virus.

3. No aadir dilucin de virus a las dos ltimas columnas, para considerarlas controles.

En estos pocillos, las clulas tienen que crecer perfectamente.

4. Incubar a 37C durante 24 horas en atmsfera con 5% de CO2 y humedad.

Al da siguiente se procede a observar el resultado. A partir de aqu ya no es necesario mantener las condiciones de esterilidad.

1. Eliminar el medio de cultivo por absorcin con una pipeta multicanal.

2. Fijar las clulas con metanol, aadiendo 100 l a cada pocillo con la pipeta multicanal y dejndolo actuar durante 5-10 minutos.

3. Eliminar el metanol y lavar con el agua del grifo dejndola caer en los pocillo con mu- cho cuidado para que no se desprendan las clulas.

4. Aadir 100 l de solucin Giemsa, y dejndolo actuar durante 30 minutos. Si el colorante no est preparado, diluir 1 gota de la solucin madre en 1 ml de agua.

5. Eliminar la solucin de Giemsa y lavar con cuidado con el agua del grifo.

6. Observar al microscopio.

7. Anotar en un papel los pocillos en los que hay efecto citoptico (aquellos en los que las clulas pegadas al pocillo son menos de la mitad que en los controles).

RESULTADOSPara evaluar los resultados y dar un ttulo hay que aplicar una frmula estadstica. Aqu se muestra el mtodo de Karber.

TCID50 = - -(S-0.5)

= log10 de la ltima dilucin con 100% de cultivos positivos (con efecto citoptico)

= log10 del factor de dilucin log10 10 = 1

log10 5 = 0,7 log10 3 = 0,5 log10 2 = 0,3

S = suma de la fraccin de pocillos con efecto citoptico en cada dilucin, desde la dilucin en la que el 100% lo muestra. Este ltimo caso tiene un valor de 1 y todos los dems sern una fraccin de 1.

En el ejemplo de la pgina anterior

= -2,4 (log10 de 1:250, ltima dilucin con el 100% de efecto citoptico).

= 0,7 (diluciones en base 5) S = la suma de

Dilucin 1:250 = 4/4 = 1

Dilucin 1:1250 = 3/4 = 0,75

Dilucin 1:6.250 = 1/4 = 0,25

Dilucin 1:16.250 =0/0= 0 Suma =2,00

Sustituyendo los valores en la ecuacin:

TCID50 = - 2,4 (0,7 x (2-0,5)) = -2,4 (0,7 x 1,5) = - 2,4 1,05 = -3,4539Tubo- Columna Dilucin en el Ep- pendorf

12345678910(11)(12)

1:51:251:1251:6251:31251:15.6251:78.1251:390.6251:1.953.1251:9.765.625ContrContr

RPMI800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l 800l

Virus200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200l 200lDilucin final en pocillo

1:101:501:2501:12501:6.2501:16.2501:156.2501:781.2501:3.906.2501:19.531.25000

Ejemplo

Algunos ejemplos de efecto citopticoa) Efecto citoptico inexistenteb) Lisis, calvas o placas

c) Efecto citoptico: leucemiad) Efecto citoptico: sincitios

PRACTICA DE MICOLOGIAObjetivos:En esta prctica el alumno debe cubrir los siguientes objetivos:

Conocimiento de las tcnicas bsicas utilizadas en el laboratorio de Micologa.

Reconocimiento de las distintas estructuras que tienen los hongos cuando se desarrollan sobre medios de cultivo.

Conocer las caractersticas morfolgicas (macro y microscpicas) de los distintos grupos taxonmicos de inters veterinario.

Aprender a utilizar las claves dicotmicas bsicas de identificacin de hongos.

Teora:1. Medios de cultivo: no difieren en principio de las normas generales expuestas al hablar de bacterias. Los aspectos diferenciales que podemos destacar son los siguientes:

Se utilizan medios selectivos con los siguientes objetivos:

a) Inhibir el crecimiento de bacterias. Para ello se han empleado dos estrategias bsicas:

** Medios con pH cido (4. Esporas asexuales se forman en el interior de receptculos cerrados (esporangios)

HONGOS CENOCITICOS Div. Zygomycota

2.b -Hifas septadas. Dimetro de la hifa variable normalmente

ppractica de microbiologia

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